肺泡灌洗液Xpert在老年新發(fā)活動性肺結核診斷中的應用

高亮 歐勤芳 鄭建 陳華昕 于志明 陳茜 秦小雯

(無錫市第五人民醫(yī)院結核科，江蘇 無錫 214000)

活動性肺結核是指痰涂片呈陽性，有結核分枝桿菌排出，病灶仍處于活動期或呈散播病灶，說明結核桿菌繁殖活躍，毒力較強，病情較為嚴重，因此在發(fā)病早期應及時診斷以進行對癥治療控制病情，避免病灶進一步擴散〔1～3〕。肺結核發(fā)病早期無典型臨床癥狀及體征，不易被檢出，而臨床主要根據(jù)痰菌涂片、肺部影像學檢查及細菌培養(yǎng)等方法進行早期診斷，但肺部影像學僅作為一種輔助診療手段，其靈敏度較低，而痰菌涂片及細菌培養(yǎng)檢查靈敏度較高，但檢查時間較長，常導致早期治療滯后，增加疾病傳染風險〔4〕。因此，如何準確快速地完成對肺結核的檢出，以及時進行防控成為臨床廣泛關注的熱點問題。隨著支氣管鏡在肺部疾病檢查中的廣泛應用，肺泡灌洗Xpert檢測逐漸被推薦應用于臨床肺結核疾病診斷中〔5〕。Xpert是GeneXpert MTB/RIF的簡稱，其主要以半巢式實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)為基礎原理，針對MTBrpoB基因引物及探針設計，以檢測其是否發(fā)生突變，且Xpert檢測是一個全封閉的檢測系統(tǒng)，操作自動化，樣本被污染風險小，檢測快速，且不受人為因素影響，檢測準確度較高〔6,7〕。本研究分析肺泡灌洗液Xpert在老年新發(fā)活動性肺結核診斷中的應用價值。

1 資料與方法

1.1研究對象 本研究獲得醫(yī)學倫理委員會審核批準。選取無錫市第五人民醫(yī)院2018年7月至2019年11月接診的102例疑似新發(fā)活動性肺結核患者，其中男59例，女43例；年齡60～88歲，平均年齡(68.27±4.27)歲。納入標準：①胸部影像學改變考慮可能為活動性肺結核者；②三次痰菌涂片抗酸染色呈陰性者；③可行支氣管鏡檢查，并自愿簽署知情同意書者。均接受痰菌涂片、痰培養(yǎng)檢測及肺泡灌洗液Xpert檢測3項檢查。

1.2標本獲取 (1)痰液標本采集：痰液標本由患者自行采集，囑咐患者留痰液前清水漱口，從肺部深處用力咳出痰液，使用一次性醫(yī)用無菌杯子送檢，每份標本量在3～5 ml，以進行痰菌涂片、痰培養(yǎng)。(2)肺泡灌洗液采集：先采用支氣管鏡進行檢查，根據(jù)肺部影像學檢查結果，將發(fā)生病變支氣管作為肺泡灌洗部位，將10～20 ml生理鹽水經(jīng)支氣管鏡灌入病變支氣管中，重復此項操作2～3次后，采集肺泡灌洗液20 ml，分別置于3個試管中，離心處理后置于無菌瓶中保存?zhèn)錂z。

1.3檢測方法 (1)痰菌涂片：取適量痰液涂于1 cm×2 cm載玻片，烘干，對標本進行萋-尼抗酸染色，參照《痰涂片鏡檢標準化操作及質量保證手冊》〔8〕中相關標準及程序采用顯微鏡進行鏡檢。(2)痰培養(yǎng)：采用改良羅氏培養(yǎng)基進行分枝桿菌培養(yǎng)，并參照《分枝桿菌分離培養(yǎng)標準化操作程序及質量保證手冊》〔9〕相關實驗室操作程序實施，取適量標本置入濃度為4%的氫氧化鈉溶液中，振蕩靜置20 min后，使用無菌吸取100 μl置于準備好的培養(yǎng)基上，將其放于溫度為37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每周觀察1次，并記錄培養(yǎng)結果，若連續(xù)8 w后仍未出現(xiàn)菌落生長，則判定為陰性。(3)肺泡灌洗液Xpert檢測：取無菌瓶中備用肺泡灌洗液5 ml與含有氫氧化鈉、異丙醇的處理液(2∶1)混合均勻，室溫下放置15 min后，打開反應盒，使用無菌吸管吸取2 ml處理后樣品經(jīng)打樣孔加入反應盒中，放于檢測模塊，采用美國Cepheid公司生產(chǎn)的GeneXpert MTB/RIF檢測系統(tǒng)及相應試劑盒進行自動化檢測，儀器可自動對樣本進行過濾和洗滌，將超聲溶菌中釋放的DNA與PCR試劑混合，半巢式實時擴增及檢測熒光信號。2 h后系統(tǒng)給出檢測結果。結果判定標準：CT值≤38即為陽性，5個探針中至少出現(xiàn)2個探針CT值在38及以下則確診檢測到結核分枝桿菌。

1.4觀察指標 以2018年實施的中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準《肺結核診斷(WS 288-2017)》〔10〕中病原學或病理學證據(jù)、涂片、痰培養(yǎng)等臨床診斷為金標準，對比痰菌涂片、痰培養(yǎng)檢測及肺泡灌洗液Xpert檢測3種檢測的診斷結果，分析靈敏度、特異度、準確度、陽性預測值、陰性預測值及Kappa值。

1.5統(tǒng)計學方法 采用SPSS23.0統(tǒng)計學軟件進行χ2檢驗及一致性檢驗。

2 結 果

2.1臨床診斷結果 102例疑似病例中，經(jīng)臨床診斷最終確診71例新發(fā)活動性肺結核，非新發(fā)活動性肺結核31例(其中肺炎18例，肺間質性肺病3例，慢性阻塞性肺疾病1例，支氣管擴張5例，其他4例)。

2.2痰菌涂片、痰培養(yǎng)及肺泡灌洗液Xpert檢測結果 以臨床診斷為金標準，痰菌涂片、痰培養(yǎng)、肺泡灌洗液Xpert靈敏度分別為49.30%、63.38%、83.10%，3種檢測方法的靈敏度差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；3種檢測特異度、準確度、陽性預測值及陰性預測值比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。經(jīng)一致性檢驗，3種檢測方法結果與金標準結果Kappa值分別為0.339、0.444、0.630，其中肺泡灌洗液Xpert與金標準一致性最高。見表1～4。

表1 痰菌涂片檢測結果(n)

1)新發(fā)活動性肺結核，2)非新發(fā)活動性肺結核；表2，表3同

表2 痰培養(yǎng)檢測結果(n)

表3 肺泡灌洗液Xpert檢測結果(n)

表4 痰菌涂片、痰培養(yǎng)及肺泡灌洗液Xpert診斷效能比較〔%，(n/n)〕

3 討 論

肺結核作為一種慢性傳染性疾病，發(fā)病較為隱匿，導致臨床早期診斷易出現(xiàn)誤診及漏診情況，影響早期治療，增加傳染風險，故早期診斷檢出肺結核并及時給予有效的治療尤為重要〔11〕。實驗室檢測是目前診斷肺結核的重要依據(jù)之一，同時也是檢測傳染源的主要手段及途徑，而痰菌涂片及痰培養(yǎng)技術是當前臨床診斷肺結核疾病的主要手段，其中痰菌涂片檢測具有快速、簡單特點，但臨床診斷靈敏度較低，存在較高漏診及誤診風險，而痰培較痰菌涂片檢測靈敏度有所提高，但檢測較為復雜，耗時較長，需要在6～8 w才出診斷結果，且培養(yǎng)過程中易受到外界及人為因素的影響，易影響檢測結果，致使臨床早期確診難度較大〔12，13〕。

隨著新型分子生物學技術不斷發(fā)展與進步，Xpert快速檢測方法已應用于臨床肺結核診斷中，該項技術主要由美國Cepheid公司研發(fā)，在經(jīng)人工處理標本后，使用定量核酸擴增儀提取DNA、核酸擴增及靶標測全自動完成檢測，整個檢測僅需2 h即可完成，避免了復雜操作程序，減少交叉污染風險，可減少外界因素對檢測的干擾，檢測準確定更高〔14，15〕。本研究說明與傳統(tǒng)的痰菌涂片及痰培養(yǎng)檢測相比，肺泡灌洗液Xpert檢測技術在老年新發(fā)活動性肺結核臨床輔助診斷中具有更高的應用價值。秦志華等〔7〕在相關研究中發(fā)現(xiàn)，肺泡灌洗液中Xpert MTB/RIF檢測靈敏度、特異度均較高，對肺結核有較高的早期快速診斷價值，與本研究結果相似。但該研究主要以痰培養(yǎng)結果作為診斷金標準，對Xpert診斷結果進行效能評價，會出現(xiàn)漏診經(jīng)病理活檢及支氣管鏡檢查最終確診的肺結核患者，而本研究中以臨床診斷作為金標準，對3種不同檢測方法進行診斷效能評估，更加客觀地反映Xpert檢測在新發(fā)活動性肺結核臨床診斷中價值。此外，采用纖維支氣管鏡檢查方式獲取的肺泡灌洗液中抗酸結核桿菌率要高于痰液標本獲取率，則利于進一步提高新發(fā)活動性肺結核診斷靈敏度〔16〕。因此，肺泡灌洗液Xpert檢測作為一種簡便、快速、系統(tǒng)自動化、不受人為因素影響的分子診斷方法，在老年新發(fā)活動性肺結核診斷中具有較高的應用價值。且Xpert檢測僅在檢測早期需要人為進行標本處理，其他檢測操作均由系統(tǒng)自動化自主完成，不僅有效節(jié)省臨床診斷時間，盡快確診進行針對性治療，降低傳染性，還可減少醫(yī)學檢測過程中感染風險，具有較高的生物安全性〔17〕。