氟化物對(duì)火山石基質(zhì)人工濕地處理廢水性能及菌群的影響

吳英海，楊靜，李可心，榮馨宇，孫慶江，楊娜，張雨葵，韓蕊，3

（1 大連海洋大學(xué)海洋與土木工程學(xué)院，遼寧大連116023；2 生態(tài)環(huán)境部華南環(huán)境科學(xué)研究所，廣東廣州510655；3 設(shè)施漁業(yè)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023）

人工濕地（CW）與傳統(tǒng)污水處理廠相比具有投資少、運(yùn)行成本低、易于管理和生態(tài)效益高等優(yōu)點(diǎn)。為了滿足更加嚴(yán)格的排放要求，CW近年來(lái)常用于工業(yè)廢水深度處理[1]，其中垂直流人工濕地（VFCW）應(yīng)用更加廣泛[2]。CW 的處理性能常受到溫度、溶解氧（DO）、水力負(fù)荷率（HLR）、碳氮比（C/N）、基質(zhì)種類以及有毒物質(zhì)等因素的影響[3]。其中濕地基質(zhì)、HLR、C/N等因素是影響CW去除效率的主要因素，得到了較多的關(guān)注和研究[4]。當(dāng)CW 用于工業(yè)廢水深度處理時(shí)，工業(yè)廢水中的有毒物質(zhì)（例如重金屬、殺菌劑、毒害有機(jī)物等）會(huì)影響CW 中的微生物而導(dǎo)致CW 處理效率降低[5]。

氫氟酸是工業(yè)生產(chǎn)中普遍使用的化學(xué)物質(zhì)，氟化工生產(chǎn)、不銹鋼酸洗、有色金屬冶煉、電器清洗和有機(jī)化工合成等均能產(chǎn)生含氟污水。高濃度含氟污水一般采用石灰沉淀法，即利用石灰中的鈣離子與氟離子（F-）生CaF2沉淀而除去F-[6]。然而某些工業(yè)廢水（例如液晶顯示模板生產(chǎn)廢水）具有污水排放量大、含有中低濃度氟化物等特點(diǎn)，即使采用投加石灰乳使廢水pH達(dá)到12，也只能使廢水中F-濃度下降至約15mg/L，且水中懸浮物含量很高，不滿足我國(guó)《污水綜合排放標(biāo)準(zhǔn)》（GB8979—96）一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的要求。這是由于石灰乳的溶解度較小，產(chǎn)生的Ca2+不足，從而無(wú)法形成有效CaF2沉淀；此外，形成的CaF2是一種細(xì)微的結(jié)晶（粒徑小于3μm 的顆粒占60%左右），根據(jù)斯托克斯公式[7]，細(xì)小微粒的沉降速度與顆粒粒徑的平方成正比，因此CaF2的沉降速度很慢。徐金蘭等[8]采用聚合氯化鋁（PAC）來(lái)處理含氟廢水，在PAC 投加400mg/L的條件下出水氟化物濃度可達(dá)10mg/L，但是費(fèi)用高且容易造成二次污染。濃度≤50mg/L的氟化物在工業(yè)廢水或經(jīng)過(guò)物理化學(xué)工藝初步處理過(guò)的廢水中比較常見(jiàn)。CW系統(tǒng)依靠物理、化學(xué)和微生物的作用對(duì)許多污染物具有較好的去除效果[2,9]，然而在處理含氟廢水時(shí)濃度≤50mg/L 的氟化物對(duì)CW 處理效果的影響程度如何尚未發(fā)現(xiàn)有報(bào)道，限制了CW系統(tǒng)在含氟污水深度處理中的應(yīng)用。

CW基質(zhì)上的微生物對(duì)于污染物的去除起關(guān)鍵作用[9]，然而目前氟化物對(duì)濕地微生物的影響尚不清楚。HLR 和C/N 是影響CW 處理性能的重要指標(biāo)[3]。在適當(dāng)?shù)腍LR 和C/N 條件下，微生物可發(fā)揮最大代謝作用。比耗氧速率（SOUR）和氨攝取速率（AUR）可分別反映微生物代謝有機(jī)物和氨氮的能力，經(jīng)常被用來(lái)分別考察污水處理系統(tǒng)對(duì)有機(jī)物和氨氮的降解能力[10-13]。硝酸鹽還原酶（NaR）是氮素代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶，將硝酸鹽氮（NO3-N）還原為亞硝酸鹽氮（NO2-N），負(fù)責(zé)硝酸鹽氮次第還原過(guò)程的第一步反應(yīng)[14]。這些指標(biāo)可用來(lái)表征微生物的降解能力。

為了解析氟化物對(duì)CW系統(tǒng)處理效果和菌群的影響，本研究構(gòu)建以火山石為基質(zhì)的VFCW試驗(yàn)?zāi)M系統(tǒng)，研究不同處理的污染物去除效果，分析不同進(jìn)水濃度、HLR等關(guān)鍵因素對(duì)處理效果的影響，優(yōu)化運(yùn)行參數(shù)并在該條件下研究氟化物對(duì)VFCW處理效果和菌群的影響。本研究可以為CW系統(tǒng)處理含氟廢水提供技術(shù)參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)裝置及系統(tǒng)運(yùn)行條件

構(gòu)建的VFCW實(shí)驗(yàn)裝置如圖1所示。該系統(tǒng)主要由VFCW反應(yīng)器、配水柱、配水箱、潛水泵和流量控制器等組成。VFCW 反應(yīng)器中的填料為火山石，其上種植有銅錢草，采集某污水廠活性污泥、大連市西山水庫(kù)底泥和花圃土壤微生物接種啟動(dòng)，溫度控制在20℃±2℃。反應(yīng)器的總體積為46.0L，DO為5.6mg/L±0.5mg/L。

實(shí)驗(yàn)用水：純水用來(lái)測(cè)試?yán)砘笜?biāo)，自來(lái)水經(jīng)處理后參考已有文獻(xiàn)配制人工污水[15]。

測(cè)定指標(biāo)：化學(xué)需氧量（COD）、氨氮（NH4-N）、NO3-N、總氮（TN）和氟化物（以F-離子計(jì)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料和試劑

1.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（Themo Genesys 10s）、pH/溶解氧儀（WTW inoLab Oxi 7310）、氨電極（PNH3-1，上海雷磁）、場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡（Nova NanoSEM 450，美國(guó)FEI 公司）、臺(tái)式高速離機(jī)（HT20MM，上海創(chuàng)萌生物科技有限公司）、氟離子選擇電極（PF-1，上海雷磁）、恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9052，上海錦玟）等。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑

乙酸鈉、氯化銨、納氏試劑、酒石酸鉀納、重鉻酸鉀、鄰苯二甲酸氫鉀、硝酸鉀、硫酸鋁鉀、濃氨水（25%）、硫酸鋅、大孔徑中性樹(shù)脂、酚二磺酸、葡萄糖、鋁鉀礬等。以上試劑除氯化銨、鄰苯二甲酸氫鉀、硝酸鉀是優(yōu)級(jí)純以外，其他均為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法以及步驟

1.3.1 實(shí)驗(yàn)條件及取樣

實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)采用循環(huán)處理方式。在探究HLR 影響時(shí)，四個(gè)CW反應(yīng)器中的流速分別為160mL/min、120mL/min、80mL/min、40mL/min；在探究C/N 的影響時(shí)，四個(gè)反應(yīng)器中的C/N 值分別為5.5、4.5、3.5、2.5；在得到最佳HLR 和C/N 后，開(kāi)展不同含量氟化物影響研究，四個(gè)反應(yīng)器中的濃度分別為0、10mg/L、20mg/L、50mg/L。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將四個(gè)反應(yīng)器中的污水混合均勻并平均分配于四個(gè)反應(yīng)器中，以保證初始濃度一致。在配水柱溢流口取水樣作為進(jìn)水水樣，在濕地溢流口取水樣作為出水水樣。為了減少誤差，每次取的水樣體積應(yīng)一致，取完水樣后每250mL 的水樣加入100μL 濃硫酸，保證其pH＜2 并在冰箱4℃冷藏保存。為了減少實(shí)驗(yàn)誤差，每天取水樣前在每個(gè)反應(yīng)器水箱中加入自來(lái)水補(bǔ)充蒸發(fā)量。在對(duì)照處理（CT）和氟化物濃度50mg/L 處理（F50） 中分別取上層填料（U）、中層填料（M）和下次填料（L）樣品，編號(hào)分別為CT.U、CT.M、CT.L、F50.U、F50.M 和F50.L，填料粉碎后冷藏，進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3.2 填料表面性狀及物質(zhì)測(cè)定

先對(duì)火山石填料進(jìn)行固定噴金（Run Profile 為QT Time AU），再用場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡（TEM）測(cè)試火山石填料的表面性狀，其參數(shù)設(shè)定為HV 5.00kV，WD 4.7mm，Mag 2000m，Spot 3.0，腔體壓力50Pa。另取F50處理中50g火山石填料（含反應(yīng)器內(nèi)污水）放入燒杯，超聲震蕩后取懸濁液加入50mL 離心管離心（1000r/min，5min）后棄去上清液，沉淀物經(jīng)冷凍干燥后采用X 射線衍射（X-ray diffraction，XRD）技術(shù)進(jìn)行晶體分析，使用X射線粉 末 衍 射 儀 （Empyrean， PANalytical B. V.，Holland），參數(shù)設(shè)定為掃描范圍10.0197°～89.9697°；步長(zhǎng)0.039°；連續(xù)掃描；Cu 靶；λ=1.5404?；管電流40mA，電壓40kV。

1.3.3 水樣的測(cè)定方法

COD、NH4-N、NO3-N、TN和F-分別采用快速消解分光光度法、納氏試劑分光光度法、紫外分光光度法、堿性過(guò)硫酸鉀消解紫外分光光度法和氟離子選擇電極法進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)每個(gè)水樣測(cè)試三次。

1.3.4 擴(kuò)增子實(shí)驗(yàn)

按照DNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行基因組DNA抽提后，檢測(cè)DNA 的濃度和純度；然后采用16S V4 區(qū)引物（515F 和806R），使用帶barcode 的引物及Premix Taq（TaKaRa）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增；再檢測(cè)PCR 產(chǎn)物的片段長(zhǎng)度和濃度；使用E.Z.N.A.?Gel Extraction Kit 凝膠回收試劑盒回收PCR 混合產(chǎn)物；接著進(jìn)行建庫(kù)；使用Illumina Hiseq 2500 平臺(tái)對(duì)構(gòu)建的擴(kuò)增子文庫(kù)進(jìn)行PE250測(cè)序（廣東美格基因科技有限公司）。詳細(xì)操作見(jiàn)文獻(xiàn)[9]報(bào)道。

1.3.5 微生物信息學(xué)分析

測(cè)序數(shù)據(jù)處理、OTU 及物種群落分析、α多樣性分析、β多樣性分析、組間差異統(tǒng)計(jì)分析和冗余分析（RDA）的詳細(xì)方法見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道[9]。

1.3.6 SOUR、AUR和NaR活性的測(cè)定

取15g濕地填料，在無(wú)外部細(xì)菌污染條件下進(jìn)行粉碎，隨后對(duì)粉狀填料進(jìn)行測(cè)試，SOUR和AUR按參考文獻(xiàn)[10]方法進(jìn)行測(cè)定，NaR 的測(cè)定采用酚二磺酸比色法[16]。

1.3.7 去除率的計(jì)算

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 VFCW填料的表面性狀及物質(zhì)分析

利用TEM 對(duì)添加氟化物前后火山石顆粒填料的表面超微形貌結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖中可以看出，火山石顆粒填料表面具有大量的凹坑結(jié)構(gòu)，可以容納大量微生物生長(zhǎng)。圖2(a)中填料表面生長(zhǎng)的微生物量明顯大于圖2(b)的微生物量。從圖2(b)上還可以看到，火山石顆粒填料表面沉積了一些顆粒狀物質(zhì)，推測(cè)為含氟沉淀物質(zhì)。這些沉淀物質(zhì)后經(jīng)XRD 測(cè)定顯示主要為氟化鈣（CaF2）、氟磷酸鈣[Ca5F(PO4)3]和磷酸鈣[Ca3(PO4)2]等（圖3）。

圖2 添加氟化物前后火山石顆粒填料表面性狀

圖3 添加50mg/L氟化物后火山石顆粒填料表面XRD分析

濕地填料通過(guò)物理/化學(xué)吸附、生成沉淀等機(jī)理可以去除部分有機(jī)物、氮、磷等污染物。何春艷等[17]運(yùn)用SEM對(duì)濕地填料改性前后的表面形態(tài)進(jìn)行了表征，發(fā)現(xiàn)改性后的石英砂和沸石對(duì)Cr(Ⅵ)吸附效果較好。楊洋[18]對(duì)濕地基質(zhì)進(jìn)行了SEM 等分析，發(fā)現(xiàn)基質(zhì)對(duì)氮、磷吸附能力強(qiáng)與表面微孔結(jié)構(gòu)和含有的金屬元素有關(guān)。F-有很強(qiáng)的電負(fù)性。紅外光譜證實(shí)，F(xiàn)-可在一些水化的Al2O3表面上發(fā)生氫鍵吸附[19]。本研究中，火山石表面的大量凹坑結(jié)構(gòu)具有較大的吸附容量?；鹕绞|(zhì)含有的鈣鹽可將F-轉(zhuǎn)化為難溶的CaF2沉淀。此外，由于配置的人工污水中含有磷酸鹽，而鈣鹽與磷鹽同時(shí)存在時(shí)，可以生成更難容的Ca5(PO4)3F 沉淀[19]。除了這兩種含氟沉淀物，沉淀物中還含有Ca3(PO4)2及少量其他晶體沉淀物?？梢?jiàn)，氟化物進(jìn)入以火山石為基質(zhì)的CW系統(tǒng)后，一部分會(huì)與系統(tǒng)中存在的鈣鹽、磷酸鹽發(fā)生沉淀反應(yīng)而從水中去除，沉淀物會(huì)黏附于火山石填料表面。

2.2 HLR和C/N對(duì)VFCW處理污水的影響

不同HRL 條件下實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)出水中四類污染物指標(biāo)的去除率見(jiàn)圖4。由該圖可知，運(yùn)行60h 后80mL/min 處理COD、NH4-N 和TN 的去除率最高，分別為78.2%、85.3%和49.2%，比其他處理分別至少高11%、1.0%和5.4%以上，而NO3-N 去除率僅比最高的120mL/min 的處理低0.9%。HLR 為160mL/min的處理去除效率不是最高，說(shuō)明過(guò)高的HLR不利于污染物在系統(tǒng)內(nèi)降解[3]。Almeida等[20]的研究也發(fā)現(xiàn)隨著HLR增大超過(guò)一個(gè)峰值后，VFCW對(duì)NO3-N 的處理效率出現(xiàn)較明顯的下降。在HLR降至40mL/min 時(shí)，COD、NH4-N和TN去除率出現(xiàn)下降，說(shuō)明在循環(huán)水處理系統(tǒng)中過(guò)低的HLR 沒(méi)有發(fā)揮系統(tǒng)的全部處理能力，從而影響了對(duì)污染物的處理效果。NO3-N 去除率出現(xiàn)負(fù)值是由于系統(tǒng)中NH4-N轉(zhuǎn)化為NO3-N，而NO3-N未及時(shí)還原出現(xiàn)累積所致，說(shuō)明在設(shè)定HLR 條件下硝化效率較高，將水中大部分NH4-N 轉(zhuǎn)化為NO3-N。此外，本實(shí)驗(yàn)中較高的HLR 導(dǎo)致DO 較高（DO≈5.6mg/L），從而抑制了反硝化菌在短時(shí)間內(nèi)生長(zhǎng)而出現(xiàn)NO3-N累積[3,21]。Yi 等[22]研究發(fā)現(xiàn)直到系統(tǒng)運(yùn)行48h 后，NO3-N累積現(xiàn)象才緩解。綜上所述，HRL 為80mL/min、120mL/min 的兩個(gè)處理對(duì)有機(jī)物和氮污染物有較高的處理效率。

圖4 不同HLR條件下濕地系統(tǒng)運(yùn)行60h的污染物去除率

不同C/N 條件下濕地系統(tǒng)運(yùn)行60h 的污染物去除率見(jiàn)圖5。C/N低于3.5時(shí)，氮的去除率受到了一定程度的影響，尤其NO3-N 受到的不利影響較明顯；C/N高于4.5時(shí)處理效率很接近（圖5）。C/N會(huì)明顯影響CW 的處理效果。Zhu 等[23]的研究表明潛流CW 對(duì)氮的去除率隨著C/N 增大而升高；但當(dāng)C/N 超過(guò)5 時(shí)，對(duì)處理效果的提高不再明顯。低的C/N 會(huì)限制反硝化菌的生長(zhǎng)。Zhao 等[24]的研究表明當(dāng)C/N 低于2.5 時(shí)，除氮效率下降41%。許多研究表明碳源不足會(huì)影響或抑制反硝化菌而導(dǎo)致NO3-N在污水處理系統(tǒng)中累積[3,22]。通過(guò)添加緩釋性碳源可以有效提高異養(yǎng)反硝化菌的活性。以往研究表明，通過(guò)在CW基質(zhì)中固定稻殼可以提供可持續(xù)的碳源釋放，從而提高了硝酸鹽氮的還原[25]。綜上所述，C/N=4.5處理的污染物處理效率較高。

圖5 不同C/N條件下濕地系統(tǒng)運(yùn)行60h的污染物去除率

2.3 氟化物對(duì)污水處理效果的影響及氟化物的去除率

圖6 不同氟化物進(jìn)水濃度條件下實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)出水中污染物濃度隨時(shí)間的變化

圖6顯示了不同氟化物進(jìn)水濃度條件下實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)出水污染物濃度隨時(shí)間的變化。隨著運(yùn)行時(shí)間延長(zhǎng)，四個(gè)處理的COD 和NH4-N 濃度穩(wěn)步地下降[圖6(a)和(b)]。四個(gè)處理的NO3-N含量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)；NO3-N 在0～48h 下降不明顯，而在48～60h 呈現(xiàn)較為明顯的下降[圖6(c)]。四個(gè)處理的TN雖然有輕微波動(dòng)，但總體上呈下降趨勢(shì)；TN在0～48h下降不明顯，而在48～60h呈現(xiàn)較為明顯的下降[圖6(d)]。不同氟化物進(jìn)水濃度條件下實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)運(yùn)行60h后的污染物去除率見(jiàn)圖7，三種添加不同濃度的氟化物處理對(duì)污染物去除率的影響表現(xiàn)出差異，其中10mg/L 氟化物處理對(duì)COD 去除率的影響輕微，對(duì)NH4-N和TN的去除率相對(duì)0mg/L處理分別下降8.4%和5.5%，NO3-N 開(kāi)始出現(xiàn)累積（去除率為-23.1%）；20mg/L氟化物處理中COD、NH4-N和TN 的去除率相對(duì)0 處理分別下降4.7%、7.9%和14.5%，NO3-N 累積加重（去除率為-52.2%）；50mg/L 氟化物處理中COD、NH4-N 和TN 的去除率相對(duì)0mg/L 處理分別下降10.0%、17.1%和28.4%，NO3-N累積更加嚴(yán)重（去除率為-96.1%）。

圖7 不同氟化物進(jìn)水濃度條件下實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)運(yùn)行60h的污染物去除率

三種添加不同濃度的氟化物處理COD 去除率下降均≤10%，可能是火山石基質(zhì)上存在較多對(duì)氟化物具有較好耐受能力的有機(jī)物利用菌。研究發(fā)現(xiàn)部分有機(jī)物降解菌的耐受性比較強(qiáng)，例如Hu 等[26]發(fā) 現(xiàn) 紅 球 菌HX-2 能 夠 耐 受1%～10% 的NaCl。10mg/L氟化物處理導(dǎo)致系統(tǒng)反硝化效率明顯下降，20mg/L 氟化物處理導(dǎo)致系統(tǒng)反硝化效率進(jìn)一步下降，導(dǎo)致出水TN 去除率下降超過(guò)10%，可見(jiàn)反硝化菌對(duì)氟化物較為敏感；而20mg/L 氟化物處理中氨氮的去除效果僅下降7.9%，可見(jiàn)該氟化物濃度下反硝化菌受影響不嚴(yán)重，可能是火山石基質(zhì)上具有硝化功能的微生物對(duì)氟化物具有一定的耐受能力。Ochoa-Herrera 等[27]發(fā)現(xiàn)硝化菌表現(xiàn)出對(duì)氟化物很快適應(yīng)，在暴露高濃度氟化物僅四天后幾乎完全恢復(fù)代謝活性。50mg/L 氟化物處理會(huì)導(dǎo)致系統(tǒng)硝化、反硝化效率均明顯下降，導(dǎo)致出水TN 去除率下降接近30%，該濃度處理對(duì)出水水質(zhì)影響較為嚴(yán)重，推斷是由于該濃度的氟化物對(duì)相關(guān)菌群的影響較為嚴(yán)重所致。一些研究表明，反硝化菌容易受化學(xué)物質(zhì)的影響。Guo 等[28]研究發(fā)現(xiàn)淡水沉積物中反硝化菌群落極易受金屬污染的影響，Ghafari等[29]的研究表明無(wú)機(jī)碳源對(duì)自養(yǎng)型反硝化菌影響較大。

VFCW對(duì)四個(gè)不同進(jìn)水氟化物濃度處理中的F-去除均較為迅速，第一個(gè)循環(huán)出水就已達(dá)到基本穩(wěn)定，在60h內(nèi)基本不再發(fā)生變化（圖8）。進(jìn)水是由自來(lái)水配制的污水，對(duì)照處理含有的0.1mg/L 氟化物的去除率可以達(dá)到38%；在氟化物進(jìn)水濃度為10mg/L 時(shí)達(dá)到了90%；隨著進(jìn)水氟化物濃度由10mg/L增大到50mg/L，其去除率基本維持在90%左右（圖8）。氟化物在經(jīng)過(guò)VFCW的基質(zhì)時(shí)，與基質(zhì)發(fā)生吸附、沉淀、離子交換等反應(yīng)，氟化物在污水和基質(zhì)中重新分配?；|(zhì)中的陽(yáng)離子、微生物胞外聚合物等成份會(huì)影響到氟化物的去除率[30]。常國(guó)華等[31]的研究表明濕地對(duì)氟化物的去處率一般。李玉倩[32]對(duì)丹河CW處理化工污水的研究結(jié)果表明CW系統(tǒng)中對(duì)于難降解的氟化物去除率基本為零，出口水平和進(jìn)口基本一致，CW系統(tǒng)對(duì)難降解的化合物基本不能去除。從前述SEM和XRD結(jié)果可知，火山石基質(zhì)含有的Ca2+以及污水中的磷酸鹽均會(huì)與氟化物發(fā)生沉淀反應(yīng)，本研究氟化物去除率高于已報(bào)道的研究[19,33]。此外，濕地植物也會(huì)去除部分氟化物，其去除率相對(duì)于基質(zhì)較小，但具有可持續(xù)的優(yōu)勢(shì)[34]。

圖8 不同氟化物進(jìn)水濃度條件下實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)氟化物出水濃度隨時(shí)間的變化（以第一個(gè)循環(huán)結(jié)束為時(shí)間0點(diǎn)）

2.4 氟化物對(duì)CW菌群構(gòu)成和多樣性的影響

圖9顯示了氟化物濃度0處理和50mg/L處理的屬水平聚類熱圖。相當(dāng)一部分細(xì)菌在組間存在明顯的相對(duì)豐度差異。圖9 中的上部12 個(gè)物種，即Rubivivax、Variovorax、Stenotrophomonas等物種在對(duì)照組中相對(duì)豐度較低，而在氟化物處理組中相對(duì)豐度較高；下部14 個(gè)物種，即Nitrospira、Sulfuritalea、α_proteobacterium_P-20 等物種在對(duì)照組中相對(duì)豐度較高，而在氟化物處理組中相對(duì)豐度較低。可見(jiàn)，氟化物濃度50mg/L 處理明顯地改變了VFCW 系統(tǒng)菌群組成，一些物種占比明顯減少，而另一些物種具有相對(duì)較強(qiáng)的耐受性。

圖9 16s RNA MiSeq測(cè)序顯示兩組前30個(gè)微生物屬的相對(duì)豐度

圖10 顯示了氟化物濃度0 處理和50mg/L 處理的優(yōu)勢(shì)度指數(shù)（Dominance） 和主坐標(biāo)分析（principalco-ordinates analysis，PcoA）分析結(jié)果，它們分別可表示α多樣性和β多樣性。圖10(a)顯示氟化物濃度50mg/L 處理后，上、中、下層填料中微生物群落Dominance指數(shù)均比對(duì)照處理組明顯變小，尤其上部填料變化更為明顯。圖10(b)顯示氟化物濃度0處理和50mg/L處理的微生物群落距離較遠(yuǎn)，表明它們之間存在明顯的差異。PC1、PC2 分別代表對(duì)于兩組微生物群落組成的可能影響因素，其中，PC1解釋了91.1%，PC2解釋了3.9%，CT組和F50 組微生物群落在PC1 軸的方向上分離開(kāi)來(lái)，分析PC1 是導(dǎo)致CT 組和F50 組分開(kāi)的因素，驗(yàn)證了氟化物濃度因素有較高的可能性影響了微生物群落的組成；此外，在氟化物濃度50mg/L處理后上、中、下層填料中微生物群落的距離有所減小，表明它們之間的差異性有所減小，共有菌種比例增加。

圖10 對(duì)照處理（CT）與氟化物濃度50mg/L處理（F50）的α多樣性和β多樣性

圖11 對(duì)照處理組（CT）與氟化物濃度50mg/L處理組的物種差異分析（相對(duì)豐度≥0.01；p＜0.05）和RDA（基于屬水平）

圖11 顯示了氟化物濃度0 處理和50mg/L 處理的屬水平物種差異。圖11 中顯示的物種均為差異顯著的屬（p＜0.05），其中有負(fù)責(zé)有機(jī)物轉(zhuǎn)化的Zoogloea屬、 硝 化 功 能 的Nitrospira屬 和Nitrosomonas屬、 反 硝 化 功 能 的Thauera屬、Simplicispira屬和Dechloromonas屬等。氟化物濃度50mg/L 處理均對(duì)它們產(chǎn)生了顯著影響（p＜0.05）。從圖11中內(nèi)嵌的RDA分析可知，DO的不同使得上中下層填料中微生物產(chǎn)生差異，而在對(duì)照處理和氟化物濃度50mg/L 處理之間菌群產(chǎn)生明顯差異的關(guān)鍵因素是氟化物。

從氟化物對(duì)VFCW菌群構(gòu)成和多樣性的影響結(jié)果（圖10）可知，氟化物濃度50mg/L 處理的菌群組成明顯受到了影響。負(fù)責(zé)有機(jī)物轉(zhuǎn)化的Zoogloea屬、硝化功能的Nitrospira屬和Nitrosomonas屬、反硝化功能的Thauera屬、Simplicispira屬和Dechloromonas屬等的減少將可能降低對(duì)污染物的處理效果[9,35]。這從前述處理效率結(jié)果也得到了證實(shí)。氟化物濃度50mg/L 處理對(duì)有機(jī)物去除率的影響相對(duì)較小，是因?yàn)槲⑸锶郝渲心芾糜袡C(jī)物的菌種非常多，除了Zoogloea屬以外還存在許多其他菌種，因此僅從Zoogloea屬相對(duì)豐度減少的程度不能直接判定對(duì)有機(jī)物去除率影響的大小。反硝化菌的相對(duì)豐度降低的程度與硝化菌類似，然而NO3-N的去除率明顯低于NH4-N 的去除率，推測(cè)氟化物對(duì)NO3-N 微生物還原過(guò)程的影響不僅包括降低功能細(xì)菌的豐度，還可能抑制其活性，從而導(dǎo)致反硝化過(guò)程的不利影響最為突出[圖6(c)]。菌群多樣性變差影響了菌群整體協(xié)作代謝的能力，也將影響對(duì)污水的處理性能。氟化物對(duì)大多數(shù)菌種均有不利的影響，這可能是上中下層填料中微生物群落的差異性變小的原因。然而，物種差異分析結(jié)果也顯示不同菌種對(duì)毒性物質(zhì)的耐受能力存在差異，這可能與不同菌種的細(xì)胞結(jié)構(gòu)有關(guān)[36]。過(guò)高濃度的氟化物會(huì)損害微生物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。有研究發(fā)現(xiàn)氟化物能誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致線粒體損傷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和基因表達(dá)改變[37]。還有研究發(fā)現(xiàn)氟化鈣納米顆粒對(duì)原核微生物的最低抑菌濃度（MIC）值明顯低于許多其他納米顆粒和抗生素[38]。由于氟與氯屬于同族元素，氟離子F-與鹽度對(duì)微生物的影響機(jī)理可能相似。然而目前氟化物對(duì)單菌毒性的研究還不多和深入，其毒性機(jī)制還需進(jìn)一步揭示。

2.5 氟化物對(duì)CW菌群污染物代謝能力的影響

在逐漸升高的F-濃度影響下，SOUR、AUR 和NaR 活性均表現(xiàn)出逐漸下降的趨勢(shì)（表1），其受不同濃度F-的影響表現(xiàn)出顯著差異（p＜0.05）。在F-濃度為50mg/L時(shí)，SOUR、AUR和NaR活性分別降低了13.7%、18.8%和55.6%。

表1 F-濃度分別與SOUR、AUR和NaR活性的關(guān)系（n=3，p＜0.05）

在F-濃度為50mg/L 的處理中，AUR 和NaR 受到的不利影響比NaR 活性受到的不利影響小，表明F-濃度≤50mg/L時(shí)系統(tǒng)中負(fù)責(zé)有機(jī)物轉(zhuǎn)化和硝化反應(yīng)的菌群保留了大部分代謝能力。微生物對(duì)污染物的降解能力取決于相應(yīng)功能菌群的數(shù)量和活性[9]，雖然系統(tǒng)中這些功能微生物的相對(duì)豐度下降，但留存的代謝能力使得系統(tǒng)對(duì)有機(jī)物和NH4-N仍具有80%以上的去除能力（圖6）。以往研究表明某些細(xì)菌中含有的nhaA基因編碼的反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能夠使得細(xì)菌耐Cl-[39-40]，推測(cè)本研究中這些對(duì)F-耐受性較強(qiáng)的菌屬也可能含有某些功能蛋白，對(duì)F-具有一定防御反應(yīng)。

NaR 活性在F-濃度為50mg/L 時(shí)出現(xiàn)顯著性下降（p＜0.05），表明系統(tǒng)中負(fù)責(zé)反硝化的菌群代謝能力對(duì)濃度為50mg/L 的F-耐受力不高，系統(tǒng)此時(shí)反硝化能力嚴(yán)重受到抑制。這也佐證了前面對(duì)反硝化活性受到較大抑制的推測(cè)。NaR通常存在于反硝化細(xì)菌中，在缺氧、厭氧環(huán)境中啟動(dòng)，影響反硝化過(guò)程中從NO3-N 到NO2-N 的轉(zhuǎn)化，其活性高低反映反硝化菌活性和系統(tǒng)硝酸鹽氮還原能力的強(qiáng)弱。已有研究表明，NO3-N還原是一個(gè)敏感的步驟，在受到硫化物、氯離子和O2等影響時(shí)反硝化性能易明顯下降[41-43]。

3 結(jié)論

CW常用于工業(yè)廢水深度處理，然而在處理含氟廢水時(shí)濃度≤50mg/L的氟化物對(duì)污染物處理效果和微生物的影響程度未見(jiàn)報(bào)道，相關(guān)知識(shí)的缺乏限制了CW系統(tǒng)在含氟污水深度處理中的應(yīng)用。本研究發(fā)現(xiàn)，構(gòu)建的VFCW 系統(tǒng)在HRL 80mg/L、C/N 4.5 條件下對(duì)有機(jī)物和氮有較高的去除率。10mg/L氟化物處理導(dǎo)致NO3-N 開(kāi)始出現(xiàn)累積（去除率為-23.1%）。20mg/L 氟化物處理中TN 的去除率與0mg/L 處理相比下降14.5%，NO3-N 累積加重（去除率為-52.2%）。50mg/L 氟化物處理中COD、NH4-N 和TN 的去除率與0mg/L 處理相比分別下降10.0%、17.1%和28.4%，NO3-N累積更加嚴(yán)重（去除率為-96.1%）。F-主要與系統(tǒng)中鈣鹽、磷酸鹽反應(yīng)生成CaF2和Ca5F(PO4)3沉淀而去除。50mg/L 氟化物處理的菌群組成明顯受到了影響，菌群多樣性降低，有機(jī)物轉(zhuǎn)化菌（Zoogloea）、硝化菌（Nitrospira和Nitrosomonas） 和 反 硝 化 菌 （Thauera、Simplicispira和Dechloromonas）等的相對(duì)豐度顯著降低（p＜0.05）。SOUR、AUR 和NaR 活性均隨著氟化物濃度增大而下降，在F-濃度為50mg/L 時(shí)，分別降低13.7%、18.8%和55.6%。氟化物改變了VFCW系統(tǒng)的菌群結(jié)構(gòu)和活性，導(dǎo)致污染物去除率降低，其中對(duì)反硝化過(guò)程和反硝化菌的影響最大，其次是硝化過(guò)程和硝化菌。本研究可以為CW系統(tǒng)處理含氟廢水提供技術(shù)參考。VFCW中氟化物累積機(jī)制以及負(fù)責(zé)防御氟化物的相關(guān)功能蛋白和基因，仍需在今后進(jìn)一步研究。