NaHSO3對兩種微藻生長及胞外多糖和藻膽蛋白含量的影響*

梁 英， 閆譯允， 黃徐林,2, 田傳遠(yuǎn)， 胡乃霞， 王 帥

(1. 海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國海洋大學(xué))， 山東 青島 266003； 2. 廣東海大集團(tuán)股份有限公司， 廣東 廣州511400;3. 海洋活性物質(zhì)與現(xiàn)代分析技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(自然資源部第一海洋研究所)， 山東 青島 266061)

近年來，微藻因富含多種生物活性物質(zhì)而逐步成為開發(fā)醫(yī)療藥物、保健品等高附加值產(chǎn)品的重要原料[1-3]。與其它生物藥物原料相比，微藻具有生長繁殖迅速、適應(yīng)能力強(qiáng)、可大規(guī)模培養(yǎng)等優(yōu)勢[4-5]。眾多研究表明，微藻活性物質(zhì)應(yīng)用于醫(yī)療保健領(lǐng)域潛力巨大，其中，微藻胞外多糖和藻膽蛋白是一類重要的生物活性物質(zhì)[6-7]，因其具有抗腫瘤、降血糖、抗氧化及抗輻射等諸多藥用價(jià)值而逐步成為國內(nèi)外研究熱點(diǎn)[8-12]。這些活性物質(zhì)含量變化很大程度上與微藻種類及培養(yǎng)條件有關(guān)[3]。因此，研究影響微藻活性物質(zhì)積累的因子具有重要意義。

NaHSO3是一種成本低廉、安全環(huán)保且效果明顯的光合作用促進(jìn)劑[13]。目前，已有不少國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了NaHSO3對農(nóng)作物光合作用促進(jìn)效應(yīng)的研究，研究結(jié)果均表明，一定濃度的NaHSO3能夠提高農(nóng)作物光合速率，促進(jìn)光合產(chǎn)物積累，增加農(nóng)作物產(chǎn)量并改善其品質(zhì)[14-18]。近年來，將NaHSO3應(yīng)用于微藻的研究也逐漸開展起來[19-20]。Wang等[19]研究發(fā)現(xiàn)，低濃度NaHSO3可促進(jìn)集胞藻PCC6803(Synechocystissp. PCC6803)的光合放氧速率和細(xì)胞干重增加。程建峰等[20]研究發(fā)現(xiàn)一定濃度的NaHSO3能夠促使鹽生杜氏藻(Dunaliellasalina)胞內(nèi)葉綠素含量上升，進(jìn)而提高其光合速率。

紫球藻(Porphyridiumviolaceum)屬于紅毛菜目(Bangiales)紫球藻科(Porphyridiaceae)紫球藻屬(Porphyridium)[21]。藍(lán)隱藻(Chroomonasplacoidea)屬于隱藻目(Cryptomonadales)隱鞭藻科(Cryptomonadaceae)藍(lán)隱藻屬(Chroomonas)[22]。研究表明，紫球藻和藍(lán)隱藻在生長過程中會(huì)產(chǎn)生硫酸酯多糖、β-藻紅蛋白、花生四烯酸和藻膽蛋白等多種活性物質(zhì)，具有較高經(jīng)濟(jì)和藥用價(jià)值[23-25]。目前，有關(guān)NaHSO3對紫球藻和藍(lán)隱藻生長影響的報(bào)道尚未見到。本實(shí)驗(yàn)以紫球藻和藍(lán)隱藻為研究對象，探究不同濃度NaHSO3對其生長、葉綠素?zé)晒馓匦?、胞外多糖和藻膽蛋白含量的影響，篩選出對紫球藻和藍(lán)隱藻生長及相關(guān)活性物質(zhì)積累的最適NaHSO3濃度，以期為2種微藻的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻種

實(shí)驗(yàn)所用紫球藻(PorphyridiumviolaceumMACC/R17)和藍(lán)隱藻(ChroomonasplacoideaMACC/T11)藻種均取自中國海洋大學(xué)微藻種質(zhì)庫。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別設(shè)定紫球藻和藍(lán)隱藻的NaHSO3濃度，其中紫球藻的NaHSO3濃度設(shè)定為0(對照組)、0.25、0.5、1、2和3 mmol/L，藍(lán)隱藻的NaHSO3濃度設(shè)定為0(對照組)、0.06、0.12、0.24、0.48和0.96 mmol/L，每個(gè)濃度梯度設(shè)置3個(gè)平行。實(shí)驗(yàn)藻種的培養(yǎng)在500 mL錐形瓶中進(jìn)行，培養(yǎng)條件為：溫度(23±1)℃，鹽度32，光照強(qiáng)度60 μmol·m-2·s-1，光周期18L∶6D，采用連續(xù)充氣培養(yǎng)。定時(shí)(次/2d)定量(5 mL/次)取樣，測定細(xì)胞密度和葉綠素?zé)晒鈪?shù)，培養(yǎng)結(jié)束后測定細(xì)胞干重及胞外多糖和藻膽蛋白含量。

1.3 細(xì)胞密度測定

分別采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法和血球計(jì)數(shù)板法對紫球藻和藍(lán)隱藻進(jìn)行細(xì)胞密度測定。

1.4 細(xì)胞干重測定

紫球藻通過建立光密度值與干重之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行細(xì)胞干重的測定；藍(lán)隱藻通過取適量藻液，進(jìn)行離心(離心條件為4 000 r/min，10 min)、砂芯過濾器抽濾收獲，冷凍干燥后直接稱其干重。

1.5 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定

按照梁英等[26]的方法，用Water-PAM水樣葉綠素?zé)晒鈨x進(jìn)行葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定。測定的參數(shù)包括Fv/Fm(最大光能轉(zhuǎn)化效率)、rETR(相對電子傳遞速率)、qP(光化學(xué)淬滅系數(shù))及NPQ(非光化學(xué)淬滅系數(shù))。

1.6 胞外多糖和藻膽蛋白測定

分別采用濃硫酸-苯酚法[27]和蛋白試劑盒進(jìn)行胞外多糖和藻膽蛋白含量的測定。

1.7 數(shù)據(jù)處理

用Origin8.5軟件繪圖，SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和多重比較，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度NaHSO3對紫球藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

圖1表示不同濃度NaHSO3對紫球藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響。單因子方差分析結(jié)果顯示，不同濃度NaHSO3對該藻各葉綠素?zé)晒鈪?shù)(Fv/Fm、rETR、qP、NPQ)均有顯著影響(P<0.05)。由圖1可知，對照及各處理組的Fv/Fm值隨培養(yǎng)時(shí)間增加整體呈下降趨勢，多重比較結(jié)果表明，0.5 mmol/L處理組的該參數(shù)隨培養(yǎng)時(shí)間變化不顯著(P>0.05)，且在第8～12 天顯著高于對照及其他處理組；高濃度處理組(2～3 mmol/L)的Fv/Fm值下降幅度較大，在第4～12天顯著低于對照及低濃度處理組(0.25～1 mmol/L)。第6～12天，0.5 mmol/L處理組的rETR值顯著高于對照及其他處理組，0.25和1 mmol/L處理組的該參數(shù)與對照組差異不顯著(P>0.05)；第8～12 天，高濃度處理組(2～3 mmol/L)的rETR值顯著低于對照組。第10～12 天，低濃度處理組(0.25～1 mmol/L)的qP值顯著高于對照及高濃度處理組(2～3 mmol/L)，且3 mmol/L處理組的qP值最小，其次是2 mmol/L處理組。對照及各處理組的NPQ值隨培養(yǎng)時(shí)間增加整體呈上升趨勢，其中，高濃度處理組(2～3 mmol/L)的該參數(shù)上升幅度較大，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，上述處理組的NPQ值顯著高于對照及低濃度處理組(0.25～1 mmol/L)。

2.2 不同濃度NaHSO3對紫球藻細(xì)胞密度、干重、胞外多糖和藻膽蛋白含量的影響

圖2反映了不同濃度NaHSO3對紫球藻細(xì)胞密度、干重、胞外多糖和藻膽蛋白含量的影響。由圖2可知，在整個(gè)培養(yǎng)周期中，對照及各處理組的細(xì)胞密度均呈上升趨勢，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，細(xì)胞密度由大到小順序?yàn)?.5 mmol/L處理組>1 mmol/L處理組>0.25 mmol/L處理組>對照組>2 mmol/L處理組>3 mmol/L處理組，其中，0.5 mmol/L處理組細(xì)胞密度最大，比對照組增加了36.0%，顯著高于對照及其他處理組；而高濃度NaHSO3(2～3 mmol/L)則顯著抑制該藻細(xì)胞密度增加。由圖2可知，0.25～0.5 mmol/L濃度NaHSO3能促進(jìn)紫球藻干重、胞外多糖和藻膽蛋白含量增加，其中，NaHSO3濃度為0.5 mmol/L時(shí)促進(jìn)效果最佳，該處理組的上述參數(shù)分別比對照組增加了19.1%、71.8%和69.0%，顯著高于對照及其他處理組；1 mmol/L處理組與對照組差異不顯著(P>0.05)；而高濃度處理組(2～3 mmol/L)的細(xì)胞干重、胞外多糖和藻膽蛋白含量均顯著小于對照及低濃度處理組(0.25～1 mmol/L)，說明NaHSO3濃度為2～3 mmol/L時(shí)抑制紫球藻干重的增加及胞外多糖和藻膽蛋白的合成。

圖1 不同濃度NaHSO3對紫球藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

(abcd表示方差分析差異程度，相同字母表明處理組間差異不顯著；不同字母表明處理組間差異顯著(P<0.05)。abcd indicates variance analysis in the difference degree, the same letters are no significantly different from each other; the different letters are significantly different from each other (P<0.05).)

圖2 不同濃度NaHSO3對紫球藻細(xì)胞密度、干重、胞外多糖和藻膽蛋白含量的影響

Fig.2 Effects of different NaHSO3concentrations on the cell density, dry weight, exopolysaccharide
and phycobiliprotein contents ofP.violaceum

2.3 不同濃度NaHSO3對藍(lán)隱藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

不同濃度NaHSO3對藍(lán)隱藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm、rETR、qP和NPQ的影響見圖3。單因子方差分析結(jié)果表明，不同濃度NaHSO3對上述參數(shù)均有顯著影響(P<0.05)。由圖3可知，對照及各處理組的Fv/Fm值隨培養(yǎng)時(shí)間增加均呈下降趨勢，其中，高濃度處理組(0.48～0.96 mmol/L)的該參數(shù)下降幅度較大；多重比較結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，低濃度處理組(0.06～0.24 mmol/L)的Fv/Fm值顯著高于對照及高濃度處理組(0.48～0.96 mmol/L)，其中，0.12 mmol/L處理組的Fv/Fm值最大。第12～14 天，0.12～0.24 mmol/L處理組的rETR和qP值均顯著高于對照及高濃度處理組(0.48～0.96 mmol/L)，其中，0.12 mmol/L處理組的上述參數(shù)值最大。不同濃度NaHSO3對熒光參數(shù)NPQ的影響隨培養(yǎng)天數(shù)的不同而變化，第8～14 天，0.96 mmol/L處理組的NPQ值呈下降趨勢，與對照及其他處理組的變化趨勢相反；第12～14 天，0.48 mmol/L處理組的NPQ值最大，低濃度處理組(0.06～0.24 mmol/L)及0.96 mmol/L處理組的該參數(shù)顯著低于對照組，其中，0.96 mmol/L處理組的NPQ值最低。

圖3 不同濃度NaHSO3對藍(lán)隱藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

2.4 不同濃度NaHSO3對藍(lán)隱藻細(xì)胞密度、干重、胞外多糖和藻膽蛋白含量的影響

圖4反映了藍(lán)隱藻在不同濃度NaHSO3培養(yǎng)條件下細(xì)胞密度、干重、胞外多糖和藻膽蛋白含量的變化趨勢。由圖4可知，低濃度NaHSO3(0.06～0.24 mmol/L)顯著促進(jìn)藍(lán)隱藻細(xì)胞密度增加，其中，NaHSO3濃度為0.12 mmol/L時(shí)促進(jìn)效果最佳，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，該組細(xì)胞密度比對照組增加了60.8%；而高濃度NaHSO3(0.48～0.96 mmol/L)則顯著抑制該藻細(xì)胞密度增加。由圖4可知，藍(lán)隱藻干重、胞外多糖和藻膽蛋白含量隨NaHSO3濃度增加均呈先上升后下降的趨勢。低濃度NaHSO3(0.06～0.24 mmol/L)能促進(jìn)藍(lán)隱藻細(xì)胞干重及藻膽蛋白含量增加，其中，0.12 mmol/L濃度NaHSO3的促進(jìn)效果最佳，該組的干重和藻膽蛋白含量分別比對照組增加了45.4%和53.1%；而高濃度NaHSO3(0.48～0.96 mmol/L)則不利于該藻細(xì)胞干重增加和藻膽蛋白的合成。0.06～0.48 mmol/L濃度NaHSO3均能促進(jìn)藍(lán)隱藻胞外多糖含量增加，其中，0.12 mmol/L處理組的胞外多糖含量最大，比對照組增加了60.0%，顯著高于對照及其他處理組；0.96 mmol/L處理組的胞外多糖含量最低，但與對照組差異不顯著(P>0.05)。

(abcd表示方差分析差異程度，相同字母表明處理組間差異不顯著，不同字母表明處理組間差異顯著(P<0.05)。abcd indicates variance analysis in the difference degree, the same letters are no significantly different from each other; the different letters are significantly different from each other (P<0.05).)

圖4 不同濃度NaHSO3對藍(lán)隱藻細(xì)胞密度、干重、胞外多糖和藻膽蛋白含量的影響

Fig.4 Effects of different NaHSO3concentrations on the cell density, dry weight, exopolysaccharide
and phycobiliprotein contents ofC.placoidea

3 討論

3.1 NaHSO3對紫球藻和藍(lán)隱藻生長的影響

NaHSO3是一種強(qiáng)還原劑，已有不少研究者將其應(yīng)用于高等植物，研究結(jié)果均表明，較低濃度NaHSO3可促進(jìn)植物生長，提高植物產(chǎn)量和品質(zhì)，而過高濃度NaHSO3則會(huì)成為脅迫因子抑制植物生長[28-31]。廖飛勇等[13]總結(jié)前人研究指出，促進(jìn)棉花、葡萄生長的最適NaHSO3濃度為1 mmol/L，小麥、茄子、油菜、草莓和番茄等為2 mmol/L，柑桔為5 mmol/L。近年來，將NaHSO3應(yīng)用于微藻的研究也取得了一定進(jìn)展。沈銀武等[32]的研究表明，低濃度NaHSO3(0.01～0.1 mmol/L)能促進(jìn)魚腥藻(Anabaenasp.)生長及生物量的增加，濃度為0.05 mmol/L時(shí)促進(jìn)效果最佳，當(dāng)NaHSO3濃度達(dá)到0.2 mmol/L時(shí)藻體出現(xiàn)下沉及停止生長現(xiàn)象。Wang等[19]報(bào)道了低濃度NaHSO3(0.02～0.2 mmol/L)可顯著提高集胞藻PCC6803的光合放氧速率和細(xì)胞干物質(zhì)積累量，最適NaHSO3濃度為0.05 mmol/L，而高濃度NaHSO3(0.5～1 mmol/L)顯著抑制該藻生長。程建峰等[20]研究發(fā)現(xiàn)，低濃度NaHSO3(≤0.4 mmol/L)對鹽生杜氏藻的生長及光合色素含量具有促進(jìn)作用，以0.07 mmol/L效果最佳。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，較低濃度NaHSO3顯著促進(jìn)紫球藻和藍(lán)隱藻生長及細(xì)胞干重的增加，較高濃度NaHSO3則顯著抑制2種微藻的生長及細(xì)胞干物質(zhì)積累量，促進(jìn)紫球藻和藍(lán)隱藻生長的最適NaHSO3濃度分別為0.5和0.12 mmol/L。

通過以上研究結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，不同高等植物、不同微藻種類及高等植物與微藻之間的適宜NaHSO3濃度具有差異性。促進(jìn)微藻生長的最適NaHSO3濃度(0.05～0.5 mmol/L)遠(yuǎn)低于多細(xì)胞高等植物(1～5 mmol/L)，這可能與施用方法(多細(xì)胞高等植物一般采用葉面噴施，而藻類直接添加在培養(yǎng)液中)及藻類自身特性(單細(xì)胞，結(jié)構(gòu)簡單)有關(guān)。不同種類的微藻也具有不同的NaHSO3適宜濃度，這可能是由于種間差異性(不同微藻種類細(xì)胞通透性強(qiáng)弱不同，對NaHSO3的敏感度和耐受力不同)及培養(yǎng)條件不同(培養(yǎng)基和光周期等)，如沈銀武等[32]、Wang等[19]和程建峰等[20]分別采用HB111[33]、BG-11[34]和Pick[35]配方培養(yǎng)基，光周期設(shè)定分別為12L∶12D、連續(xù)光照和12L∶12D，而本實(shí)驗(yàn)采用f/2培養(yǎng)基，光周期設(shè)定為18L∶6D。從以上研究結(jié)果可以總結(jié)出：由于不同植物種類對NaHSO3響應(yīng)不一及NaHSO3施用方法和實(shí)驗(yàn)條件的不同，適宜的NaHSO3濃度也有所不同，但均表現(xiàn)為較低濃度NaHSO3促進(jìn)生長，較高濃度NaHSO3抑制生長，因此，選擇適宜的NaHSO3濃度對微藻的培養(yǎng)至關(guān)重要。

3.2 NaHSO3對紫球藻和藍(lán)隱藻葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊?/h3>

葉綠素?zé)晒庾鳛檠芯抗夂献饔玫牧己锰结?，被稱為探測植物環(huán)境脅迫下光合能力及光合器官狀態(tài)的快速靈敏、無損傷的新型植物活體診斷技術(shù)[36-37]。通過分析各葉綠素?zé)晒鈪?shù)，可獲得光合機(jī)構(gòu)對光能的利用途徑[38]。Fv/Fm為PSII最大光能轉(zhuǎn)化效率，rETR表示PSII的表觀電子傳遞速率，qP為光化學(xué)淬滅，表示的是PSII天線色素吸收的光能用于光化學(xué)電子傳遞的部分[39]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NaHSO3濃度分別為0.5和0.12 mmol/L時(shí)，紫球藻和藍(lán)隱藻的Fv/Fm、rETR和qP值均顯著高于對照組，較高NaHSO3濃度處理組的上述參數(shù)則低于對照及低濃度處理組。Wang等[19]的研究也表明，集胞藻PCC6803在最適NaHSO3濃度(0.05 mmol/L)下的Fv/Fm值顯著高于對照組，高濃度NaHSO3處理組(0.5～1 mmol/L)的Fv/Fm值顯著低于對照組。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，適宜濃度NaHSO3可提高微藻PSII反應(yīng)中心活性，使光能利用率和轉(zhuǎn)化效率升高，進(jìn)而促進(jìn)光合作用，高濃度NaHSO3脅迫下使PSII反應(yīng)中心受損，光合電子傳遞活性降低，導(dǎo)致碳的固定和同化效率降低。非光化學(xué)淬滅NPQ表示PSII天線色素吸收的光能中不能用于光化學(xué)反應(yīng)而以熱輻射形式耗散掉的份額[40]，紫球藻和藍(lán)隱藻在高濃度NaHSO3處理組的該參數(shù)高于對照及低濃度處理組，原因可能是微藻在高濃度NaHSO3脅迫下，PSII通過葉黃素循環(huán)使過剩的能量耗散，減輕光氧化，這是植物保護(hù)光合機(jī)構(gòu)的一種方式。此外，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，藍(lán)隱藻在高濃度NaHSO3處理組(0.96 mmol/L)的NPQ值在第8天呈下降趨勢，且在實(shí)驗(yàn)后期，該處理組的NPQ值顯著低于對照及其他處理組，這可能是由于NaHSO3濃度過高破壞了藍(lán)隱藻的正常生理功能，導(dǎo)致熱耗散系統(tǒng)對熱能的耗散能力逐漸喪失。已有研究表明，低濃度NaHSO3可促進(jìn)腺苷三磷酸(Adenosine triphosphate，ATP)的形成[15]，因此，推測低濃度NaHSO3促進(jìn)微藻光合作用的機(jī)理是通過增加ATP的供應(yīng)來提高PSⅠ的循環(huán)電子傳遞效率，進(jìn)而間接促進(jìn)PSII的電子傳遞，最終提高藻細(xì)胞對光能的利用率，表現(xiàn)為葉綠素?zé)晒鈪?shù)(Fv/Fm、rETR和qP)數(shù)值的升高，而高濃度NaHSO3可能破壞藻類膜結(jié)構(gòu)[41]或漂白其葉綠素[29]，從而降低藻細(xì)胞光合速率表現(xiàn)為各葉綠素?zé)晒鈪?shù)值的下降。

3.3 NaHSO3對紫球藻和藍(lán)隱藻胞外多糖和藻膽蛋白含量的影響

微藻胞外多糖和藻膽蛋白的合成易受外界環(huán)境的影響，因此可通過改變培養(yǎng)條件定向篩選和促進(jìn)該種生物活性物質(zhì)的生成。本實(shí)驗(yàn)中，促進(jìn)紫球藻和藍(lán)隱藻胞外多糖和藻膽蛋白合成的最適NaHSO3濃度分別為0.5和0.12 mmol/L，2種微藻在較高濃度NaHSO3處理組中的胞外多糖和藻膽蛋白含量低于對照及低濃度處理組，這說明較高濃度NaHSO3不利于2種微藻的胞外多糖和藻膽蛋白合成。目前，對影響微藻胞外多糖和藻膽蛋白合成的研究多集中于氮源、光強(qiáng)及pH等方面[42-43]，關(guān)于NaHSO3對微藻胞外多糖和藻膽蛋白影響的相關(guān)文獻(xiàn)還未見報(bào)道。NaHSO3對微藻生長及相關(guān)活性物質(zhì)合成的影響是一個(gè)十分復(fù)雜的過程，其對微藻細(xì)胞相關(guān)酶活性、基因表達(dá)調(diào)控及信號分子傳導(dǎo)均可能產(chǎn)生影響，具體作用機(jī)理還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)語

不同濃度NaHSO3對紫球藻和藍(lán)隱藻的生長、葉綠素?zé)晒鈪?shù)、細(xì)胞干重及胞外多糖和藻膽蛋白含量均有顯著影響。NaHSO3濃度分別為0.5和0.12 mmol/L時(shí)，紫球藻和藍(lán)隱藻的生長及葉綠素?zé)晒鈪?shù)均達(dá)到較理想狀態(tài)，且它們的細(xì)胞干重、胞外多糖和藻膽蛋白含量達(dá)到最高；當(dāng)NaHSO3濃度分別為2～3 mmol/L和0.48～0.96 mmol/L時(shí)，紫球藻和藍(lán)隱藻的上述參數(shù)均受到抑制。因此，適合紫球藻和藍(lán)隱藻生長及胞外多糖和藻膽蛋白合成的NaHSO3濃度分別為0.5和0.12 mmol/L。此結(jié)果為紫球藻和藍(lán)隱藻的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。