微生物角蛋白酶在納米粒子制備中的應(yīng)用

葉金鵬，龔勁松，陳霞，蔣敏，李恒，李會(huì)，許正宏，3，史勁松

（1 江南大學(xué)藥學(xué)院，糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122；2 無(wú)錫市濱湖區(qū)榮巷街道社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，江蘇無(wú)錫214151；3 江南大學(xué)生物工程學(xué)院，糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)，江蘇無(wú)錫214122）

金納米粒子（AuNPs）具有獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)，包括光學(xué)效應(yīng)、介電特性以及突出的生物相容性等特征，已被應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢測(cè)、生物催化、新型藥物載體、環(huán)境保護(hù)、寡核苷酸芯片等領(lǐng)域[1-6]。納米金為分散相溶膠，粒子表面包覆著帶負(fù)電的離子，電荷之間的相互排斥作用使金納米粒子可以在水中維持著比較穩(wěn)定的懸浮狀態(tài)，同時(shí)吸附水中的H+，從而形成穩(wěn)定的膠體[7]。金納米粒子的制備已有較多文獻(xiàn)報(bào)道，目前常用的有物理法和化學(xué)法，其中物理法包括激光燒灼[8]、研磨粉碎[9]等，而化學(xué)法有種子生長(zhǎng)法[10]、檸檬酸鈉還原法[11]等。盡管這些制備方法比較成熟，但仍然存在著過(guò)程復(fù)雜、條件苛刻、化學(xué)還原劑用量大等問(wèn)題[12]。

近年來(lái)，已有許多研究者利用生物法制備出納米金粒子，陶晶利用蘆薈提取物制備出粒徑在20～50nm 的金納米粒子[13]，Rajasree 等[14]利用革蘭氏陰性菌熒光假單胞菌合成粒徑在50～70nm 之間的納米金粒子。某些微生物酶或植物蛋白可作為還原劑應(yīng)用于金納米粒子的綠色合成，制備獲得的金納米粒子有更好的生物相容性，制備過(guò)程也較為溫和[15]。角蛋白酶是一種特殊的同時(shí)擁有肽鍵水解和二硫鍵還原特性的多功能蛋白酶類，能將硬質(zhì)不溶性角蛋白（如羽毛、羊毛等）轉(zhuǎn)化為可溶蛋白、氨基酸及多肽[16-17]。微生物角蛋白酶來(lái)源廣泛，相比其他還原性功能的生物酶使用簡(jiǎn)單，具有更廣泛的應(yīng)用價(jià)值。本研究首次探索了微生物角蛋白酶制備金納米粒子的方法。

枯草芽孢桿菌WB600 是本研究室構(gòu)建的高表達(dá)角蛋白酶基因的一株工程菌，其分泌的角蛋白酶具有較強(qiáng)的還原力[18]。本文利用該角蛋白酶制備金納米粒子，主要研究了加酶量、反應(yīng)時(shí)間和氯金酸濃度對(duì)納米金顆粒的影響，通過(guò)電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS）對(duì)反應(yīng)過(guò)程進(jìn)行監(jiān)測(cè)，然后通過(guò)透射電鏡（TEM）、動(dòng)態(tài)光散射（DLS）、傅里葉紅外光譜（FTIR）等方法對(duì)金納米粒子進(jìn)行了表征。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株枯草芽孢桿菌WB600（PMA5-aprE-kerBv），為本實(shí)驗(yàn)前期構(gòu)建所得[18]。

1.1.2 主要試劑

氯金酸、瓊脂粉、甘油、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氯化鈉、脫脂奶粉購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酵母粉、蛋白胨（生化試劑） 購(gòu)于OXOID公司；可溶性角蛋白購(gòu)于TCI公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB 液體培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉10g/L。

TB 液體培養(yǎng)基：酵母粉28g/L，蛋白胨14g/L，甘油20g/L，磷酸氫二鉀16.4g/L，磷酸二氫鉀2.3g/L。

牛奶固體LB 培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，脫脂奶粉10g/L，氯化鈉10g/L，瓊脂粉15g/L。

1.2 角蛋白酶的制備

將枯草芽孢桿菌WB600 劃線接種在牛奶固體瓊脂培養(yǎng)基上，在37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h后，選擇平板上透明圈較大且生長(zhǎng)較快的單菌落，轉(zhuǎn)接至LB 液體培養(yǎng)基中。在37℃、220r/min 的恒溫回旋式搖床中培養(yǎng)12h 作為種子液，以5%接種量接種至TB 液體培養(yǎng)基，在37℃、220r/min 的回旋式搖床中發(fā)酵產(chǎn)酶[18]。最后將發(fā)酵液在7500r/min、4℃條件下離心20min，獲得的上清液用孔徑為0.22μm的微孔濾膜過(guò)濾除菌，用文獻(xiàn)[18]中報(bào)道的方法測(cè)定角蛋白酶活性及其還原力，低溫儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 金納米粒子的制備及條件優(yōu)化

稱取適量的氯金酸粉末，室溫下溶于超純水中，用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾除菌。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，量取50mL 氯金酸溶液加入250mL 的錐形瓶中，加入一定量的角蛋白酶；用錫紙包裹錐形瓶，在搖床中以37℃、100r/min的條件振蕩反應(yīng)一定時(shí)間并取樣進(jìn)行紫外-可見(jiàn)分光光度（UV-vis）光譜掃描。制備過(guò)程通過(guò)控制合成反應(yīng)中的三個(gè)因素進(jìn)行逐步優(yōu)化，分別為氯金酸濃度（0.5mmol/L、1mmol/L、1.5mmol/L、2mmol/L、2.5mmol/L、5mmol/L）、酶添加 量（700U、 875U、 1050U、 1225U、 1400U、1575U、1750U）以及合成反應(yīng)時(shí)間（1h、3h、5h、7h等）。

1.4 金離子濃度的測(cè)定

將定時(shí)取樣的反應(yīng)液在15000r/min的條件下離心30min，使金納米粒子完全沉淀于離心管底部。利用超純水將反應(yīng)上清液稀釋一定倍數(shù)，利用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（NexION 350D，PerkinElmer公司）測(cè)定上清液中殘余的金離子濃度，以計(jì)算反應(yīng)的產(chǎn)率及速度。

1.5 金納米粒子的表征

UV-vis 光譜掃描：采用酶標(biāo)儀（SpectraMax M2e，Molecular Devices 公 司） 對(duì) 樣 品 在480～600nm的波長(zhǎng)內(nèi)進(jìn)行掃描，分別率為3nm，觀測(cè)金納米粒子的表面等離子共振吸收峰變化。

透射電鏡（TEM）觀測(cè)：納米顆粒樣品通過(guò)透射 電 子 顯 微 鏡（H-7650，HITACHI 公 司） 在120kV加速電壓下觀察微觀形態(tài)。

紅外吸收光譜（FTIR）：將待測(cè)樣品用毛細(xì)管沾在溴化鉀鹽片上，涂抹均勻，放在紅外燈下烘干，使用紅外光譜儀（TENSORⅡ型，BRUKER 公司）掃描，波長(zhǎng)范圍500～4000cm-1，分辨率4cm-1，背景和樣品掃描次數(shù)均為16。

納米粒度及zeta電位分析：采用動(dòng)態(tài)光散射納米粒度分析儀（NICOMP 380ZLS，PSS 公司）進(jìn)行分析，采用Nicomp分布輸出結(jié)果。zeta電位檢測(cè)過(guò)程需要將樣品注入帶電極的樣品檢測(cè)池，同時(shí)檢測(cè)池中避免氣泡帶入。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 金納米粒子的制備

角蛋白酶kerBv 表現(xiàn)出較強(qiáng)的還原性能，對(duì)羽毛的高水解活性也源于對(duì)二硫鍵的還原作用，能將溶液中的金屬離子還原為金屬單質(zhì)。為充分挖掘該酶的應(yīng)用潛力，本實(shí)驗(yàn)采用角蛋白酶為還原劑進(jìn)行金納米粒子的制備，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，通過(guò)控制氯金酸濃度、酶液添加量和反應(yīng)時(shí)間三個(gè)因素逐步進(jìn)行合成反應(yīng)優(yōu)化。由于金納米粒子的表面存在等離子共振，在不同的波長(zhǎng)下有不同的吸收值[19]，所以本研究采用UV-vis光譜掃描檢測(cè)金納米粒子的形成。

2.1.1 角蛋白酶量對(duì)金納米粒子的影響

分別對(duì)不同加酶量所制備的納米金樣品進(jìn)行UV-vis光譜掃描，結(jié)果如圖1所示。在反應(yīng)進(jìn)行4h后，含有700U 角蛋白酶的體系無(wú)明顯共振峰峰值出現(xiàn)。隨著加酶量的增大，反應(yīng)體系在550nm處出現(xiàn)明顯的共振峰，而且共振峰的大小先隨著加酶量的增加而增大，在加酶量為1400U時(shí)達(dá)到了最大值0.65。然而，在加酶量為1575U、1750U 時(shí)峰值下降，分別為0.60和0.52。推測(cè)是由于體系中加酶量太高，反應(yīng)速率過(guò)快導(dǎo)致生成的金納米粒子迅速沉降。所以本研究選擇了1400U為最適加酶量，并用于下一步實(shí)驗(yàn)。

圖1 加酶量對(duì)金納米粒子吸收峰的影響

2.1.2 氯金酸濃度對(duì)金納米粒子的影響

在酶法制備納米金的過(guò)程中，角蛋白酶起還原劑的作用，而氯金酸就是金單質(zhì)的前體物質(zhì)。圖2是納米金共振峰隨著氯金酸濃度變化圖。當(dāng)濃度為1mmol/L 時(shí)，反應(yīng)體系的峰強(qiáng)最強(qiáng)，峰值為0.81。當(dāng)濃度為1.5mmol/L、2mmol/L、2.5mmol/L時(shí)，峰值分別為0.74、0.44和0.56，均小于1mmol/L時(shí)的峰值。由此可知，當(dāng)氯金酸濃度為1mmol/L時(shí)，金納米顆粒的產(chǎn)率最高。后續(xù)研究選擇1mmol/L 氯金酸和1400U 角蛋白酶研究反應(yīng)時(shí)間的影響。

圖2 氯酸金溶液濃度對(duì)金納米粒子吸收峰的影響

2.1.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)金納米粒子的影響

反應(yīng)時(shí)間是影響反應(yīng)進(jìn)行程度的一個(gè)因素。分別對(duì)不同反應(yīng)時(shí)間所制備的金納米粒子樣品進(jìn)行UV-vis 光譜掃描，結(jié)果如圖3(a)所示。反應(yīng)2h 時(shí)，體系中沒(méi)有檢測(cè)到由金納米粒子產(chǎn)生的共振峰峰值。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，共振峰峰值增大。當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行5h 后，反應(yīng)體系的峰值達(dá)到最大值0.93。而在6h 時(shí)，峰值下降，說(shuō)明體系中納米金顆粒變少，推測(cè)是由于反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，已經(jīng)產(chǎn)生的納米粒子形成了團(tuán)聚。最終，本研究以1mmol/L氯金酸溶液、1400U 角蛋白酶反應(yīng)5h 為制備金納米粒子的最優(yōu)條件。此外，各體系共振峰位置隨反應(yīng)的進(jìn)行并未發(fā)生移動(dòng)，表明角蛋白酶能夠合成穩(wěn)定性良好的金納米粒子。

圖3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)體系的影響

2.1.4 金納米粒子的產(chǎn)率分析

采用上述優(yōu)化條件，即體系中氯金酸濃度為1mmol/L、角蛋白酶用量1400U、反應(yīng)時(shí)間5h 進(jìn)行金納米粒子制備。為了監(jiān)控最優(yōu)反應(yīng)條件下反應(yīng)進(jìn)行的程度，本研究利用電感耦合等離子質(zhì)譜儀（ICP-MS）測(cè)量經(jīng)高速離心后的反應(yīng)液上清液中金離子的殘留情況，結(jié)果如圖3(b)所示。從圖中可以看出，上清液中金離子的濃度隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而下降。在1h 濃度下降的速度最快，然后逐漸變慢。在反應(yīng)前期，由于金離子濃度和角蛋白酶量較大，所以反應(yīng)速度較快。在后期，由于底物濃度下降，所以反應(yīng)速度變慢，同時(shí)曲線在5h 趨于平緩。在最優(yōu)條件下進(jìn)行金納米粒子制備，5h 時(shí)收率可達(dá)到85%，在1L 的反應(yīng)體系中制備金納米粒子的平均速度為166.5mg/h。

2.2 金納米粒子的形貌表征

采用優(yōu)化條件進(jìn)行金納米粒子制備，通過(guò)透射電鏡對(duì)金納米粒子的形態(tài)進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖4所示。大部分粒子的形狀為球形，分散在溶液中，沒(méi)有發(fā)生聚集現(xiàn)象。對(duì)視野范圍內(nèi)的粒子進(jìn)行測(cè)定，可知粒徑均在30nm以下，粒子之間間距比較明顯，沒(méi)有聚集。但是金納米粒子粒徑仍不夠均勻，推測(cè)是由于在將角蛋白酶液滴入氯金酸溶液的一瞬間，局部的角蛋白酶濃度較高，導(dǎo)致金單質(zhì)的生成速度過(guò)快，迅速凝聚成粒徑為30nm 的較大納米粒子。而在將體系混勻之后，反應(yīng)速度下降，所以制備出的金納米粒子粒徑較小。

圖4 金納米粒子的TEM表征

2.3 金納米粒子紅外吸收光譜

用傅里葉變換紅外光譜（FTIR）對(duì)金納米粒子進(jìn)行表征。從紅外光譜圖（圖5）中可看出，波長(zhǎng)介于3100～3500cm-1之間的吸收帶是酰胺N—H鍵的不對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰，1452cm-1處的吸收帶歸因于氨基酸殘基—COO—基團(tuán)的對(duì)稱伸縮振動(dòng)，而1650cm-1處的吸收帶則代表的是酰胺Ⅰ帶[20]。可以初步推斷，角蛋白酶本身參與了金納米粒子的合成，并成為維系粒子穩(wěn)定的關(guān)鍵物質(zhì)。

圖5 金納米粒子的紅外光譜圖

有研究報(bào)道[21]一些蛋白質(zhì)可以參與到納米金粒子的構(gòu)成，同樣還有一些多糖類物質(zhì)。那么角蛋白酶這種構(gòu)成作用是否只是其蛋白質(zhì)的一般屬性，與其催化活性是否相關(guān)呢？為此，本研究構(gòu)建了一個(gè)活性中心突變、完全失活的重組角蛋白酶（D32F），將其一起用于還原力測(cè)試以及金納米粒子的合成實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖6(a)、(b)所示：失去催化活性的一組，還原力明顯降低，同時(shí)其制備出的納米金吸收峰明顯弱于實(shí)驗(yàn)組的吸收峰，說(shuō)明角蛋白酶的活性對(duì)金納米粒子的合成是必要的，其催化作用在金納米粒子的形成過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。Lateef 等[22]首次報(bào)道了將角蛋白酶成功應(yīng)用于銀納米粒子的制備中，并且制備得到的納米銀擁有較好的抗菌性能。Jang等[23]最近的研究也證實(shí)了角蛋白酶生物法合成納米銀的可行性。但是利用角蛋白酶制備金屬納米粒子的原理尚不明確。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，酶法制備金屬納米粒子與酶活性中心處的氨基酸殘基有關(guān)[24-26]。本研究使用的角蛋白酶屬于絲氨酸蛋白酶。本文作者推測(cè)角蛋白酶法制備金納米粒子的可能機(jī)理為：角蛋白酶活性中心的絲氨酸殘基和金離子發(fā)生氧化還原反應(yīng)，金離子被還原為金納米粒子，同時(shí)納米粒子表面被角蛋白酶包裹以維持穩(wěn)定狀態(tài)。有關(guān)其準(zhǔn)確的反應(yīng)機(jī)理有待未來(lái)進(jìn)一步研究確認(rèn)。

圖6 活性酶與變性酶的比較

2.4 金納米粒子的粒徑分布檢測(cè)

動(dòng)態(tài)光散射的結(jié)果如圖7所示，實(shí)驗(yàn)所得金納米粒子的粒徑大部分分布在75nm 左右，zeta 電位值為-13mV，表明其膠體的穩(wěn)定性主要來(lái)源于負(fù)電荷之間的靜電排斥。由于透射電鏡（TEM）是在粒子干燥的狀態(tài)下拍攝的，所得的粒徑是粒子的真實(shí)粒徑。動(dòng)態(tài)光散射（DLS）測(cè)量的是粒子在溶液狀態(tài)下的水合粒徑，包括粒子的核以及膨脹的膠團(tuán)。所以DLS測(cè)得的粒徑會(huì)高于其真實(shí)值，這一現(xiàn)象在其他研究中也有報(bào)道[27-28]。

圖7 金納米粒子的粒徑分布

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用角蛋白酶法所得金納米粒子的粒徑在30nm以下，PDI指數(shù)為0.29，zeta電位為-13mV，在550nm左右有明顯吸收峰。該實(shí)驗(yàn)證明有活性的角蛋白酶有助于金納米粒子的生成，并且所得金納米粒子粒徑較小，制備時(shí)間較短。該方法具有的良好的穩(wěn)定性和可操作性，為金納米粒子綠色化制備提供了一種新途徑。但是目前制備出的金納米粒子粒徑分布較寬，樣品尺度均一性仍有待進(jìn)一步改進(jìn)，后續(xù)可進(jìn)行制備條件的進(jìn)一步優(yōu)化。