生物支架系統(tǒng)在合成生物學(xué)中的應(yīng)用

王琛，趙猛，丁明珠，王穎，姚明東，肖文海

（1 天津大學(xué)合成生物學(xué)前沿科學(xué)中心，天津300072；2 天津大學(xué)系統(tǒng)生物工程教育部重點實驗室，天津300072； 3 天津大學(xué)前沿技術(shù)研究院，天津300170）

合成生物學(xué)是生物學(xué)和工程學(xué)相交叉的一門學(xué)科，在合成生物學(xué)的體系中，為了構(gòu)建具有特定生物功能的細胞工廠，需要引入多種外源基因模塊[1]。在構(gòu)建的人工底盤細胞中，通過設(shè)計復(fù)雜的催化反應(yīng)和路徑實現(xiàn)綠色反應(yīng)過程，為許多化學(xué)產(chǎn)品提供了一種更加安全環(huán)保的合成方法?，F(xiàn)階段，天然產(chǎn)物異源合成仍面臨諸多問題，其中一個重要的問題是外源基因?qū)胨拗骱笃浔磉_、定位和組裝模式存在不確定性，進而引起一系列不良效應(yīng)：異源酶的錯誤定位導(dǎo)致的酶與底物分隔，合成產(chǎn)物所需的前體被內(nèi)源競爭性路徑消耗，上下游酶之間的表達不平衡以及多種外源酶的組裝不當(dāng)導(dǎo)致的難以實現(xiàn)協(xié)同催化作用等。這些問題極大地限制了外源基因在細胞工廠中的功能發(fā)揮。

研究人員在天然系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)，參與連續(xù)反應(yīng)的酶形成多酶組裝系統(tǒng)后會極大地提高反應(yīng)效率，如在色氨酸合成酶和氨基甲酰基磷酸合成酶的催化系統(tǒng)[2]，通過酶的組裝實現(xiàn)了多酶的協(xié)同催化，提高了催化效率。受此啟發(fā)，研究人員嘗試開發(fā)出各種人工生物支架系統(tǒng)，以便將導(dǎo)入到底盤細胞中的外源蛋白按照預(yù)期設(shè)計的方式組裝到一起，形成多酶聚集的催化體系，從而提高天然產(chǎn)物的異源合成效率。隨著對支架研究的深入，研究人員已經(jīng)開發(fā)出多種多樣的生物支架系統(tǒng)，根據(jù)支架分子的核心成分可將其分為兩大類，即蛋白支架和核酸支架。其中蛋白支架是以支架蛋白為結(jié)構(gòu)核心募集目標(biāo)酶，利用蛋白-蛋白相互作用將多種酶對接形成的多酶組裝體[3]。而核酸支架是以核酸分子為支架結(jié)構(gòu)，利用DNA或RNA與酶的特異性結(jié)合，將多種酶聚集到支架結(jié)構(gòu)中，形成酶的有序組裝系統(tǒng)。另外，近年來在組織工程或生物材料工程領(lǐng)域也開發(fā)了蛋白支架系統(tǒng)，該系統(tǒng)主要應(yīng)用于組織或器官尺度的修復(fù)，此類蛋白支架組成主要是膠原蛋白或絲素蛋白高分子聚合體[4]，這與本文中提到的胞內(nèi)生物大分子尺度的蛋白支架（主要是支架蛋白質(zhì)）相比，在空間尺度和應(yīng)用領(lǐng)域方面具有顯著的區(qū)別。本綜述總結(jié)了近年來在生物支架領(lǐng)域的進展，對兩種類型的生物支架系統(tǒng)的應(yīng)用和工作機制做了詳細介紹。

1 生物支架系統(tǒng)的種類及其應(yīng)用

1.1 蛋白支架

1.1 普通型蛋白支架

來自哺乳動物中的結(jié)構(gòu)域和配體已被證明能夠在大腸桿菌和釀酒酵母等微生物中正常表達。一種經(jīng)典的蛋白支架是Dueber 等[5]將來源于小鼠的SH3和PDZ 結(jié)構(gòu)域與來源于大鼠的GBD 結(jié)構(gòu)域通過短肽連接組裝成的一個蛋白支架(GBD)x(SH3)y(PDZ)z，如圖1(a)所示。在釀酒酵母中將甲羥戊酸途徑中的三個基因AtoB、HMGS、HMGR通過相應(yīng)配體依次與蛋白支架的GBD、SH3、PDZ 三個結(jié)構(gòu)域結(jié)合，并使這些路徑編碼酶的基因受誘導(dǎo)型啟動子的異源轉(zhuǎn)錄調(diào)控，從而實現(xiàn)了工程化人工蛋白支架的構(gòu)建。通過調(diào)節(jié)支架上結(jié)構(gòu)域的數(shù)目協(xié)調(diào)多酶之間的化學(xué)計量比，從而解決了多酶組裝系統(tǒng)表達量不平衡的問題，使甲羥戊酸的產(chǎn)量提高了77 倍。該支架已成功地應(yīng)用于其他多種目標(biāo)分子的生物合成，包括葡萄糖二酸[6]、兒茶素[7]、氫氣[8]、白藜蘆醇[9]、丁酸[10]、γ-氨基丁酸[11]以及衣康酸[12]等，均獲得了良好的效果。

基于親和體的相互作用是蛋白支架進行多酶組裝常用的手段。Gao 等[13]從后生動物細胞中選擇PDZ域和相應(yīng)的配體（PDZlig）作為八聚體亮氨酸脫氫酶LDH 和二聚體甲酸脫氫酶FDH 相互作用的平臺，構(gòu)建了一個自組裝的NADH 回收系統(tǒng)。Kang 等[14]將分別來源于cAMP 獨立蛋白激酶和A 激酶錨定蛋白的兩個短肽RIAD 和RIDD 分別融合到MVA 路徑的最后一個酶idi1 和類胡蘿卜素的第一個酶CrtE 上，利用RIAD 和RIDD 的自發(fā)結(jié)合在大腸桿菌中實現(xiàn)了自組裝的酶共定位體系，使類胡蘿卜素的產(chǎn)量提高了5.7 倍。將相似的策略應(yīng)用到釀酒酵母中，使番茄紅素的產(chǎn)量提高了58%。Z結(jié)構(gòu)域親和體由于其體積小，具有快速折疊的動力學(xué)和穩(wěn)定性，是多酶組裝的合適標(biāo)簽。目前研究人員已經(jīng)研究出了靶向包括葡萄糖、HER2、Taq 聚合酶和IgA等蛋白的Z結(jié)構(gòu)域親和體[15-16]。Tippmann等[17]在釀酒酵母中利用anti-ZTaq與anti-ZIgA通過接頭連接到一起形成一個支架，分別將法尼基二磷酸合酶融合到ZTaq，法尼烯合酶融合到ZIgA，通過蛋白的親和相互作用，實現(xiàn)了這兩種酶共定位，改善了通過甲羥戊酸途徑通向法尼烯的通量，在此支架的基礎(chǔ)上添加一對ZHER2∶anti-ZHER2組成三組分支架，將藍藻來源的多羥基丁酸酯（PHB）途徑的三種酶通過蛋白支架共定位，如圖1(b)所示，在大腸桿菌中使PHB的產(chǎn)量相比于未使用支架時提高了7倍。

圖1 普通型蛋白支架示意圖

在自然界中，厭氧細菌利用一種胞外多酶復(fù)合物，又稱為纖維素體，來有效地降解植物細胞壁，如圖1(c)所示。纖維素體通常由錨定在細胞表面的蛋白支架和纖維素組成，為纖維素加工酶提供結(jié)合位點。纖維素體的細胞表面附著是通過細胞表面層同源域（SLH）所連接的Ⅱ型cohesin模塊（C Ⅱ） 連接到CipA 的Ⅱ型dockerin 模塊（D Ⅱ） 實現(xiàn)的。CipA 通過纖維素結(jié)合模塊（cellulose-binding module，CBM）與纖維素結(jié)合。CipA 包含9 種Ⅰ型cohesin 模塊，每個模塊都可以結(jié)合不同纖維素加工酶上的Ⅰ型dockerin 模塊[3]。在乳酸乳球菌中重構(gòu)嗜熱纖梭菌的dockerincohesin 支架，并利用與dockerin 模塊融合的β-葡萄糖醛酸苷酶作為探針，可以證明該支架能夠進行良好的異源表達[18]。Liu 等[19]將三種來源的的三對dockerin-cohesin 組裝到一起，在酵母表面組裝了一個類似纖維素體的三功能合成支架，隨后將乙醇脫氫酶（ADH）、甲醛脫氫酶（FALDH）和甲酸脫氫酶（FDH）按順序連接到支架上，創(chuàng)建了一個可用于甲醇氧化的三酶級聯(lián)反應(yīng)體系。如圖1(d)所示，三種脫氫酶在支架上順序組裝，形成有效的多酶組裝系統(tǒng)，從而使NADH 的生產(chǎn)效率是非支架結(jié)構(gòu)酶的5倍以上。

為了獲得最佳的酶的化學(xué)計量比或酶與支架的比例，Dueber 等[5]通過改變不同結(jié)構(gòu)域的數(shù)目來篩選出最佳支架，Stefan 等則是通過誘導(dǎo)型啟動子控制酶與支架的比例，但構(gòu)建出具有最佳構(gòu)型的蛋白支架往往需要大量的重復(fù)實驗工作，因此設(shè)計出一種更加高效便捷的蛋白支架組裝方法是十分必要的。Li等[20]構(gòu)建了一套分子零件，命名為“人工蛋白支架系統(tǒng)”（artificial protein scaffold system，AProSS）。這套系統(tǒng)不僅可以構(gòu)建簡單的融合蛋白，還可以組裝具有十多個不同成分的大型支架蛋白，同時確保每個部分的位置，從而提供了一種易于使用的方法來篩選代謝途徑中的最佳蛋白質(zhì)支架。

1.1.2 脂質(zhì)型蛋白支架

脂質(zhì)型蛋白支架是一種廣義分類，包括脂質(zhì)參與組建的支架或脂質(zhì)（膜）定位的支架。許多有用的酶，如真核細胞色素P450 酶[21]和各種萜烯合酶[22-23]都需要結(jié)合生物膜發(fā)揮催化功能，有的酶還有特定的脂質(zhì)需求，這限制了它們可以與哪些膜相互作用。將蛋白質(zhì)支架技術(shù)與生物膜相關(guān)酶兼容，則可以改善許多有價值的次級代謝產(chǎn)物的生物合成。脂質(zhì)作為構(gòu)成生物膜的主要成分，對改善支架性能具有重要作用，這主要得益于脂質(zhì)自身的特性：脂質(zhì)可以充當(dāng)膜蛋白的錨，它們也可以形成膜屏障，允許小分子選擇性地運入和運出隔室[3]。Myhrvold 等[24]將來源于φ6 噬菌體的膜蛋白P9 和非結(jié)構(gòu)蛋白P12在大腸桿菌中組裝成合成型含脂質(zhì)蛋白支架（synthetic lipid-containing scaffolds，SLSs），其中P9與脂質(zhì)形成支架，P12是裝配因子。通過將各種目標(biāo)蛋白融合到P9 的C 末端，可以使特定酶定位在該支架上，為驗證該支架的實際效果，他們將合成靛藍的兩個連續(xù)的酶通過SLS 進行共定位，觀察到靛藍產(chǎn)量明顯提高，這說明脂質(zhì)是一種可利用的支架材料。

脂質(zhì)型蛋白支架多以膜結(jié)合支架的形式存在，膜結(jié)合的支架系統(tǒng)可以通過將合成途徑限制在限定的細胞器中來更好地控制細胞內(nèi)新陳代謝的空間組織。通過特異性短肽引導(dǎo)蛋白支架定位于特定部位，可以形成具有特殊定位的蛋白支架。Lin等[25]將兩個cohesin 模塊分別融合了脂滴定位的油脂蛋白（Ole），構(gòu)建了一個脂滴定位的蛋白支架，將乙酰輔酶A合成路徑分支中的醛脫氫酶（Ald6）和乙酰輔酶A 合成酶（Acs1）分別通過支架定位于脂滴，與內(nèi)源性位于脂滴的醇-O-乙?；D(zhuǎn)移酶（Atf1）形成共定位多酶途徑，使乙酸乙酯的產(chǎn)量相比非支架途徑提高2 倍，如圖2(a)所示。油脂蛋白本身也可以在脂質(zhì)液滴中形成同聚寡聚體，調(diào)節(jié)油脂蛋白的氨基酸組成會改變脂質(zhì)液滴的形態(tài)[26]，這表明人們可以創(chuàng)造工程化的油質(zhì)蛋白支架的超復(fù)合物，甚至可能通過定制的脂質(zhì)液滴形態(tài)進一步調(diào)整支架酶的空間排列[3]。

自然界中已經(jīng)存在天然膜定位的支架結(jié)構(gòu)，如植物中木質(zhì)素的生產(chǎn)路徑[27]，通過人工改造具有天然膜定位的蛋白也可以獲得具有膜定位的蛋白支架。雙精氨酸轉(zhuǎn)位酶Tat 復(fù)合物是一種跨膜蛋白，負責(zé)將折疊的蛋白質(zhì)在植物類囊體和原核生物中跨脂質(zhì)雙層的主動轉(zhuǎn)運[28]，它包含三種必需的蛋白質(zhì)：TatA、TatB 和TatC，TatB 和TatC 蛋白成分彼此相互作用形成異二聚體。有研究人員[29]將蜀黍苷（dhurrin）合成路徑中的兩個P450 酶膜錨替換成TatB，同時將UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶通過可溶性接頭融合到TatC，如圖2(b)所示，通過構(gòu)建這個膜錨定的三酶蛋白支架，實現(xiàn)了蜀黍苷途徑酶的共定位，最終減少了副產(chǎn)物生成，使產(chǎn)品杜爾林的滴度提高了5倍。

γ-氨基丁酸（GABA）是合成尼龍的前體，可通過谷氨酸的酶促脫羧反應(yīng)制得，但是谷氨酸能夠被底盤細胞用作碳源或合成蛋白質(zhì)從而競爭性消耗，為了最大程度地減少谷氨酸向中央代謝的損失并提高谷氨酸向GABA 的轉(zhuǎn)化，Somasundaram 等[30]將谷氨酸脫羧酶固定在gadC 上，gadC 是一種大腸桿菌跨膜通道，能夠向胞內(nèi)轉(zhuǎn)入谷氨酸或向胞外轉(zhuǎn)出GABA。當(dāng)谷氨酸脫羧酶與gadC跨膜蛋白連接形成支架后，轉(zhuǎn)入胞內(nèi)的谷氨酸能夠立即被谷氨酸脫羧酶捕獲利用，使谷氨酸到GABA 的轉(zhuǎn)化率高達97%。與未使用支架表達的谷氨酸脫羧酶相比，生產(chǎn)效率提高了3.5 倍。這充分證明了生物支架系統(tǒng)在代謝產(chǎn)物合成中獨特的優(yōu)勢[3]，類似的方法已被應(yīng)用于提高釀酒酵母中木糖的利用率[31]。

相比于普通型蛋白支架，脂質(zhì)型蛋白支架在保留其原有功能的基礎(chǔ)上將構(gòu)成支架的材料擴展到脂質(zhì)，并具有更多的膜定位功能，考慮到支架中有脂質(zhì)參與，這能夠為涉及疏水性中間體或產(chǎn)物的合成提供特殊優(yōu)勢，包括脂肪酸、類固醇或生物燃料等。此外，對涉及跨膜運輸?shù)闹虚g體，通過改造轉(zhuǎn)運蛋白而形成的脂質(zhì)型蛋白支架也有十分出色的表現(xiàn)。目前由于無法控制脂質(zhì)型蛋白支架多酶復(fù)合物的化學(xué)計量比而使其應(yīng)用受到局限，開發(fā)出具有可控計量比的膜結(jié)合生物支架將會是一項重大突破[3]。

1.1.3 微室型蛋白支架

蛋白支架除了可以將目標(biāo)蛋白聚集在一起，還可通過將多酶封裝到密閉微室中，形成類似于細胞器的獨立代謝空間。研究人員已經(jīng)在真核生物的細胞器工程中取得顯著突破，F(xiàn)arhi和Avalos等[32-33]分別將線粒體作為高效生產(chǎn)天然產(chǎn)物的亞細胞工廠,Liu 等[34]在釀酒酵母的過氧化物酶體中高效表達鯊烯的代謝路徑，這說明代謝工程中的區(qū)室化策略是天然產(chǎn)物異源合成的一種有效手段，借助于微室型蛋白支架可以在原核生物中實現(xiàn)細胞中代謝路徑的區(qū)室化封裝。

天然存在的常見的微室有兩種：一種是細菌微區(qū)室（bacterial micro-compartments，BMCs）；另一種是病毒樣顆粒（virus-like particles，VLP）。細菌微區(qū)室是細胞器的原核形式，由半透性蛋白質(zhì)外殼組成。當(dāng)前，存在三類已知的細菌微區(qū)室：固定CO2的羧基體（CB）、1,2-丙二醇利用微區(qū)室（PDU）和乙醇胺利用微區(qū)室[35]。

圖2 脂質(zhì)型蛋白支架示意圖

CB 是第一個被發(fā)現(xiàn)的BMC，并且仍然是用于闡明BMC 如何在細胞中組裝和起作用的模型系統(tǒng)[36]。它的外殼由大約800個蛋白質(zhì)六聚體和12個五聚體組成，六聚體形成二十面體的小平面，五聚體形成頂點。管腔內(nèi)部是核糖1,5-雙磷酸羧化酶/加氧酶（RuBisCO）和碳酸酐酶（CA），它們與殼蛋白通過蛋白之間的相互作用被封裝到微室中。羧基體通過增加局部CO2濃度將碳固定率提高了三倍，從而克服了RuBisCO的緩慢周轉(zhuǎn)率[37]。Bonacci等[38]在大腸桿菌中構(gòu)建出模塊化碳固定微區(qū)的遺傳系統(tǒng)，這為設(shè)計獨特的固碳生物體或改善現(xiàn)有的有氧合光合器提供了參考。

PDU由7種不同類型的殼蛋白組裝而成，其中一種是PduA。PduA是殼蛋白中含量較豐富的成分之一。對來源于弗氏檸檬酸桿菌的PDU 的單個殼蛋白PduA 的C 端進行微小修飾（PduA*）可提高其溶解度[39]，當(dāng)在大腸桿菌中重組過量生產(chǎn)時，PduA*形成直徑約20nm 的空心細絲，其跨越細胞的長度，基于PduA*的絲狀結(jié)構(gòu)會提供易于束縛的支架，以束縛其他蛋白質(zhì)[40]。Lee 等[41]設(shè)計了一個由PduA*和兩個互補的卷曲螺旋肽組成的三組分系統(tǒng)，它們組成了一種相互作用的胞內(nèi)絲狀排列，從而形成了滲透整個大腸桿菌細胞質(zhì)的基質(zhì)，將其應(yīng)用于乙醇的生產(chǎn)時發(fā)現(xiàn)PduA*支架能夠聚集代謝酶從而增加其有效的局部濃度，使乙醇的產(chǎn)量得到有效提高。

病毒樣顆粒是具有自我組裝能力的多亞基蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，其總體結(jié)構(gòu)與對應(yīng)的天然病毒相同或高度相似。目前已經(jīng)構(gòu)建和鑒定了100 多種源自微生物、植物、昆蟲和哺乳動物病毒的VLP。Ty1 是在酵母中發(fā)現(xiàn)的一個反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子[42]，Han 等[43]利用Ty1 轉(zhuǎn)座子的組成成分之一Tya 蛋白形成了病毒樣的微粒。如圖3所示，將法尼烯和法尼醇合成路徑中的3 個核心酶分別與Tya 融合表達，形成一種多酶復(fù)合體，從而將法尼烯和法尼醇的產(chǎn)量分別提高了3倍和4倍。

圖3 微室型蛋白支架示意圖[43]

Patterson 等[44]開發(fā)了一種利用噬菌體P22 的衣殼蛋白封裝單個酶的方法，P22 VLP 衣殼由400 個外殼蛋白（CP）單體借助于約300個支架蛋白結(jié)構(gòu)域（SP）單體組成，通過表達CP基因和具有SP的多酶融合基因，使SP 與其連接的多酶融合體被封裝在VLP 內(nèi)部，從而實現(xiàn)了多酶的共封裝定位。當(dāng)嘗試對兩個和三個酶進行封裝時，發(fā)現(xiàn)這種VLP同樣具有良好的封裝效果，并能保持三酶偶聯(lián)系統(tǒng)的協(xié)同催化能力。

除了保持封裝到微室內(nèi)部的酶活性，形成微室后的衣殼蛋白還能夠為內(nèi)部酶的活性和穩(wěn)定性形成促進作用。Rhee 等[45]設(shè)計了一種噬菌體Qβ 病毒樣顆粒，該病毒樣顆粒利用RNA-蛋白質(zhì)的相互作用成功將熒光蛋白定位到VLP 的內(nèi)表面，封裝后的熒光蛋白具有比游離型熒光蛋白更強的激發(fā)和吸收強度，同時具有更強的耐熱性和抗蛋白酶消化能力。

1.2 核酸支架

1.2.1 RNA型支架

盡管合成蛋白型支架是多酶組裝的有用的平臺，但是隨著多酶系統(tǒng)的復(fù)雜性增加，全長和功能性蛋白支架可能難以表達。得益于核酸堿基的易于設(shè)計和合成，研究人員能夠創(chuàng)建各種基于DNA 或RNA 的納米支架以組裝多酶復(fù)合物[46]。Delebecque等[47]設(shè)計了一種RNA 模塊，該RNA 能夠自發(fā)折疊形成兩個配體結(jié)合域分別結(jié)合PP7和MS2蛋白，當(dāng)目標(biāo)蛋白融合了PP7 或MS2 蛋白后，便能夠被該RNA 支架組裝到一起。利用工程化的RNA 模塊，該作者分別組成了離散的、一維的、二維的支架結(jié)構(gòu)，并將其應(yīng)用到生物制氫的代謝路徑中，使氫的產(chǎn)量比不使用支架提高48倍。

基于RNA 的支架相比于蛋白型支架允許在納米精度上形成更加復(fù)雜多維的結(jié)構(gòu)，但同時RNA支架的應(yīng)用因RNA 結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定而受到限制，所以開發(fā)更加穩(wěn)定的支架是十分必要的。DNA 憑借其優(yōu)勢成為一種優(yōu)于RNA 的支架材料：一是DNA 支架結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性在很大程度上與序列長度無關(guān)，因此可以生成更多序列長度的支架而不會降低其穩(wěn)定性；二是自然界中存在大量不同的DNA結(jié)合蛋白，可以加以借鑒改造以生成人工支架。

1.2.2 DNA型支架

Wilner等[48]將經(jīng)過DNA寡核苷酸化學(xué)修飾的葡萄糖氧化酶（GOx）和辣根過氧化物酶（HRP）定位在通過滾環(huán)擴增（rolling circle amplification，RCA）獲得的DNA 單鏈上，并使用DNA 聚合酶重復(fù)擴增了GOx和HRP 結(jié)合序列。擴增后的DNA 鏈可使酶在較低濃度下進行多酶級聯(lián)反應(yīng)，在同樣濃度下，未組裝的酶不具有完整的級聯(lián)活性。這證明了使用DNA 支架將酶有序組裝可實現(xiàn)激活催化反應(yīng)的功能。然而，單鏈DNA 支架缺乏剛性并且可能導(dǎo)致支架的意外折疊[49]。

Wilner等[50]構(gòu)建了一種由DNA鏈條組成的二維DNA 支架的自組裝系統(tǒng)，DNA 鏈條上包含可以連接酶蛋白的“鉸鏈”。該作者分別將兩種酶或一種輔因子-酶對連接到支架上，觀察到酶級聯(lián)或輔因子介導(dǎo)的生物催化可以有效地進行，但在相同組分的擴散控制均勻混合物中沒有觀察到類似的過程。此外，由于兩種酶或輔因子-酶對的相對位置由DNA 支架的拓撲結(jié)構(gòu)決定，因此可以通過設(shè)計單個DNA 條帶來控制系統(tǒng)的反應(yīng)性。該方法可以實現(xiàn)復(fù)雜多酶級聯(lián)的自組裝。

鋅指蛋白因其獨特的結(jié)構(gòu)而具有識別雙鏈DNA 特定的9～18 個堿基對序列的能力，是一種天然存在的能夠結(jié)合DNA 的蛋白[51]。Conrado 等[52]將目標(biāo)生物合酶與鋅指蛋白ZF相融合，以DNA質(zhì)粒作為支架模板，從而構(gòu)建了以DNA 質(zhì)粒為支架的多酶組裝系統(tǒng)，如圖4(a)所示。將其應(yīng)用到白藜蘆醇、1,2-丙二醇和甲羥戊酸酯的生物合成路徑中，代謝產(chǎn)物的效價均有不同程度的提高。類似地，Lee等[53]嘗試利用DNA 型支架在大腸桿菌中重構(gòu)蘇氨酸代謝途徑，結(jié)果表明，使用支架的菌株具有更高的合成效率、更短的生產(chǎn)時間和更快的生長速度，這可能是支架系統(tǒng)降低了蘇氨酸合成途徑中高絲氨酸等有毒中間體的胞內(nèi)濃度導(dǎo)致的。

DNA 支架除了用于天然產(chǎn)物的合成，還被用于大分子聚合物的降解。以纖維素體為原型，Sun等[54]設(shè)計了一種由DNA 介導(dǎo)的四組分三酶級聯(lián)反應(yīng)的蛋白支架，他們先通過滾環(huán)擴增的方式獲得一條DNA 模板，同時將降解纖維素的酶上連接一小段DNA，該段DNA 能與模板DNA 特異性結(jié)合，從而能夠使特定連接小段DNA 的酶固定到模板DNA上，如圖4(b)所示。他們將CelA（內(nèi)切葡聚糖酶）、CelE（外切葡聚糖酶）、CBM（纖維素結(jié)合模塊）和BglA（β-葡萄糖苷酶）通過DNA 模板組裝到一起，最終使纖維素的水解效果提高了2 倍。Chen等[55]在此基礎(chǔ)上連接一個葡萄糖氧化酶（GOx），可將葡萄糖進一步轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸和H2O2。而使用五組分四酶級聯(lián)反應(yīng)的多酶復(fù)合體使過氧化氫產(chǎn)量僅提高了1.5 倍，低于僅使BglA 和GOx的共定位時所提高的11 倍，他們推測這可能與過氧化氫對酶的活性有抑制作用有關(guān)，其實這也反映了以DNA單鏈作為酶組裝支架具有的局限性，當(dāng)連接過多的酶時，可能會導(dǎo)致多酶之間的相互干擾。

基于DNA 結(jié)構(gòu)的支架可以通過簡單地改變支架上結(jié)合位點的序列，以可設(shè)計的方式控制與DNA 支架結(jié)合的酶的數(shù)量、酶的順序、酶彼此的相對角度以及每種酶的結(jié)合位點之間的距離，從而為異源酶協(xié)同代謝提供了可用的平臺。但同時，DNA 支架也有其自身的缺點，如眾多的重復(fù)序列可能導(dǎo)致質(zhì)粒發(fā)生重組導(dǎo)致設(shè)計與結(jié)構(gòu)的不一致，DNA 片段在胞內(nèi)會受到核酸酶的切割而喪失原有的結(jié)構(gòu)。另外，質(zhì)粒的超螺旋結(jié)構(gòu)可能會對酶的空間位置造成影響。

圖4 核酸基支架示意圖

無論是蛋白基支架或是核酸基支架，都有著各自的優(yōu)勢與局限性，表1總結(jié)了本文提到的主要幾種支架結(jié)構(gòu)，并做了詳細對比。

2 生物支架系統(tǒng)的作用機制

關(guān)于生物支架的作用機制目前有兩種觀點。一種觀點認為多酶組裝系統(tǒng)通過分子支架形成了“底物通道”，底物通道化是指在生物代謝過程中底物從一個酶直接轉(zhuǎn)移到另一個酶的過程。在穩(wěn)定的多酶組裝體中，反應(yīng)中間體被完全封閉在該蛋白質(zhì)的內(nèi)部通道或腔室，只能在活性位點之間定向轉(zhuǎn)移。自然界中的色氨酸合酶被認為是底物通道的一個典型例子，如圖5(a)所示，色氨酸合酶復(fù)合物的α 亞基和β亞基相結(jié)合，在兩個亞基的活性位點之間形成封閉的疏水通道，這種結(jié)構(gòu)有助于反應(yīng)中間體吲哚從α亞基快速轉(zhuǎn)移到β亞基，并催化吲哚轉(zhuǎn)化為色氨酸，產(chǎn)率接近100%[2]。底物通道化通過防止中間體在整個細胞中擴散以避免它們被競爭途徑代謝，從而提高產(chǎn)品產(chǎn)量，對于底物通道能否提高反應(yīng)速率，Sweetlove等[56]在綜述中指出，底物通道只有在擴散成為反應(yīng)速率的限制因素時它才能提高穩(wěn)態(tài)下的反應(yīng)速率，但在大多數(shù)情況下，擴散并不是反應(yīng)速率的限制因素，而之所以許多研究中都報道了支架酶使反應(yīng)速率提高數(shù)倍，這歸因于這些研究縮短了“滯后時間”。

底物通道假說解釋了一些現(xiàn)象，但也帶來了一個問題：酶只能在活性位點的半徑（0.1～1nm）內(nèi)處理擴散底物。因此，即使它們的活性位點相距僅10nm，第一種酶的產(chǎn)物也不太可能直接被第二種酶處理[57]。所以有學(xué)者提出“代謝物微域”的觀點，該觀點認為多酶組裝系統(tǒng)通過生物支架形成了類似天然存在的“代謝物微域”（metabolite microdomains）。代謝物微域定義為代謝物濃度局部升高并在穩(wěn)態(tài)下穩(wěn)定且持久的區(qū)域[58]，在微域中大部分中間體在逃逸出多酶組裝體之前迅速被轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物。如當(dāng)腺苷酸環(huán)化酶和磷酸二酯酶被支架聚集時，就會形成cAMP 微域，如圖5(b)所示，只有在微域內(nèi)，靶向cAMP的生物傳感器才能檢測到高濃度的cAMP，而當(dāng)生物傳感器均勻分布在胞質(zhì)基質(zhì)中時則無法檢測到高濃度cAMP，這表明cAMP 在微域內(nèi)外的濃度變化十分劇烈[59]。

代謝物微域假說擴展了底物通道假說的適用范圍，但該假說是否代表了已報道系統(tǒng)中的支架作用機制尚待證實。值得注意的是，該假說適用的前提是中間體在逃逸之前被及時轉(zhuǎn)化為目標(biāo)產(chǎn)物，因此需要中間體下游酶的催化速率和中間體擴散系數(shù)滿足一定的限制關(guān)系，若中間體下游酶被中間體所飽和，則代謝物微域消失，該假說將不再適用。此外，當(dāng)被支架聚集的酶的是寡聚體時，則有可能形成酶簇或酶微域(enzyme cluster or enzyme microdomain)[56]。例如，在甲羥戊酸途徑中，所涉及的酶都是二聚體，兩個亞基處于反平行方向，通過支架連接后就有可能形成超大的酶簇，如圖5(c)所示。在酶簇中，不再需要順序酶之間的特定相互作用，當(dāng)酶反應(yīng)的代謝產(chǎn)物從簇中的一種酶的活性位點擴散開時，與擴散到水性溶劑中相比，它更有可能在酶簇中遇到該途徑中的另一種酶，從而完成催化反應(yīng)。酶簇假說可以用來解釋支架酶反應(yīng)速率的提高：通過支架將酶聚集到一起，提高了酶的局部濃度，這為達到底物飽和的酶系統(tǒng)帶來了動力學(xué)益處。

表1 各類生物支架的比較

圖5 生物支架作用機制示意圖

隨著顯微技術(shù)和生物傳感器技術(shù)的發(fā)展，人們對于生物支架的作用機制將會有更進一步的了解。

3 結(jié)語

多酶的協(xié)同催化是代謝工程中難以繞開的課題，雖然可以通過簡單的酶融合實現(xiàn)兩種酶或三種酶的協(xié)同催化[60-61]，但當(dāng)涉及復(fù)雜路徑時，多酶融合可能會形成難以預(yù)測的空間結(jié)構(gòu)，融合策略就十分受限制，尤其是對于一些復(fù)雜天然產(chǎn)物的從頭合成，可能會涉及十幾個酶[62-64]，此時生物支架系統(tǒng)將會發(fā)揮重要作用。目前已發(fā)現(xiàn)一種微室型蛋白支架能夠封裝300多個酶[65]，這為封裝一整條代謝路徑提供了可能性，基于此可以在細胞內(nèi)構(gòu)建一個獨立的“細胞器”作為高效生產(chǎn)特定產(chǎn)物的人工細胞器工廠，但目前這種策略仍面臨一些問題，比如如何篩選具有合適選擇透過性的衣殼蛋白[49,58]。

除了在代謝工程領(lǐng)域的應(yīng)用，生物支架系統(tǒng)對于復(fù)雜聚合物的降解也提供了一種理論上可行的方法。研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)天然菌株中存在一種降解PET 塑料的酶[66-67]，但因其自身催化效率極低且涉及多酶協(xié)同催化，一直未能得到有效地利用，構(gòu)建胞外的類纖維素體人工蛋白支架或許可以幫助解決困擾人們的“白色污染”問題。

此外，蛋白支架在體內(nèi)信號傳導(dǎo)[49,68]、分子試劑[69]、納米材料[48]等領(lǐng)域也有廣泛應(yīng)用。在未來，將蛋白支架技術(shù)與納米技術(shù)相結(jié)合，在體內(nèi)構(gòu)建出能夠智能組裝且穩(wěn)定存在的分子機器，將會給合成生物學(xué)領(lǐng)域帶來全新的突破。