調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞亞群在白血病患兒中表達(dá)及意義

劉俊閃 王國鋒 郭明發(fā)

鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院 河南省兒童醫(yī)院，河南省鄭州市 450000

白血病是兒童期最常見的惡性腫瘤，約占全部兒童期癌癥的30%[1]；其發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明確，研究者認(rèn)為，抗腫瘤免疫功能抑制與白血病發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)中明顯相關(guān)，其中細(xì)胞免疫發(fā)揮重要作用[2]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞亞群是細(xì)胞免疫的重要組成部分[3]，因此，明確白血病患者調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞亞群有望進(jìn)一步了解疾病的發(fā)生機(jī)制，指導(dǎo)臨床診斷與治療。目前關(guān)于白血病患者體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的研究較多[4]，但鮮有針對兒童白血病患者的研究報道。本研究檢測了白血病初發(fā)患兒及異體造血干細(xì)胞移植成功后患兒外周血中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞亞群的表達(dá)水平，為進(jìn)一步探究白血病患兒體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)機(jī)制提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2016年6月—2018年6月間本院收治的白血病患兒84例。將其中初診白血病患兒72例歸為初診組；異體造血干細(xì)胞移植后來本院復(fù)查者12例歸為移植組。排除1個月內(nèi)有激素、免疫抑制劑使用史的患兒；存在移植物抗宿主病的患兒。初診組中男40例，女32例；年齡3～12歲，平均年齡(7.18±1.30)歲。移植組中男7例，女5例；年齡3～11歲，平均年齡(6.95±1.17)歲。另取同期在本院體檢的健康兒童40名為正常對照組，其中男22例，女18例；年齡3～12歲，平均年齡(7.03±0.85)歲。三組兒童性別、年齡之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)，均在患兒以及患兒家屬知情下參與本次研究。

1.2 主要試劑與儀器 小鼠抗人單克隆抗體：APC標(biāo)記CD8、CD4-PB、CD3/CD16+56/CD45、異硫氰酸熒光素標(biāo)記CD4、CD25-PC5、藻紅蛋白標(biāo)記CD127購于上海易匯生物科技有限公司；溶血素購于上海譜振生物科技有限公司。美國ACEA NovoCyteTM流式細(xì)胞儀，TDZ5-WS水平離心機(jī)，美國SI Vortex Genie 2 渦旋振蕩器。

1.3 標(biāo)本制備與檢測 分別于初診組患兒入組時、移植組患兒移植成功后、正常對照組兒童體檢時，以及根據(jù)兒童急性淋巴細(xì)胞白血病診療建議(第四次修訂版)中的標(biāo)準(zhǔn)，采集初診組完全緩解患兒治療1個月后、3個月后，以及未緩解患兒的清晨空腹外周靜脈血3ml，加入EDTA抗凝管中，混合均勻，2 000r/min離心10min，收集血漿，取2支離心管，分別加入血漿100μl，編號試管1、試管2；向試管1中滴加10μl APC標(biāo)記CD8、CD4-PB、CD3/CD16+56/CD45；試管2中滴加10μl異硫氰酸熒光素標(biāo)記CD4、CD25-PC5、藻紅蛋白標(biāo)記CD127，混勻后避光靜置20min，2支離心管中分別加入1ml溶血素，避光靜置20min，2 000r/min離心10min，棄去上清，分別加入500μl磷酸緩沖液，混勻后上流式細(xì)胞儀檢測。

2 結(jié)果

2.1 初診白血病患兒治療情況 72例初診白血病患兒中，完全緩解47例(65.27%)、部分緩解9例(12.50%)、未緩解9例(12.50%)，死亡或放棄治療7例(9.72%)。

2.2 外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞水平分析 與正常對照組相比，初診組患兒入組時、完全緩解后1個月、未緩解者治療后的外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平明顯升高，自然殺傷細(xì)胞明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；完全緩解后3個月、移植成功后的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞與正常對照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞水平比較

2.3 外周血T淋巴細(xì)胞亞群水平分析 與正常對照組相比，初診組患兒入組時、未緩解者治療后外周血CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平明顯降低，移植組患兒移植成功后CD4+、CD4+/CD8+水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；完全緩解后1個月、完全緩解后3個月的CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+水平與正常對照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組外周血T淋巴細(xì)胞亞群水平比較

3 討論

近年來隨著白血病治療技術(shù)的快速發(fā)展，兒童白血病的治愈率明顯提升[5]。但白血病發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，仍有部分患兒因病情復(fù)發(fā)而死亡。目前研究認(rèn)為，體內(nèi)免疫系統(tǒng)功能異常，特別是抗腫瘤功能被抑制，在白血病發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)中發(fā)揮重要作用[6]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中的作用受到廣泛關(guān)注[7]；研究者發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在自身免疫性疾病、感染性疾病、移植耐受中發(fā)揮作用的同時與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[8]?；A(chǔ)理論上，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞參與體內(nèi)白血病細(xì)胞的免疫反應(yīng)，當(dāng)化療后體內(nèi)白細(xì)胞數(shù)量明顯下降后，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的作用更為重要[9]；本文中治療效果不佳的白血病患兒外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平明顯高于正常對照組，提示患兒體內(nèi)抗腫瘤免疫系統(tǒng)被明顯抑制。

自然殺傷細(xì)胞是體內(nèi)感染后的首道防線，也是抗腫瘤免疫中最先活化的免疫細(xì)胞，發(fā)揮細(xì)胞毒性和免疫調(diào)節(jié)功能[10]。本文結(jié)果提示雖然白血病患兒病情緩解后體內(nèi)免疫系統(tǒng)逐漸恢復(fù)，但自然殺傷細(xì)胞恢復(fù)速度較為緩慢。因此，白血病患兒臨床治療中應(yīng)定期檢測外周血自然殺傷細(xì)胞水平，用于評估患兒病情復(fù)發(fā)風(fēng)險。T淋巴細(xì)胞亞群包括能夠直接反映T淋巴細(xì)胞數(shù)量的CD3+，在多種免疫細(xì)胞功能提升中發(fā)揮重要作用的CD4+，以及CD4+的調(diào)節(jié)性免疫抑制因子CD8+[11]。本文顯示，白血病患兒入組時、未緩解者治療后的T淋巴細(xì)胞水平明顯低于正常對照組，提示患兒體內(nèi)細(xì)胞免疫功能被抑制。經(jīng)有效治療后，病情完全緩解后1個月時T淋巴細(xì)胞亞群恢復(fù)至正常水平，反映白血病患兒細(xì)胞免疫功能得到有效恢復(fù)。本文中移植成功后的患兒CD4+、CD4+/CD8+水平仍明顯低于正常對照組，可能與移植后對抗體內(nèi)免疫排斥，需服用大量免疫抑制劑或激素，對機(jī)體免疫系統(tǒng)的重新建立造成不良影響，在停藥后可逐漸恢復(fù)；臨床中應(yīng)嚴(yán)密監(jiān)控白血病患兒異體造血干細(xì)胞移植后的細(xì)胞免疫重建，避免出現(xiàn)體內(nèi)免疫損傷。