基于CaCC的TRPV4調節(jié)劑高通量篩選細胞模型的建立

肖云萍，解宇浩，張嘉琪，洪啟元，郝峰*，王國慶

1吉林醫(yī)藥學院檢驗學院，吉林省吉林市 132013；2北華大學醫(yī)學技術學院，吉林省吉林市 132013；3吉林醫(yī)藥學院公共衛(wèi)生學院，吉林省吉林市 132013

瞬時受體電位離子通道(transient receptor potential，TRP)是一種在生物體內分布廣泛的非電壓依賴的非選擇性陽離子通道。TR P家族分為7個亞族：TRPA、TRPC、TRPM、TRPML、TRPN、TRPP及TRPV[1]。瞬時受體電位香草酸亞型4(transient receptor potential vanilloid 4，TRPV4)是TRPV亞家族的成員，廣泛分布于心臟、大腦、腎臟、肺臟、肝臟、骨組織及皮膚等[2]，參與許多生理、病理過程，可能是多種疾病的潛在治療靶點。TRPV4調節(jié)劑在許多生理和病理過程中起著重要作用，如TRPV4激活劑可以減少動脈粥樣硬化斑塊的形成，促進成年海馬齒回神經干細胞的增殖，以及促進血管和動脈的生成[3-5]；TRPV4拮抗劑可治療水腫、疼痛、胃腸道疾病和肺部疾病，如咳嗽、支氣管收縮、肺動脈高壓和急性肺損傷等[6]。然而，大多數TRPV4的激活劑和抑制劑存在選擇性不強、效力不佳等問題。因此，篩選TRPV4特異性調節(jié)劑具有重要意義。TRPV4對Ca2+具有選擇通透性，其激活會引起Ca2+內流，從而增加細胞內游離Ca2+的濃度[7]。鈣激活氯離子通道蛋白1(anoctamin 1， ANO1)是鈣激活氯離子通道(calcium-activated chloride channels，CaCC)的分子基礎之一，在細胞內Ca2+濃度升高的作用下開放并向細胞內轉運Cl-、I-等陰離子[7]。YFP-H148Q/I152L是遇I-會發(fā)生熒光淬滅的黃色熒光蛋白雙突變體[8]。因此，本研究利用穩(wěn)定共轉染ANO1和YFP-H148Q/I152L的Fischer大鼠甲狀腺濾泡上皮(Fischer rat thyroid，FRT)細胞系構建基于CaCC靶向TRPV4的細胞篩選模型。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑及儀器 FRT細胞為本實驗室保存；ANO1真核表達載體和YFP-H148Q/I152L真核表達載體由本實驗室前期構建[9-10]。Lipofectamine 3000脂質體、Zeocin抗生素、G418抗生素、TRIzol試劑盒(美國Invitrogen公司)；兔抗大鼠TRPV4多克隆抗體、兔抗大鼠β-actin單克隆抗體、山羊抗兔IgG(英國Abcam公司)；RT-PCR試劑盒、全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白測定試劑盒、質粒提取試劑盒(北京全式金生物技術有限公司)；ECL檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；F-12基本培養(yǎng)基、Eact、NFA、GSK1016790A、4α-PDD、 RN-1747、GSK2193874、HC-067047、RN-1734、Fura-2/AM(美國Sigma公司)；胎牛血清(以色列Biological Industries公司)；PCR引物、切膠回收試劑盒(生工生物工程股份有限公司)。倒置熒光顯微鏡(日本Nikon公司)；PCR儀(美國ABI公司)；FLUOstar多功能酶標儀(德國BMG公司)；CO2培養(yǎng)箱(日本Panasonic公司)；凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)；Nanodrop 2000微量分光光度計(美國Thermo Fisher公司)。

1.2 RT-PCR檢測FRT細胞中TRPV4 mRNA的表達 取生長狀態(tài)良好的FRT細胞株，按照TRIzol試劑盒說明書提取總RNA，應用Nanodrop 2000檢測總RNA的濃度，測定RNA溶液A260/A280的比值范圍。對提取的RNA進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測總RNA的完整性。

本研究設計合成了8對特異性引物：TRPV1～ TRPV6和β-actin，其中TRPV4設計了2對引物：TRPV4-1和TRPV4-2。TRPV4-1、TRPV4-2及管家基因β-actin的引物序列如表1所示。按照2×EasyTaq PCR SuperMix試劑盒說明書進行PCR擴增，將所得PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠成像儀曝光成像。將目的條帶切下，采用切膠回收試劑盒對目的條帶進行切膠回收，回收后的DNA溶液進行核酸測序。

1.3 Western blotting檢測FRT細胞中TRPV4蛋白的表達 取生長狀態(tài)良好的FRT細胞，經RIPA裂解液裂解，提取總蛋白。采用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，轉膜、封閉后分別孵育兔抗大鼠TRPV4多克隆抗體(1:2000)、兔抗大鼠β-actin單克隆抗體(作為內參)，4 ℃下孵育過夜。次日，PBST洗膜，室溫孵育HRP標記的山羊抗兔IgG(1:500)2h，PBST洗膜，采用ECL化學發(fā)光法顯色，暗室顯影技術采集化學發(fā)光圖像。

表1 TRPV4-1、TRPV4-2及β-actin引物序列Tab.1 Primer sequence of TRPV4-1, TRPV4-2 and β-actin

1.4 構建共表達ANO1和YFP-H148Q/I152L的FRT細胞模型

1.4.1 最適抗生素濃度的選擇 取生長狀態(tài)良好的FRT細胞，分別加入濃度為1500、1000、800、600、400、200、100 μg/ml的Zeocin抗生素，培養(yǎng)2周后細胞全部死亡的最低濃度為Zeocin抗生素篩選的最適濃度。同理篩選G418抗生素的最適濃度。

1.4.2 脂質體轉染法構建共表達ANO1和YFPH148Q/I152L的細胞株 取生長狀態(tài)良好的FRT細胞，按照Lipofectamine 3000說明書步驟將ANO1轉染到FRT細胞中，2 d后于倒置熒光顯微鏡下觀察。利用最適濃度的Zeocin抗生素進行篩選，3周后挑取倒置熒光顯微鏡下可見細胞膜上表達綠色熒光的細胞進行有限稀釋。經過多次有限稀釋得到穩(wěn)定轉染ANO1的單克隆細胞并進行擴大培養(yǎng)，獲得表達ANO1的FRT細胞株。同理，將YFP-H148Q/I152L轉染到已穩(wěn)定表達ANO1的FRT細胞中，應用最適濃度的G418抗生素進行篩選，挑取倒置熒光顯微鏡下細胞膜上和細胞質中均可見綠色熒光的單細胞克隆團，擴大培養(yǎng)后獲得共表達ANO1和YFP-H148Q/I152L的FRT細胞株。

1.5 熒光淬滅動力學實驗驗證FRT細胞模型的有效性及功能

1.5.1 有效性驗證 取生長狀態(tài)良好的共表達ANO1和YFP-H148Q/I152L的FRT細胞，分為實驗組和對照組，每組3個復孔。實驗組加入120 μl含有ANO1特異性激活劑Eact(10 μmol/L)及高濃度碘離子的PBS溶液，對照組加入鈣激活氯離子通道抑制劑NFA(300 μmol/L)孵育10 min，再加入120 μl含高濃度碘離子的PBS溶液，采用FLUOstar多功能酶標儀(發(fā)射波長540 nm，激發(fā)波長500 nm)檢測相對熒光強度(RFU)的動態(tài)變化。以5個點/s的速度動態(tài)檢測RFU，其中前2 s為基線，2 s后以200 μl/s的速度向實驗組孔中加入120 μl含有Eact及高濃度碘離子的PBS溶液，向對照組孔中加入120 μl含高濃度碘離子的PBS溶液。

1.5.2 功能驗證 將生長狀態(tài)良好的共表達ANO1和YFP-H148Q/I152L的FRT細胞分為4組，每組3個復孔。其中3組加入含TRPV4激活劑GSK1016790A、4α-PDD、RN-1747及高濃度碘離子的PBS溶液，另外1組加入含TRPV4抑制劑HC-067047孵育10 min，再加入含高濃度碘離子的PBS溶液，采用FLUOstar多功能酶標儀檢測RFU的動態(tài)變化，利用Excel軟件對原始數據進行宏計算，得到斜率(Slope)值。

將生長狀態(tài)良好的共表達ANO1和YFP-H148Q/I152L的FRT細胞分為6組，采用倍比稀釋法獲得不同濃度的激活劑和抑制劑。其中3組分別加入不同濃度的TRPV4激活劑GSK1016790A、4α-PDD、RN-1747，采用多功能酶標儀進行檢測，加入含高濃度碘離子的PBS溶液，記錄RFU的動態(tài)變化，計算Slope值。另外3組加入不同濃度的TRPV4抑制劑GSK2193874、HC-067047、RN-1734孵育10 min，采用多功能酶標儀進行檢測，加入含有GSK1016790A及高濃度碘離子的PBS溶液，記錄RFU的動態(tài)變化，計算Slope值。

1.6 Fura-2熒光探針法檢測FRT細胞模型中Ca2+的濃度 將穩(wěn)定共表達ANO1和YFP-H148Q/I152L的FRT細胞制成細胞懸液，加入Fura-2/AM，終濃度為5 μmol/L，37 ℃下孵育30 min。洗滌細胞，離心后制成細胞懸液。采用FLUOstar多功能酶標儀(激發(fā)波長為340 nm和380 nm，發(fā)射波長510 nm)檢測，記錄靜息時和加入不同濃度GSK1016790A后340 nm/380 nm的熒光比值。加入Triton X-100及EGTA，測定最大熒光比值和最小熒光比值，計算Ca2+濃度。

1.7 FRT細胞模型的Z'因子評估 Z'因子是評估高通量篩選的一種重要指標，計算公式如下：Z'=1－3×(|SDpositive|+|SDnegtive|)/(|Meanpositive|－|Meannegative|)[11]。將96孔板中的6列加入10 μmol/L GSK1016790A作為陽性對照(positive)，另外6列加入PBS溶液作為陰性對照(negative)，檢測96孔板的Z'因子值。

1.8 統(tǒng)計學處理 采用GraphPad Prism 8.0軟件對激活劑和抑制劑的劑量依賴關系進行非線性曲線擬合分析，繪制模型對不同激活劑和抑制劑的濃度依賴曲線，并計算半數有效濃度(EC50)、半數抑制濃度(IC50)，統(tǒng)計分析采用單因素方差分析和Mann-Whitney檢驗，所有實驗均重復3次。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 FRT細胞中TRPV4 mRNA的表達情況 FRT細胞總RNA濃度為413.2 ng/μl，總RNA溶液的A260/A280為1.83。瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，總RNA完整性良好，可用于進一步cDNA的合成(圖1A)。RT-PCR檢測結果顯示，TRPV4-1、TRPV4-2和β-actin分別在395 bp、455 bp和260 bp處出現特異性條帶，與預期的目的產物大小一致(圖1B)。TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV5、TRPV6特異性引物均未擴增出 條帶。

將TRPV4條帶的切膠回收產物送生工生物工程股份有限公司測序，測序結果在Chromas軟件上進行分析，峰圖結果如圖1C所示，無重疊峰，其中豎線位置為內含子。所測核苷酸序列采用美國生物技術信息中心(national center for biotechnology informatio，NCBI)的序列比對工具(basic local alignment search tool，BLAST)進行比對，結果顯示其與GenBank數據庫收錄的TRPV4基因序列相似性為100%，表明所克隆的DNA片段即為目的基因片段，FRT細胞在mRNA水平上內源性表達TRPV4 (圖1D)。

圖1 FRT細胞中TRPV4 mRNA的表達情況Fig.1 Expression of TRPV4 mRNA in FRT cells

2.2 FRT細胞中TRPV4蛋白的表達情況 Western blotting檢測結果顯示，FRT細胞中有相對分子量為98 kD的TRPV4蛋白的表達(圖2)，表明FRT細胞在蛋白水平上內源性表達TRPV4蛋白。

2.3 共表達ANO1和YFP-H148Q/I152L的FRT細胞模型構建原理及結果 當TRPV4通道被激活時，Ca2+內流增加細胞內Ca2+濃度，從而引起CaCC的開放，細胞外I-被轉運到細胞質內，使黃色熒光蛋白YFP-H148Q/I152L發(fā)生熒光淬滅，測定原理如圖3所示。

圖2 FRT細胞中TRPV4蛋白的表達情況(Western blotting)Fig. 2 Expression of TRPV4 protein in FRT cells (Western blotting)

Zeocin、G418抗生素篩選的最適濃度均為1000 μg/ml。倒置熒光顯微鏡下清晰可見，FRT細胞膜上呈綠色熒光，表明ANO1表達在細胞膜上(圖4A)；FRT細胞質中和細胞膜上均可見綠色熒光，表明YFP-H148Q/I152L表達在細胞質中(圖4B)。即成功構建了穩(wěn)定共表達ANO1和YFP-H148Q/I152L的FRT細胞株。

圖3 基于CaCC靶向TRPV4的細胞篩選模型構建原理Fig. 3 Construction principle of the screening cell model targeting TRPV4 based on CaCC

圖4 共表達ANO1和YFP-H148Q/I152L細胞模型的構建結果(×40)Fig.4 Construction of ANO1 and YFP-H148Q/I152L co-expression cell model (×40)

酶標儀檢測結果顯示，實驗組R F U明顯下降，表明ANO1開放，I-內流，黃色熒光蛋白發(fā)生淬滅；對照組RFU無明顯變化，表明NFA抑制了ANO1的開放，如圖4C所示。該結果表明細胞模型構建成功。

2.4 共表達ANO1和YFP-H148Q/I152L的FRT細胞模型的功能驗證 加入TRPV4激活劑GSK1016790A、4α-PDD、RN-1747后，熒光迅速淬滅。而加入TRPV4抑制劑HC-067047后，熒光未淬滅(圖5A)。加入激活劑組熒光Slope值明顯高于加入抑制劑組，各激活劑組與抑制劑組差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001，圖5B)，表明模型具有篩選TRPV4調節(jié)劑的功能。

在加入不同濃度的TRP V4激活劑和抑制劑后，熒光信號呈現不同的變化。激活劑和抑制劑的濃度與熒光Slope值呈現劑量-效應依賴關系。采用GraphPad Prism 8.0軟件進行非線性曲線擬合分析，濃度取對數作圖，得到濃度效應曲線：GSK1016790A、4α-PDD、RN-1747的EC50分別為9.17、50.06、147.50 μmol/L(圖6A)，GSK2193874、HC-067047、RN-1734的IC50分別為5.74、10.91、72.49 μmol/L(圖6B)。該結果表明激活劑和抑制劑對TRPV4通道的作用具有濃度依賴性，證實了該模型可用于TRPV4調節(jié)劑的篩選。

圖5 FRT細胞模型篩選TRPV4調節(jié)劑的功能鑒定(n=3)Fig.5 Functional identification of FRT cell model screening TRPV4 modulator (n=3)

2.5 共表達ANO1和YFP-H148Q/I152L的FRT細胞中Ca2+濃度的變化情況 加入不同濃度的GSK1016790A后，GSK1016790A濃度越高，RFU下降的幅度越大，熒光Slope值越大，如圖7A所示，熒光Slope值與GSK1016790A濃度呈劑量依賴關系。同時細胞內Ca2+濃度瞬時升高，隨著GSK1016790A濃度的升高，細胞質內Ca2+濃度隨之升高，Ca2+濃度與GSK1016790A濃度呈劑量依賴關系(7B)；熒光Slope值隨著細胞質內Ca2+濃度增加而增大，Ca2+濃度越大，熒光Slope值越大，如圖7C所示，FRT細胞模型熒光淬滅Slope值與細胞內Ca2+濃度呈正相關。

2.6 共表達ANO1和YFP-H148Q/I152L的FRT細胞模型的Z'因子評估 結果顯示，SDpositive值為5.06，SDnegtive值為1.57，Meanpositive值為78.2，Meannegative值為5.07，根據公式計算得到Z'因子為0.728(圖8)。一般認為當Z'因子＞0.5時，該高通量方法比較理想，因此建立的細胞模型適用于TRPV4調節(jié)劑的高通量篩選。

圖6 TRPV4激活劑及抑制劑的劑量依賴曲線(n=3)Fig.6 Dose-dependent curves of TRPV4 activators and inhibitors (n=3)

圖7 熒光Slope值與細胞內Ca2+濃度的關系(n=3)Fig.7 Relationship between fluorescence slope value and intracellular Ca2+ concentration (n=3)

3 討 論

圖8 共表達ANO1和YFP-H148Q/I152L的FRT細胞模型的Z'因子評估(n=48)Fig.8 Assessment of Z' factor in FRT cell model that coexpression of ANO1 and YFP-H148Q/I152L (n=48)

近年來，隨著藥物研發(fā)技術的迅速發(fā)展，離子通道作為重要的藥物靶點而備受關注[12-13]。 TRPV4作為離子通道之一，廣泛分布在消化、神經、呼吸和心腦血管等系統(tǒng)[2]，可被溫度、機械刺激、滲透壓等因素激活，引起Ca2+的流動，通過對Ca2+和細胞內信號轉導通路的調控，影響細胞的增殖、分化、遷移和凋亡等，進而在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[14]。研究表明，TRPV4調節(jié)劑與動脈粥樣硬化、纖維化、疼痛、炎癥、腫瘤等密切相關[3,6,15-17]。但目前已發(fā)現的TRPV4調節(jié)劑均存在選擇性不佳等問題，且尚無高通量篩選TRPV4調節(jié)劑的方法，因此研究篩選TRPV4調節(jié)劑的方法具有重要意義。

目前，篩選離子通道調節(jié)劑的方法主要有電生理技術和熒光染料法等，前者因具有直接、靈敏的優(yōu)點而被公認為離子通道功能檢測的“金標準”[18]，但其操作繁瑣、成本昂貴，對操作人員技術要求高，不適用于高通量藥物篩選。而熒光染料如Fluo-3、Fluo-4等[19]與Ca2+結合后，染料熒光強度增強，能夠直觀、實時檢測細胞內Ca2+濃度的變化，但操作復雜，試劑費用高，實驗周期長，限制了TRPV4調節(jié)劑的高通量篩選。

常用的篩選離子通道調節(jié)劑的方法大多不適用于TRPV4大量化合物庫的高通量篩選。因此，本研究建立了一種基于CaCC的高通量篩選TRPV4調節(jié)劑的方法，利用TRPV4可以升高細胞內Ca2+濃度進而開放CaCC，細胞外I-轉運至細胞內，胞內黃色熒光蛋白YFP-H148Q/I152L的熒光發(fā)生淬滅的原理，檢測熒光信號可實現對TRPV4調節(jié)劑的高通量篩選。FRT細胞具有貼壁緊、胰酶不易消化、生長速度適中、較CHO和COS-7等細胞更易使膜蛋白表達的特點，常用于研究氯離子通道及其調節(jié)劑的高通量篩選[20]，因此本研究選擇FRT細胞系作為目的細胞進行建模。利用熒光倒置顯微鏡觀察共表達ANO1和YFP-H148Q/I152L的FRT細胞株，ANO1表達在細胞膜上，YFP-H148Q/I152L表達在細胞質內，若表達位置錯誤，FRT細胞將無法轉運細胞外I-且不具備熒光淬滅的生物學功能，通過熒光淬滅動力學實驗進一步驗證了ANO1表達在細胞膜上而非細胞外，證實了ANO1定位和功能的準確性。同時，本模型可敏感檢測細胞內Ca2+的濃度，用熒光Slope值表征細胞內Ca2+濃度，比Fura-2法具有更大的信號窗口且可以更直觀地反映細胞內Ca2+濃度的變化情況。本模型經反復傳代至30代以上，依然保持其穩(wěn)定性，且Z'因子為0.728，能滿足高通量篩選的要求。

本模型只是TRPV4調節(jié)劑的初篩方法，尚存在一系列不足。本模型在用于TRPV4激活劑的篩選時，可能會篩選出CaCC通道或其他內源性Ca2+通道的激活劑，篩選之后還需要通過后續(xù)實驗區(qū)分出假陽性結果，可應用不同激活劑和抑制劑組合在一定程度上區(qū)分結果的真?zhèn)危糜谝种苿┖Y選時則沒有此問題。由于本模型內源性表達TRPV4，并不表達TRPV通道的其他蛋白，說明本研究篩選的激活劑和抑制劑均作用于TRPV4，但對于篩選的激活劑和抑制劑是否作用于TRPV通道的其他蛋白仍需后續(xù)實驗進一步驗證。

綜上所述，本模型是高通量篩選TRPV4調節(jié)劑的新方法，可以快速敏感地檢測細胞內鈣信號的變化，實現對TRPV4調節(jié)劑的高通量篩選，具有篩選周期短、操作簡便、成本低的優(yōu)點，為進一步研究和開發(fā)TRPV4新型藥物提供了初篩方法，還為其他離子通道調節(jié)劑的篩選提供了新思路，具有相當廣闊的應用前景。