劍麻內(nèi)生枯草芽孢桿菌JM-3胞外蛋白的分離及其對蘋果樹腐爛病菌的抑制作用

張淑穎,曲田麗,李保華

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)植物醫(yī)學(xué)學(xué)院;2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院，山東 青島 266109)

由黑腐皮殼菌[Valsaceratosperma(Tode) Maire]引起的蘋果樹腐爛病最早于1897年在日本被發(fā)現(xiàn)，在我國蘋果產(chǎn)區(qū)也普遍發(fā)生.該病菌具有潛伏侵染的特點(diǎn)[1]，正常的蘋果樹皮上會(huì)帶有潛伏病菌，其存在于樹皮表面的死組織或細(xì)胞團(tuán)中以及果樹剪口、枯梢和干樁上，尤其是新鮮傷口極易被侵染發(fā)病[2]，嚴(yán)重時(shí)造成整株果樹乃至果園毀滅.我國歷史上有過4次蘋果樹腐爛病發(fā)病高峰期，給不少果園造成滅頂之災(zāi).目前，生產(chǎn)上主要靠化學(xué)農(nóng)藥防治該病，但存在防治難、防效差、環(huán)境污染等問題，嚴(yán)重制約了蘋果產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展.因此，尋求蘋果樹腐爛病無公害防治措施勢在必行.

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)能產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，可抑制真菌、細(xì)菌、病毒等病原體的正常生長[3].國內(nèi)外已有許多利用枯草芽孢桿菌開發(fā)的生物農(nóng)藥，用于防治農(nóng)業(yè)生產(chǎn)病害[4].筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，劍麻(Agavesisalana)內(nèi)生枯草芽孢桿菌菌株JM-3發(fā)酵濾液能抑制蘋果樹腐爛病菌的菌絲生長和分生孢子萌發(fā)，導(dǎo)致菌絲和芽管膨大、畸形，最終菌絲破裂，原生質(zhì)外流，且對離體蘋果樹枝條上腐爛病斑的擴(kuò)展有較好的抑制效果[5]，但抑菌物質(zhì)的性質(zhì)、種類、成分及作用機(jī)理尚不清楚.故本研究擬從該菌株胞外代謝產(chǎn)物中提取對蘋果樹腐爛病菌具有抑制作用的拮抗蛋白，以期為該抑菌蛋白的推廣應(yīng)用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試菌株

病原指示菌：蘋果樹腐爛病菌為黑腐皮殼菌，從富士蘋果樹腐爛病斑上分離、純化并鑒定.試驗(yàn)菌：枯草芽孢桿菌菌株JM-3自劍麻中分離并鑒定.

1.2 無機(jī)培養(yǎng)基的篩選

試驗(yàn)設(shè)碳源+KNO3、碳源+NH4Cl、碳源+NH4NO3、碳源+(NH4)2HPO4、碳源+(NH4)2SO4、碳源+尿素、碳源+氨基乙酸等培養(yǎng)基.每1 000 mL碳源母液中含葡萄糖10 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、FeSO4·7H2O 0.02 g、CaCO30.2 g、KH2PO40.5 g、Na2HPO4·12H2O 0.5 g，氮源3 g，pH為7.0～7.2，250 mL二角瓶裝液量為100 mL，34 ℃、170 r·min-1振蕩培養(yǎng)48 h[6].菌株發(fā)酵液活菌數(shù)與D600 nm呈良好的線性相關(guān)[7]，以相應(yīng)培養(yǎng)基組分為空白對照，通過用分光光度計(jì)測D600 nm計(jì)算活菌量.取細(xì)菌過濾器過濾后的上清濾液0.1 mL于牛津杯中進(jìn)行抗菌活性測定.用紫外分光光度計(jì)測定波長在260和280 nm的光密度(D)[8]，計(jì)算蛋白質(zhì)濃度(ρ).

ρ(蛋白質(zhì))=1.45D280 nm-0.74D260 nm

1.3 胞外蛋白粗品的制備及抑菌效果測定

分別用不同飽和度(NH4)2SO4沉淀同批次發(fā)酵液.將發(fā)酵液10 000 r·min-1離心10 min，取上清液經(jīng)細(xì)菌過濾器制備無菌發(fā)酵濾液，加入固體(NH4)2SO4，4 ℃冰箱中靜置24 h，15 000 r·min-1離心10 min，分別收集沉淀和上清液.用0.05 mol·L-1PBS(pH 6.8)溶解鹽析沉淀蛋白(每4 mL PBS溶解1 L粗提液鹽析蛋白)，牛津杯置于PDA平板中央，在杯中注入40 μL各沉淀溶解物，在其四周各放一個(gè)蘋果樹腐爛病菌菌餅，28 ℃暗培養(yǎng)96 h，測量抑菌圈直徑.以PBS、飽和上清液、苯醚甲環(huán)唑(4 μg·mL-1)為對照.

選取有拮抗作用的沉淀蛋白,測定其對蘋果樹離體枝條腐爛病菌的抑制作用：用75%酒精對直徑約1 cm的蘋果樹枝條進(jìn)行表面消毒，用打孔器(直徑5 cm)去除枝條表皮，先接種20 μL沉淀蛋白后再接種蘋果樹腐爛病菌菌餅(直徑5 cm)，保鮮膜覆蓋菌餅，25 ℃恒溫培養(yǎng)，10 d后測定腐爛病斑長度.

1.4 拮抗蛋白的分離

SDS-PAGE：濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%，分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%，用考馬斯亮藍(lán)R250染色，后經(jīng)脫色、拍照、灌膠、加樣、電泳、染色及脫色等程序，最后制作標(biāo)準(zhǔn)曲線.

同時(shí)灌注2塊膠：膠Ⅰ用考馬斯亮藍(lán)R250染色，脫色，拍照；膠Ⅱ不染色.比對膠Ⅰ和膠Ⅱ電泳圖，在膠Ⅱ相同位置將每一個(gè)蛋白條帶分別切割，無菌水沖洗3次，用0.05 mol·L-1PBS(pH 6.8)浸提過夜，得浸提蛋白液.

將浸提蛋白液置于牛津杯中，觀察其對培養(yǎng)皿中腐爛病菌菌絲生長的抑制情況，測量抑菌圈直徑.以PBS為對照，分別測定每一個(gè)蛋白條帶的抑制效果.

1.5 拮抗蛋白對蘋果樹腐爛病菌抑制效果的測定

1.5.1 對菌絲生長的毒力 提取得到的拮抗蛋白經(jīng)冷凍干燥后，用50 mmol·L-1PBS(pH 6.8)緩沖液按蛋白的質(zhì)量配成1、5、10、20、100 μg·mL-1溶液.采用牛津杯法進(jìn)行測定，取20 μL蛋白處理液置于牛津杯中，四周等距離放置蘋果樹腐爛病菌菌餅，28 ℃暗培養(yǎng)96 h，用十字交叉法測量菌落直徑，每個(gè)濃度重復(fù)3次.以苯醚甲環(huán)唑(10 μg·mL-1)為對照，根據(jù)不同濃度蛋白的菌絲生長抑制率計(jì)算回歸方程和EC50值.

菌絲生長抑制率/%=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑×100

相對抑制率/%=處理抑制率/原液抑制率×100

1.5.2 對分生孢子萌發(fā)的影響 提取得到的拮抗蛋白經(jīng)冷凍干燥后，用50 mmol·L-1PBS(pH 6.8)緩沖液按蛋白的質(zhì)量配成1、2、4、8、16 μg·mL-1溶液.配制孢子懸浮液(106個(gè)·mL-1)，將其與拮抗蛋白液等體積混勻.采用培養(yǎng)皿玻片法進(jìn)行測定，凹玻片上28 ℃暗培養(yǎng)96 h，以芽管長度超過孢子直徑一半作為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，測定其對分生孢子萌發(fā)的抑制率.以苯醚甲環(huán)唑(20 μg·mL-1)為對照.

1.5.3 對離體蘋果樹枝條腐爛病斑擴(kuò)展的影響 提取得到的拮抗蛋白經(jīng)冷凍干燥后，用50 mmol·L-1PBS(pH 6.8)緩沖液將其配成10 μg·mL-1溶液，測定方法同1.3.處理為20 μL蛋白液，PBS為對照.

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SAS 9.0統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氮源的無機(jī)培養(yǎng)基對JM-3生長及其抗菌物質(zhì)分泌的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，在無機(jī)培養(yǎng)基中，菌體生長的最適培養(yǎng)氮源為NH4NO3，D600 nm為1.752；(NH4)2HPO4次之，D600 nm為1.706(表1).以NH4NO3作為氮源最有利于生成胞外蛋白物質(zhì)，ρ(蛋白質(zhì))達(dá)1.900.以(NH4)2HPO4作為氮源，抑菌活性最強(qiáng)，抑菌圈直徑達(dá)15 mm；NH4NO3和氨基乙酸次之，抑菌圈直徑分別為10和5 mm.由此可以看出，以NH4NO3作為氮源，JM-3菌體生長量最大，胞外蛋白物質(zhì)含量最多；以(NH4)2HPO4作為氮源，抑菌活性最強(qiáng).

表1 JM-3菌株在無機(jī)培養(yǎng)基中的生長量及其抑菌活性1)Table 1 Reproduction and antagonistic activity of JM-3 in different inorganic media

2.2 胞外蛋白粗品的制備

結(jié)果(表2)表明，(NH4)2SO4飽和度為40%～60%時(shí)，可將無機(jī)發(fā)酵濾液中的活性蛋白完全沉淀析出.其中，40% (NH4)2SO4的鹽析蛋白抑菌圈直徑達(dá)25 mm，皿內(nèi)抑菌效果最好；50% (NH4)2SO4沉淀蛋白次之，抑菌圈直徑為14 mm，與前者有顯著差異(P<0.05).40%和50% (NH4)2SO4鹽析蛋白能有效抑制離體枝條病斑擴(kuò)展，抑制效果優(yōu)于4 μg·mL-1苯醚甲環(huán)唑(P<0.05)；60% (NH4)2SO4鹽析蛋白對離體枝條病斑擴(kuò)展的抑制效果較差，與苯醚甲環(huán)唑無顯著差異(P>0.05).

表2 不同飽和度(NH4)2SO4鹽析蛋白對腐爛病菌的抑制效果1)Table 2 Inhibition effects of different saturations of ammonium sulfate precipitation on V.ceratosperma

M.Marker；T.胞外蛋白(a-h為可見蛋白條帶).圖1 JM-3菌株胞外蛋白電泳圖Fig.1 Electrophoresis of extracellular protein from JM-3

2.3 拮抗蛋白的分離及其抑菌效果

40%、50%飽和(NH4)2SO4鹽析蛋白經(jīng)凝膠電泳后分離出數(shù)條蛋白條帶(圖1).拮抗測定結(jié)果表明：僅c蛋白條帶能抑制蘋果樹腐爛病菌菌絲生長(圖2)，其相對分子質(zhì)量約為4.5 ku.

左：PBS (CK)；右：拮抗蛋白c.圖2 拮抗蛋白對蘋果樹腐爛病菌菌絲生長的抑制效果Fig.2 Antagonistic activity of antagonistic protein on mycelial growth of V.ceratosperma

2.4 拮抗蛋白c對蘋果樹腐爛病菌的抑制作用

拮抗蛋白c對腐爛病菌菌絲生長的毒力方程為y=3.490 5+0.989 2x，EC50值為33.54 μg·mL-1；苯醚甲環(huán)唑?qū)Ω癄€病菌菌絲生長的毒力方程為y=0.943 8+2.231 1x，EC50值為65.71 μg·mL-1.可見，拮抗蛋白c的抑菌效果優(yōu)于苯醚甲環(huán)唑.

當(dāng)拮抗蛋白c濃度為8 μg·mL-1時(shí)，對腐爛病菌分生孢子萌發(fā)的抑制率為89.5%，與對照相比無顯著差異(P>0.05)；拮抗蛋白c濃度為16 μg·mL-1時(shí)，對腐爛病菌分生孢子萌發(fā)的抑制率為97.2%，與對照相比差異顯著(P<0.05，表3).

圖3顯示，對照病斑長度為64 mm，拮抗蛋白c能完全抑制離體蘋果樹枝條腐爛病斑擴(kuò)展.

表3 拮抗蛋白c對蘋果樹腐爛病菌分生孢子萌發(fā)的抑制率1)Table 3 Inhibitory rate of antifungal protein c on the conidial germination of V.ceratosperma

左：拮抗蛋白c；右：PBS (CK).圖3 拮抗蛋白c對離體蘋果樹枝條腐爛病菌的抑制效果Fig.3 Inhibition effect of antifungal protein c on lesion expansion of apple branch caused by V.ceratosperma in vitro

3 討論與結(jié)論

枯草芽孢桿菌除具有對人畜無害、不污染環(huán)境、抗逆性強(qiáng)等特性外，還有非常發(fā)達(dá)的外分泌系統(tǒng)，生成的次級代謝產(chǎn)物能夠有效控制病害發(fā)生[6].其產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)按來源可以分為兩大類：一類是由非核糖體合成，另一類是由核糖體合成.非核糖體合成的抗菌物質(zhì)以肽類抗生素為主，分子質(zhì)量介于300～3 000 u之間，絕大多數(shù)為環(huán)狀肽或環(huán)狀脂肽；核糖體合成的抗菌蛋白分子質(zhì)量大于20 ku.枯草芽孢桿菌胞外蛋白對植物病害的抑制機(jī)制主要分為2種：(1)生成拮抗物質(zhì)，如細(xì)菌素、凝集素、蛋白酶抑制劑、幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶等細(xì)胞壁降解酶[2,9-15]；(2)誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生抗性防御反應(yīng)[16-17].

傳統(tǒng)有機(jī)發(fā)酵培養(yǎng)基中含有蛋白物質(zhì)，易對試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾，因此本試驗(yàn)采用無機(jī)培養(yǎng)基對菌體進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng).研究發(fā)現(xiàn)，劍麻內(nèi)生枯草芽孢桿菌菌株JM-3在以(NH4)2HPO4作為氮源的無機(jī)發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，生成的抑菌物質(zhì)活性最強(qiáng)，其拮抗蛋白可通過40%～60% (NH4)2SO4分級沉淀鹽析.40%和50% (NH4)2SO4鹽析蛋白經(jīng)凝膠電泳，獲得1條活性蛋白條帶c，其分子質(zhì)量約為4.5 ku，能夠抑制蘋果樹腐爛病菌菌絲生長和分生孢子萌發(fā)，也可完全抑制離體蘋果樹枝條腐爛病斑擴(kuò)展.枯草芽孢桿菌至少能分泌60多種抗菌物質(zhì)，但由于抗菌物質(zhì)積累的機(jī)制不明確，分離純化體系不完善，僅10余種具有確定的結(jié)構(gòu)和功能[18].有關(guān)拮抗蛋白c的成分、結(jié)構(gòu)以及在田間的應(yīng)用效果還有待于進(jìn)一步研究.