KCNE2、KCNE3基因多態(tài)性與新疆漢族老年人房顫的相關(guān)性

帕力達(dá)·阿不力孜 張雷 卡比努爾·克依木 苗海軍

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830000)

心房顫動(AF)是最常見的臨床心律失常形式，在65歲以上的老年人中發(fā)生率高于5%，且發(fā)病呈年輕化趨勢〔1〕。AF除了其本身危害外，還能引起致命的并發(fā)癥，如腦血栓和腦卒中等〔2〕。AF的發(fā)病機(jī)制大致分為兩種：異位沖動形成和心房折返學(xué)說，但其確切機(jī)制尚未明確〔3〕。近年來，從基因、離子通道等方面對AF發(fā)病機(jī)制研究取得了重大進(jìn)展。研究表明，分布于心肌細(xì)胞上的通道基因與生命活動密切相關(guān)，其單核苷酸多態(tài)性與離子通道的重構(gòu)、心房肌細(xì)胞的動作電位有極大關(guān)聯(lián)性〔4,5〕。遺傳連鎖分析已經(jīng)鑒定了染色體10q22-24，6q14-16，5p13和11p15.5上的AF基因座〔6〕。其中在11p15.5中，鑒定了遺傳缺陷并發(fā)現(xiàn)其涉及鉀離子通道蛋白基因(KCNQ)1中的雜合錯義突變，KCNQ1-鉀離子通道β亞基(KCNE)1和KCNQ1-KCNE2離子通道的功能增益導(dǎo)致緩慢性延遲整流鉀電流(Iks)〔7〕。利用候選基因方法，將KCNE2中的功能獲得性突變編碼導(dǎo)入內(nèi)向整流鉀電流(Ik1)的離子通道，發(fā)現(xiàn)與兩家族的家族性AF相關(guān)〔8〕。由此可見，KCNE家族基因在AF的發(fā)生和進(jìn)展中有重要作用。關(guān)于AF的遺傳易感性知之甚少。通過遺傳學(xué)研究方法分析基因突變導(dǎo)致AF的機(jī)制研究有助于理解AF的分子機(jī)制和所導(dǎo)致的電生理改變。本研究擬探討KCNE2 和 KCNE3 基因單核苷酸多態(tài)性與AF的相關(guān)性，以期為新的診療手段和方法提供思路。

1 資料與方法

1.1研究對象 納入本研究的AF患者(AF組)均為中國漢族人，樣本間無血緣關(guān)系，主要來自2013～2015年在新疆南疆和田地區(qū)墨玉縣、和田縣的5個鄉(xiāng)鎮(zhèn)，烏魯木齊市新農(nóng)大社區(qū)、和鋼社區(qū)，抽取有常住戶口者、年齡≥55歲者，共計251例，特發(fā)性AF 11例，器質(zhì)性AF 240例。從醫(yī)院體檢的體格檢查和心電圖檢查證實(shí)均無AF的個體中選取251例為對照組。兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。AF的診斷標(biāo)準(zhǔn)：包括病史、體表和24 h動態(tài)心電圖診斷。心電圖診斷標(biāo)準(zhǔn)為：P 波消失，代之以f波，特征為振幅、形態(tài)、節(jié)律不一，頻率為 350～600 次/min，心室節(jié)律(R-R間距)通常絕對不規(guī)則。 排除標(biāo)準(zhǔn)：排除家族性AF，排除合并瓣膜型心臟病、甲狀腺功能亢進(jìn)、心肌病、先天性心臟病、慢性肺源性心臟病、起搏器術(shù)后或心臟器質(zhì)性疾病手術(shù)后等樣本。研究過程中所涉及的資料收集及血樣采集均獲得研究對象和家人的同意，并簽署知情同意書。

表1 兩組一般資料比較

1.2單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)的選擇 采用標(biāo)簽SNP策略選擇KCNE2和KCNE3 基因的SNP位點(diǎn)進(jìn)行其與AF的相關(guān)性研究：首先在NCBI中SNP 數(shù)據(jù)庫(http//：www.ncbi.nlm.nib.gov/SNP)中以KCNE2/KCNE3和homo為關(guān)鍵詞找到人類 KCNE2 基因SNP位點(diǎn)為2 375個，KCNE3基因SNP位點(diǎn)為3 361個。在國際人類基因組單體型圖計劃HapMap Project 網(wǎng)頁中(http//：www.hapmap.org)下載有關(guān)45個獨(dú)立的中國漢族北京居民 KCNE2和KCNE3基因的數(shù)據(jù)，并進(jìn)行SNP標(biāo)簽的選取。按照次等位基因頻率>0.15，最小連鎖不平衡相關(guān)程度(r2)值>0.8使用Haploview 軟件(https：//sourceforge.net/projects/haploview/)進(jìn)行標(biāo)簽 SNP 的篩選。最終選擇了符合標(biāo)準(zhǔn)的KCNE3基因rs9516、rs10898993、rs3867279位點(diǎn)和KCNE2基因rs9984281位點(diǎn)與新疆漢族老年人進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1患者外周血DNA的提取 外周血(ACD 抗凝采血管采集)DNA 的提取采用上海生工生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的磁珠法 DNA 提取試劑盒。

1.3.2實(shí)驗(yàn)引物設(shè)計 引物采用Peimer6.0自行設(shè)計后送上海生工生物技術(shù)有限公司合成，引物序列信息見表2。

表2 KCNE2和KCNE3 基因的SNP位點(diǎn)引物

1.3.3聚合酶鏈反應(yīng)體系(PCR) PCR反應(yīng)總體系為25 μl，其中DNA模板1 μl，10×Taq緩沖液(Takara) 2.5 μl，2.5 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)0.3 μl，上下游引物各1 μl，10 mmol/L氯化鎂(MgCl2) 1 μl，Taq DNA聚合酶0.1 μl，去離子水11 μl。按順序依次加入后混勻。PCR 擴(kuò)增條件：預(yù)變性：95℃×4 min；變性：95℃×20 s，退火：58℃×30 s，延伸：72℃×30 s，30個循環(huán)；最后延伸：72℃×5 min；10℃保存。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用GraphPad Prism5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，對AF組和對照組基因型、等位基因頻率的比較及判斷是否符合Hardy-Weinberg平衡采用χ2檢驗(yàn)；采用SHEsis在線軟件(網(wǎng)址為http：//analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php.) 進(jìn)行連鎖不平衡分析和單倍型分析；運(yùn)用廣義多因子降維(GMDR)軟件對4個 SNPs 位點(diǎn)進(jìn)行交互作用分析，選擇最佳基因交互作用模型；采用MDR軟件畫出各SNP位點(diǎn)交互作用樹狀圖節(jié)點(diǎn)圖，確定其交互作用是拮抗還是協(xié)同作用，并找出高危和低?；蛐徒M合。

2 結(jié) 果

2.1各位點(diǎn)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn) rs9984281位點(diǎn)僅在AF組不符合Hardy-Weinberg平衡(P<0.05)，rs9516、rs10898993、rs3867279位點(diǎn)AF組和對照組均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，見表3。

表3 各位點(diǎn)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)(n，n=251)

2.2各位點(diǎn)的基因型、等位基因頻率分布及與老年AF的關(guān)聯(lián)性 502例漢族人群中KCNE3基因rs9516、rs10898993位點(diǎn)存在(AA，AG，GG)三種基因型，基因型及等位基因頻率在兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；rs3867279位點(diǎn)存在(CC，CT，TT)三種基因型，基因型及等位基因頻率在兩組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，CT、TT基因型和T等位基因可降低老年人AF發(fā)生危險性。KCNE2基因rs9984281位點(diǎn)存在(AA，AG，GG)三種基因型，基因型及等位基因頻率在兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 各位點(diǎn)基因型、等位基因頻率分布及與老年AF的關(guān)聯(lián)性〔n(%)，n=251〕

2.3多因子降維法(MDR)分析 對KCNE3基因rs9516、rs10898993、rs3867279位點(diǎn)及KCNE2基因rs9984281位點(diǎn)進(jìn)行MDR分析，基因交互作用結(jié)果見表5，四種模型中三種模型有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，因?yàn)閮梢蜃幽Ｐ偷臋z驗(yàn)樣本精確度最高0.620 1，交叉驗(yàn)證一致性為10/10，檢驗(yàn)樣本精確度與交叉驗(yàn)證一致性值越大說明模型越好，故兩因子模型為最佳模型，且P=0.001 0，模型具有統(tǒng)計學(xué)意義，表明這兩個SNP位點(diǎn)的交互作用與老年AF的發(fā)生可能相關(guān)聯(lián)。

圖1為各SNP位點(diǎn)交互作用的樹狀圖，從其顏色可判斷KCNE3基因rs10898993位點(diǎn)與KCNE2基因rs9984281位點(diǎn)之間存在較強(qiáng)的正交互作用，即協(xié)同作用，其他位點(diǎn)之間交互作用不明顯。圖2為KCNE3基因rs10898993位點(diǎn)與KCNE2基因rs9984281位點(diǎn)不同基因型組合方式對老年人AF發(fā)生的風(fēng)險，圖中深灰色的方格代表高?；蛐徒M合，淺灰色的方格代表低?；蛐徒M合，每個格子中左側(cè)柱代表的是具有此種基因型組合的患有AF的老年人例數(shù)，右側(cè)柱子代表的是正常老年人例數(shù)。可見rs10898993位點(diǎn)和rs9984281位點(diǎn)所組成的AA/AA、AG/AG、GG/AG和GG/GG基因型組合為高危基因型組合，AG/AA、GG/AA、AG/AA、AA/GG和AG/GG基因型組合為低?；蛐徒M合。

表5 基因交互作用最佳模型

圖1 各基因SNP位點(diǎn)交互作用

圖2 rs10898993和rs9984281交互模型高危和低?；蛐偷姆植?/p>

3 討 論

AF是臨床實(shí)踐中最常見的心律失常，大多數(shù)AF患者患有冠心病、心臟瓣膜病、高血壓或左心室功能不全〔9〕。然而，10%～30%的AF患者在沒有任何已知危險因素的情況下發(fā)生AF。研究已經(jīng)確定了大量家系中一系列通道基因的突變，這種結(jié)果表明AF的發(fā)展和維持存在遺傳傾向〔10〕。

SNP是人類基因組上最常見的單個核苷酸的變異，對了解和認(rèn)識復(fù)雜遺傳性狀有重要作用。通過確定基因SNP位點(diǎn)分型與疾病相關(guān)性，對認(rèn)識疾病的遺傳易感性和鑒定疾病的致病基因有重要作用〔11，12〕。如某些突變位點(diǎn)的基因型在特定地域和特定種族人群中表達(dá)有很大差異，或在不同種族中等位基因型和基因頻率差異性顯著。如李琳等〔13〕研究表明漢、維吾爾族人群血管緊張素原等位基因頻率差異有統(tǒng)計學(xué)意(χ2=14.742，P<0.001)。另一項(xiàng)研究選擇了構(gòu)成電壓門控(Kv)鉀通道的調(diào)節(jié)基因：KCNE2和KCNE3基因，結(jié)果表明KCNE2和KCNE3基因的5個位點(diǎn)在新疆漢族和維吾爾族AF患者中基因型和等位基因分布頻率比較差異均沒有統(tǒng)計學(xué)意義〔14〕。KCNE蛋白家族KCNE1-KCNE5構(gòu)成Kv鉀通道的調(diào)節(jié)劑，并且其中KCNE1和KCNE3已被證明參與心律失?！?5〕。KCNE1突變可能導(dǎo)致Jervell和Lange-Nielsen疾病，編碼minK相關(guān)肽(MiRP)1的KCNE2突變與藥物誘導(dǎo)的心律失常，長QT綜合征(功能喪失表型)和AF(功能獲得表型)有關(guān)〔16，17〕。KCNE蛋白是100～200個氨基酸的多肽鏈。它們均包含一個細(xì)胞外N端結(jié)構(gòu)域、一個假定的跨膜區(qū)段和一個細(xì)胞內(nèi)C端。這些不同的結(jié)構(gòu)修飾不同的K+通道的功能〔18〕。KCNE1蛋白質(zhì)minK賦予IKs特征性緩慢激活。單個KCNE蛋白與K+離子通道α-亞基之間的相互作用不是特異性的。因此，minK與KCNQ1和心臟鉀離子通道(HERG)相互作用，而KCNE1-3蛋白與Kv3.1和Kv3.2相互作用，導(dǎo)致通道門控鉀通道多樣化〔19〕。其他通道也與KCNE蛋白相互作用，但這種相互作用在體內(nèi)的功能意義尚未闡明。研究表明，所有KCNE基因均在心臟中表達(dá)，對調(diào)節(jié)離子通道功能及心肌細(xì)胞動作電位的形成具有非常重要的作用〔20〕。不同KCNE基因之間的平衡對Kv通道具有不同影響的KCNE蛋白可以實(shí)現(xiàn)IKs和其他K+電流的可變調(diào)節(jié)。本研究的結(jié)果證明了AF患者中鉀通道基因的重要作用，但AF患者的分子缺陷和細(xì)胞機(jī)制仍有待研究。Yang 等〔21〕收集了28個不相關(guān)中國家族AF患者資料，并對8個鉀通道基因(KCNQ1，HERG，KCNE1，KCNE2，KCNE3，KCNE4，KCNE5和KCNJ2)進(jìn)行了測序。在兩個家族中發(fā)現(xiàn)KCN2的第27位(R27C)的精氨酸-半胱氨酸突變和負(fù)責(zé)背景鉀電流的KCNQ1-KCNE2通道的β亞基。這兩個家族中的所有受影響成員都存在突變。與KCNQ1 S140G相似，該突變對KCNQ1-KCNE2通道具有功能獲得效應(yīng)；與長QT綜合征相關(guān)的KCNE2突變不同，它不會改變HERG-KCNE2電流。該突變也沒有改變HCN通道家族的功能。因此，KCNE2 R27C是與AF的起始和(或)維持相關(guān)的功能獲得突變。人KCNE3基因內(nèi)的突變與早發(fā)孤立性和家族性AF有關(guān)。AF的心律失常發(fā)展可能涉及KCNE3和相關(guān)Kv通道亞基的異向心房Kv通道電流的內(nèi)在心肌破壞〔22，23〕。目前AF發(fā)生和維持的機(jī)制尚未完全闡明，鉀離子通道基因多態(tài)性與AF的發(fā)生和進(jìn)展有相關(guān)性，這已經(jīng)成為AF機(jī)制研究新的切入點(diǎn)。隨著分子生物學(xué)手段和技術(shù)的日新月異，與AF相關(guān)的基因和位點(diǎn)將會被更多的發(fā)現(xiàn)，進(jìn)一步通過位點(diǎn)或基因的聯(lián)合分析，為不同種族和地區(qū)AF的治療提供新思路、新靶點(diǎn)。