感染水稻瘤矮病毒的轉(zhuǎn)cry1Ab水稻對電光葉蟬種群的影響

苗 鑫,高云麗,馬璐瑤,張劉通,張 榜,林 勝

(1.福建農(nóng)林大學(xué)閩臺作物有害生物生態(tài)防控國家重點(diǎn)實驗室；2.福建農(nóng)林大學(xué)應(yīng)用生態(tài)研究所；3.教育部害蟲生態(tài)防控國際合作聯(lián)合實驗室；4.農(nóng)業(yè)部閩臺作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實驗室，福建 福州 350002)

水稻是我國第一大糧食作物，其產(chǎn)量占糧食總產(chǎn)量的45%以上，因此，水稻在我國糧食生產(chǎn)和農(nóng)業(yè)發(fā)展中具有舉足輕重的地位[1-2].然而，蟲害問題始終是制約水稻穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)的一個重要因素.目前，培育和使用抗蟲水稻品系是一個經(jīng)濟(jì)、安全、有效的控制害蟲的手段[3]，其中，使用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育抗蟲品系是一種切實有效的方法.我國已經(jīng)培育出一系列能夠抗蟲并具有優(yōu)良品質(zhì)的轉(zhuǎn)基因水稻[4].雖然轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻能夠有效控制害蟲的發(fā)生、減少化學(xué)農(nóng)藥的投入、降低農(nóng)藥對環(huán)境的污染[5-6]，但是其生態(tài)安全性問題一直備受關(guān)注，其中一個主要的安全問題是轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻環(huán)境釋放后是否會對非靶標(biāo)生物產(chǎn)生非預(yù)期的影響.

研究表明，轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻對稻飛虱、葉蟬等非靶標(biāo)害蟲種群發(fā)生發(fā)展影響不顯著[3，7]，但感病后的轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻會對非靶標(biāo)昆蟲相關(guān)指標(biāo)產(chǎn)生顯著影響.例如：感染水稻矮縮病毒(Ricedwarfvirus,RDV)的Bt水稻會顯著影響黑尾葉蟬(Nephotettixcincticeps)卵歷期、雌雄成蟲鮮重、雄成蟲壽命等指標(biāo)[8]；感染南方水稻黑條矮縮病毒(Southernriceblack-streakeddwarfvirus,SRBSDV)的Bt水稻(T1C-19)會顯著縮短褐飛虱(Nilaparvatalugens)雌成蟲的發(fā)育歷期[9].

電光葉蟬(Reciliadorsalis)是水稻上重要的經(jīng)濟(jì)害蟲，直接刺吸為害水稻，并能傳播水稻主要病毒.水稻瘤矮病毒(Ricegalldwarfvirus,RGDV)在我國南方多個省份的稻區(qū)發(fā)生，尤其在廣東省存在長達(dá)30年常態(tài)流行，嚴(yán)重時造成局部水稻減產(chǎn)50%以上[10].該病毒在我國主要由電光葉蟬以持久增殖型方式傳播[11].電光葉蟬取食病株后最短在1 h內(nèi)獲毒，即成帶毒蟲，在蟲體內(nèi)經(jīng)4～12 d循回期即具有侵染致病力，能終身傳毒，若蟲的傳毒效力比成蟲強(qiáng)，成蟲吸食健株30 min 內(nèi)即可傳毒給健株而致病[12].目前，有關(guān)轉(zhuǎn)基因水稻對非靶標(biāo)害蟲電光葉蟬的安全評價報道十分鮮見.因此，本試驗研究感染RGDV的轉(zhuǎn)cry1Ab水稻對電光葉蟬種群的影響，以期為進(jìn)一步明確轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻的生態(tài)風(fēng)險和推進(jìn)其商品化提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

不帶毒電光葉蟬：于2018年8月采自福建省福州市壽山試驗基地，經(jīng)檢測未帶毒后飼養(yǎng)于人工氣候室[溫度(28±1) ℃，相對濕度70%±1%，光照14L∶10D],連續(xù)在TN1水稻上飼養(yǎng)5代以上.帶RGDV電光葉蟬：福建農(nóng)林大學(xué)病毒研究所飼養(yǎng)品系，經(jīng)RT-PCR檢測確認(rèn)其攜帶RGDV，于2017年9月開始在福建農(nóng)林大學(xué)閩臺作物有害生物生態(tài)防控國家重點(diǎn)實驗室飼養(yǎng)[溫度(28±1) ℃，相對濕度70%±1%，光照14L∶10D].將該蟲飼養(yǎng)在2～3 cm的TN1水稻幼苗上，每隔8 d將其轉(zhuǎn)移到新鮮的水稻幼苗上，確保其獲取充足的營養(yǎng).帶毒電光葉蟬主要用于水稻傳毒.

1.2 供試水稻及其處理

轉(zhuǎn)cry1Ab水稻(MF86)及其親本非轉(zhuǎn)基因水稻閩恢3301(MH3301)種子由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)遺傳工程重點(diǎn)實驗室提供.

播種前在室溫條件下浸種24 h，室溫催芽48 h，待露白后進(jìn)行旱育秧.于每個塑料盆中裝入適量土壤，整理平整后將胚芽向上放入，再覆蓋一層土壤(團(tuán)粒)，置入人工氣候箱中[溫度(28±1) ℃，相對濕度70%±1%，光照14L∶10D]生長.10 d后取長勢相當(dāng)?shù)难砻?，移栽?0 mm×200 mm的玻璃試管中，試管中盛有pH為4.5～5.0的Kimura B水稻營養(yǎng)液[13]，每管置入2株稻苗，然后在每個試管內(nèi)放入帶RGDV電光葉蟬4～5齡若蟲10頭，試管頂端用絲襪罩住，放入人工氣候室內(nèi)，待2 d后除去蟲源.除蟲后在同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)，并每隔3 d更換營養(yǎng)液，10 d后分單株，取少量水稻葉組織進(jìn)行RGDV檢測，陽性植株為感RGDV水稻植株，用于后續(xù)試驗.另外，取同一批水稻植株，在相同培養(yǎng)條件下經(jīng)不帶毒電光葉蟬取食處理，獲得未感病RGDV水稻植株.

1.3 方法

選取150頭不帶毒電光葉蟬雌雄成蟲(性比接近1∶1)分別置于4組水稻上，即感病MH3301、未感病MH3301、感病MF86、未感病MF86，待產(chǎn)卵24 h后取出水稻.將各組水稻單獨(dú)置于養(yǎng)蟲籠中，每天觀察水稻上電光葉蟬卵孵化情況，并將初孵若蟲轉(zhuǎn)移到對應(yīng)的處理組水稻上，進(jìn)行單蟲單苗單管飼養(yǎng)，每個處理組需80個蟲體，每天記錄若蟲蛻皮情況、羽化情況，并將同一處理組的電光葉蟬進(jìn)行雌雄兩兩配對.剩余的初孵若蟲繼續(xù)飼養(yǎng)于各組水稻上，用于后期配對不均時候補(bǔ).每天更換新苗，并在顯微鏡下觀察產(chǎn)卵量，直至蟲體死亡.

1.4 統(tǒng)計與分析

統(tǒng)計卵、若蟲、成蟲的發(fā)育歷期，以及產(chǎn)卵前期、產(chǎn)卵期、產(chǎn)卵后期、日繁殖率、最大繁殖率、達(dá)最大繁殖率時的成蟲年齡和總繁殖力等生殖相關(guān)參數(shù)[14]；種群生命表參數(shù)包括特定年齡-齡期存活率(Sxj，表示種群中個體能存活到年齡x到齡期j的概率)、種群特定年齡存活率(lx，表示Sxj曲線在不考慮齡期分化情況下的簡化形式)、種群年齡繁殖率(mx，表示種群在年齡x時的平均產(chǎn)卵量)、雌成蟲年齡-齡期繁殖率(fxj，表示一頭雌成蟲在年齡x和齡期j所產(chǎn)的能夠孵化的卵粒數(shù))、種群年齡凈增殖率(lxmx)、種群世代凈增殖率(R0，表示種群在一定條件下經(jīng)過一個世代后的每個存活個體所產(chǎn)生的后代總數(shù))、內(nèi)稟增長率(r，表示種群的最大瞬時增長率)、周限增長率(λ，表示種群內(nèi)平均每一個個體能產(chǎn)生的后代數(shù))、平均世代周期(T,表示在穩(wěn)定的齡期階段分布中，種群增長到其規(guī)模的R0倍所需要的時間長度)[15-16].

采用雙因素方差分析水稻品種、RGDV及二者交互作用對電光葉蟬發(fā)育歷期、生殖相關(guān)參數(shù)和種群生命表參數(shù)的影響.另外，采用單因素方差分析電光葉蟬發(fā)育歷期、生殖相關(guān)參數(shù)和種群生命表參數(shù)在不同處理間的差異，并采用LSD進(jìn)行多重比較.采用年齡-齡期兩性生命表分析軟件TWOSEX-MSChar中的Timing-MSChart預(yù)測以100粒電光葉蟬有效卵為起始的100 d種群動態(tài)[16].

2 結(jié)果與分析

2.1 感染RGDV的轉(zhuǎn)cry1Ab水稻對電光葉蟬發(fā)育歷期的影響

水稻品種對電光葉蟬發(fā)育歷期的影響不顯著；RGDV顯著影響了電光葉蟬的卵及1、2、3齡若蟲和雌成蟲的發(fā)育歷期以及總壽長；RGDV和水稻品種對卵期、1和5齡若蟲期有顯著的交互效應(yīng)(表1).與取食未感病MH3301相比，取食未感病MF86的電光葉蟬1和5齡若蟲期及總壽長均顯著延長；與取食未感病MF86相比，取食感病MF86的電光葉蟬1、2、3齡若蟲期及雄成蟲期和總壽長顯著縮短；與取食感病MH3301相比，取食感病MF86的電光葉蟬卵期及1、2、3齡若蟲期均顯著縮短(表2).

表1 電光葉蟬發(fā)育歷期雙因素方差分析結(jié)果Table 1 Outputs of two-way ANOVA analysis of the developmental duration of R.dorsalis

表2 電光葉蟬取食感病或不感病水稻后的發(fā)育歷期1)Table 2 Developmental duration of R.dorsalis feeding on healthy or RGDV-infected rices

2.2 感染RGDV的轉(zhuǎn)cry1Ab水稻對電光葉蟬生殖相關(guān)參數(shù)的影響

水稻品種對電光葉蟬產(chǎn)卵前期有顯著影響；RGDV對電光葉蟬產(chǎn)卵期、產(chǎn)卵后期、達(dá)最大繁殖率時的成蟲年齡有顯著影響；RGDV和水稻品種對生殖相關(guān)參數(shù)無顯著交互效應(yīng)(表3).與取食未感病MH3301相比，取食未感病MF86的電光葉蟬產(chǎn)卵期顯著延長；與取食未感病MF86和感病MH3301相比，取食感病MF86的電光葉蟬產(chǎn)卵前期和產(chǎn)卵期顯著縮短(表4).

表3 電光葉蟬生殖相關(guān)參數(shù)雙因素方差分析結(jié)果Table 3 Outputs of two-way ANOVA analysis of the reproductive parameters of R.dorsalis

表4 電光葉蟬取食感病或未感病水稻后的生殖相關(guān)參數(shù)1)Table 4 Reproductive parameters of R.dorsalis feeding on healthy or RGDV-infected rices

與取食未感病MH3301相比，取食未感病MF86的電光葉蟬fxj、mx和lxmx在產(chǎn)卵前期表現(xiàn)較高，45 d后有所下降，最長存活時間延長(圖1A、1C)；與取食未感病MF86相比，取食感病MF86的電光葉蟬fxj表現(xiàn)較低，50 d后fxj和mx均有所上升，但最長存活時間縮短(圖1C、1D)；與取食感病MH3301相比，取食感病MF86的電光葉蟬fxj、mx和lxmx均較高，最長存活時間延長(圖1B、1D).

A.未感病水稻MH3301；B.感病水稻MH3301；C.未感病水稻MF86；D.感病水稻MF86.圖1 電光葉蟬雌成蟲取食感病或未感病水稻后的年齡-齡期繁殖率(fxj)、種群年齡繁殖率(mx)和種群年齡凈增殖率(lxmx)Fig.1 Age-developmental stage specific fecundity (fxj),age-specific fecundity (mx),and age-specific maternity (lxmx) of female R.dorsalis feeding on healthy or RGDV-infected rices

2.3 感染RGDV的轉(zhuǎn)cry1Ab水稻對電光葉蟬存活率的影響

與取食未感病MH3301相比，取食未感病MF86的電光葉蟬3～4齡若蟲存活率均有所上升，雌成蟲存活率有所下降，存活歷期總體延長(圖2A、2C)；與取食未感病MF86相比，取食感病MF86的電光葉蟬卵、1～4齡若蟲和雄成蟲存活率均呈下降趨勢，雌成蟲存活率有所升高，存活歷期總體呈縮短趨勢(圖2C、2D)；與取食感病MH3301相比，取食感病MF86的電光葉蟬卵、1～4齡若蟲和雄成蟲存活率均有所下降，雌成蟲存活歷期有所延長，雄成蟲存活歷期有所縮短(圖2B、2D).

A.未感病水稻MH3301；B.感病水稻MH3301；C.未感病水稻MF86；D.感病水稻MF86.圖2 電光葉蟬取食感病或未感病水稻后的特定年齡-齡期存活率(Sxj)Fig.2 Age-developmental stage specific survival rates (Sxj) of R.dorsalis feeding on healthy or RGDV-infected rices

圖3 電光葉蟬取食感病或未感病水稻后的種群特定年齡存活率(lx)Fig.3 Population age-specific survival rates (lx)of R.dorsalis feeding on healthy or RGDV-infected rices

與取食未感病MH3301相比，取食未感病MF86的電光葉蟬存活率較高，存活歷期較長；與取食未感病MF86相比，取食感病MF86的電光葉蟬存活率較低，存活歷期較短；與取食感病MH3301相比，取食感病MF86的電光葉蟬存活率和存活歷期基本一致(圖3).

2.4 感染RGDV的轉(zhuǎn)cry1Ab水稻對電光葉蟬種群動態(tài)相關(guān)參數(shù)的影響

水稻品種對電光葉蟬的r、R0和T有顯著影響；RGDV對電光葉蟬的λ、R0和T有顯著影響;二者對這4個參數(shù)均有顯著的交互效應(yīng)(表5).與取食未感病MF86相比，取食感病MF86的電光葉蟬T顯著縮短；與取食未感病MH3301相比，取食未感病MF86的電光葉蟬r、λ、R0和T均無顯著變化；與取食感病MH3301相比，取食感病MF86的電光葉蟬r和R0均顯著升高(表6).

表5 電光葉蟬種群參數(shù)雙因素方差分析結(jié)果Table 5 Outputs of two-way ANOVA analysis of the population parameters of R.dorsalis

表6 電光葉蟬取食感病或未感病水稻后的種群參數(shù)1)Table 6 Population parameters of R.dorsalis feeding on healthy or RGDV-infected rices

圖4 取食感病或未感病水稻的電光葉蟬種群動態(tài)預(yù)測Fig.4 Predictions on the population dynamics of R.dorsalis feeding on healthy or RGDV-infected rices

取食不同處理水稻的電光葉蟬均在38 d左右出現(xiàn)第1代，76 d左右出現(xiàn)第2代.之后開始出現(xiàn)差異，與取食未感病MF86相比，取食感病MF86的電光葉蟬種群預(yù)測世代周期明顯快，種群預(yù)測曲線較高.MF86與親本MH3301相比，對電光葉蟬的影響發(fā)生顯著變化：與取食未感病MH3301相比，取食未感病MF86的電光葉蟬種群增長速度快，增長率高；與取食感病MH3301相比，取食感病MF86的電光葉蟬種群增長速度快，增長率高(圖4).

3 討論

外源cry基因在水稻染色體中的隨機(jī)插入，可能會導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻某些物理性狀以及營養(yǎng)成分等發(fā)生改變，從而對植食性昆蟲的生長發(fā)育、取食和產(chǎn)卵行為產(chǎn)生影響[17].陳茂等[18]研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)cry1Ab基因的抗蟲水稻對褐飛虱產(chǎn)卵量無顯著影響；周霞等[19]研究表明，轉(zhuǎn)cry1Ab基因水稻會對非靶標(biāo)昆蟲的產(chǎn)卵期和產(chǎn)卵量產(chǎn)生影響；徐雪亮等[20]研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)Bt基因水稻“贛綠1號”不會對非靶標(biāo)昆蟲的生長發(fā)育產(chǎn)生不利影響.本試驗發(fā)現(xiàn)，與取食未感病的非轉(zhuǎn)基因水稻MH3301相比，取食未感病的轉(zhuǎn)cry1Ab基因水稻的電光葉蟬產(chǎn)卵量無顯著變化，而產(chǎn)卵期顯著延長.可見，相同的轉(zhuǎn)基因水稻會對不同的非靶標(biāo)昆蟲產(chǎn)生不同的影響.

當(dāng)水稻受到病毒的入侵時，會產(chǎn)生防御反應(yīng)以及改變營養(yǎng)成分，從而在一定程度上影響植食性昆蟲的生長發(fā)育.Tu et al[21]研究表明，取食感染SRBSDV的水稻后，無毒的和攜帶SRBSDV的白背飛虱(Sogatellafurcifera)成蟲壽命顯著縮短，生殖力下降.本試驗也發(fā)現(xiàn)，與取食未感病MH3301相比，取食感病MH3301的電光葉蟬總繁殖力顯著降低.與此相反，將B型煙粉虱(Bemisiatabaci)分別飼養(yǎng)于健康和感染木薯花葉病毒(Cassavamosaicvirus)的木薯植株上，結(jié)果發(fā)現(xiàn)病株上的煙粉虱種群數(shù)量明顯高于健康植株上的數(shù)量，且植株在田間的發(fā)病程度與煙粉虱數(shù)量呈正相關(guān)，即病毒能提高介體昆蟲的生殖能力[22].此外，本試驗發(fā)現(xiàn)，與取食未感病MF86相比，取食感病MF86的電光葉蟬雄成蟲壽命及總壽長均顯著縮短.He et al[23]也發(fā)現(xiàn),取食感染SRBSDV的轉(zhuǎn)基因水稻后，白背飛虱雌成蟲壽命和卵歷期顯著縮短，而取食感染SRBSDV的非轉(zhuǎn)基因水稻后白背飛虱的適應(yīng)性提高.因此進(jìn)一步說明，受病毒侵染的植株會對非靶標(biāo)昆蟲的生理生化特性造成一定的影響.

王前進(jìn)等[24]研究發(fā)現(xiàn)，取食感染RDV的水稻后，非靶標(biāo)昆蟲黑尾葉蟬凈生殖率顯著提高.本研究發(fā)現(xiàn)，與取食未感病MH3301相比，取食未感病MF86的電光葉蟬種群參數(shù)無顯著變化；與取食感病MH3301相比，取食感病MF86的電光葉蟬內(nèi)稟增長率及凈增殖率均顯著升高.種群預(yù)測結(jié)果表明，取食感病或未感病MF86的電光葉蟬均表現(xiàn)為種群增長快且數(shù)目多的特點(diǎn)，推斷轉(zhuǎn)入基因及感染RGDV改變了水稻的特性，從而對非靶標(biāo)昆蟲的種群產(chǎn)生影響.此外，電光葉蟬通過口針吸食植物汁液存活[25]，而水稻感染RGDV后，其汁液成分或防御途徑可能發(fā)生改變，從而對葉蟬的營養(yǎng)利用或取食行為造成影響，導(dǎo)致葉蟬的壽命、存活率等生物特性發(fā)生變化[26].其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究.