麻佛微素對(duì)小鼠微核和精子畸形的影響

袁曦 白雪

摘要：通過小鼠微核試驗(yàn)和精子畸形試驗(yàn)評(píng)價(jià)麻佛微素的致突變性。兩個(gè)試驗(yàn)分別將小鼠分為4個(gè)處理組，實(shí)驗(yàn)組按1倍和2倍治療量分別灌胃，陰性組生理鹽水灌胃，陽性用環(huán)磷酰胺灌胃。微核試驗(yàn)每組7只小鼠，連續(xù)給藥2天，時(shí)間間隔24 h，于第2 次染毒后6 h將小鼠脫頸椎處死，制骨髓涂片，觀察。精子畸形試驗(yàn)每組8只小鼠連續(xù)給藥5天，于第1次給藥后的第35天，采用脫頸椎法處死小鼠，制精子涂片，觀察。結(jié)果顯示，小鼠微核試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)組和陰性組比較微核率差異不顯著（P>0.05），與陽性組比較差異極顯著（P<0.01），精子畸形試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)組和陰性組比較精子畸形率差異不顯著（P>0.05），與陽性組比較差異極顯著（P<0.01）。上述結(jié)果表明，麻佛微素在本實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)用微核試驗(yàn)和精子畸形試驗(yàn)評(píng)價(jià)無致突變作用。

關(guān)鍵詞：麻佛微素；微核試驗(yàn)；精子畸形試驗(yàn)；致突變性

麻佛微素是新一代氟喹諾酮類抗菌藥，其主要成分為馬波沙星（Marbofloxacin），由法國威隆公司生產(chǎn)，為人工合成，主要用于犬、貓等伴侶動(dòng)物。該藥對(duì)多種感染有很好的療效，以抑制DNA螺旋酶方式產(chǎn)生作用，能有效殺死革蘭氏陽性菌（特別是葡萄球菌和鏈球菌等）及革蘭氏陰性菌（如大腸桿菌、霍亂桿菌和綠膿桿菌等）。內(nèi)服和注射給藥后吸收快且完全，體內(nèi)分布廣，生物利用度高。但隨著人們對(duì)伴侶動(dòng)物的重視度越來越高，伴侶動(dòng)物的藥物安全性也越來越重要。據(jù)報(bào)道，培氟沙星可引起精子畸變率增高和睪丸萎縮，氧氟沙星能引起哺乳動(dòng)物胎兒死亡率增加，這些都提示人們對(duì)氟喹諾酮類藥物的安全性要引起重視。

為評(píng)定某藥的安全性而進(jìn)行的各種毒性試驗(yàn)，稱為安全試驗(yàn)。安全試驗(yàn)主要分為兩類：第一類為一般毒性試驗(yàn)，包括急性、亞慢性和慢性毒性試驗(yàn)等；第二類為特殊毒性試驗(yàn)，如繁殖試驗(yàn)、致突變?cè)囼?yàn)、致畸試驗(yàn)、致癌試驗(yàn)和遲發(fā)性神經(jīng)性試驗(yàn)等。在致突變?cè)囼?yàn)中，小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)主要是對(duì)染色體結(jié)構(gòu)完整性的改變進(jìn)行評(píng)估，是檢測(cè)外來化合物對(duì)染色體損傷作用的重要試驗(yàn)；小鼠精子畸形試驗(yàn)是對(duì)已知的生殖細(xì)胞致突變物具有高度的敏感性，它已被公認(rèn)為檢測(cè)受試物對(duì)生殖細(xì)胞致突變作用的一種標(biāo)準(zhǔn)的體內(nèi)試驗(yàn)方法。

到目前為止，有關(guān)麻佛微素致突變性和致畸性方面的研究報(bào)道很少。本文選擇微核試驗(yàn)和致畸試驗(yàn)，研究麻佛微素的致突變性，旨在確定是否存在致突變毒性，選擇小鼠來進(jìn)行微核試驗(yàn)和精子致畸實(shí)驗(yàn)，從致突變性方面進(jìn)行相關(guān)的研究和分析，以確定麻佛微素是否具有致突變的作用，為臨床上使用該藥提供科學(xué)依據(jù)。

一、材料和方法

（1）藥物 麻佛微素 （Marbocyl）規(guī)格：80mg/片，法國威隆公司生產(chǎn)。

（2）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 小鼠60只，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)隆鼠家園提供。小鼠飼料由雅安市雨城區(qū)華森飼料提供。

（3）試驗(yàn)器材 手術(shù)刀、手術(shù)剪、無齒鑷、小型止血鉗、干凈紗布、帶橡皮頭吸管、晾片架、酒精燈、記號(hào)筆、玻璃染色缸、1 ml 注射器及針頭、載玻片、定時(shí)鐘、燒杯，試管等。

（4）其他用品 小牛血清（采集健康牛血液離心制成）、環(huán)磷酰胺（200mg/瓶，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)）、姬姆薩氏染色液，伊紅染色液（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)院提供）、生物顯微鏡（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)院產(chǎn)科實(shí)驗(yàn)室提供）甲醇（分析純）、甘油（分析純）、生理鹽水、蒸餾水等。

二、試驗(yàn)

（一）微核試驗(yàn)

（1）劑量及分組：選用體重20 - 25g的小鼠 28只雌雄各半，隨機(jī)分為4組，每組7只，設(shè)陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組各一和兩個(gè)劑量組，連續(xù)給藥2天，間隔時(shí)間為24 h.其中陽性對(duì)照組采用環(huán)磷酰胺40mg/kg腹腔注射。2 個(gè)劑量組分別按臨床治療量的1、2 倍劑量進(jìn)行。將藥品用生理鹽水分別稀釋成1mg/ml，2mg/ml。兩個(gè)劑量組按0.28ml/20g劑量將兩種稀釋藥品經(jīng)口灌胃給藥（麻佛微素為犬貓寵物專用藥，需要把用藥量換算成小鼠的劑量。采用動(dòng)物劑量換算公式Da = Db×Rab 符號(hào)Da ，Db 分別是犬和小鼠公斤體重劑量mg·kg- 1；Rab是由犬到小鼠的換算系數(shù)）。陰性對(duì)照組用生理鹽水灌胃，操作方法與灌胃體積同試驗(yàn)組。

（2）骨髓細(xì)胞液的制備：于第2 次染毒后6 h 將小鼠脫頸處死，取小鼠兩側(cè)股骨，剔去肌肉，用濾紙或紗布擦去血污和肌肉碎片，剪去股骨兩端，用注射器吸取小牛血0.05ml反復(fù)沖洗骨髓腔數(shù)次。

（3）涂片：將沖洗液滴在載玻片上推片。每個(gè)股骨推片2張，自然干燥。

（4）固定：在干燥的玻片上滴加1滴甲醇，自然干燥。

（5）染色：將固定好的涂片用姬姆薩氏染色25min，用蒸餾水沖洗干凈，干燥備檢。

（6）鏡檢：嗜多染紅細(xì)胞（PCE）呈灰藍(lán)色，成熟正染紅細(xì)胞呈紅色。每只小鼠計(jì)數(shù)1000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞中含微核的嗜多染紅細(xì)胞數(shù)，計(jì)算微核率（‰）。測(cè)完后，取其平均值，在一個(gè)細(xì)胞中出現(xiàn)兩個(gè)或多個(gè)微核，仍按一個(gè)微核細(xì)胞計(jì)算。微核率按下式計(jì)算，并以千分率表示：

（二）精子畸形試驗(yàn)

（1）劑量及分組：選用體重20 - 25g的雄性小鼠32只，隨機(jī)分為4組，每組8只，設(shè)陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組各一和兩個(gè)劑量組，連續(xù)給藥5天。陽性對(duì)照組采用環(huán)磷酰胺40mg/kg腹腔注射。2個(gè)劑量組分別按臨床治療量的1、2 倍劑量進(jìn)行。將藥品用生理鹽水分別稀釋成1mg/ml，2mg/ml。兩個(gè)劑量組按0.28ml/20g劑量將兩種稀釋藥品經(jīng)口灌胃給藥（麻佛微素為犬貓寵物專用藥，需要把用藥量換算成小鼠的劑量。采用動(dòng)物劑量換算公式Da = Db×Rab 符號(hào)Da ，Db 分別是犬和小鼠公斤體重劑量mg· kg- 1；Rab是由犬到小鼠的換算系數(shù)）。陰性對(duì)照組用生理鹽水灌胃，操作方法與灌胃體積同試驗(yàn)組。

（2）試驗(yàn)方法：于第1次給藥后的第35天，采用脫頸法處死小鼠，取出二側(cè)副睪，放入盛有2ml生理鹽水的平皿中。用眼科剪將副睪剪碎，靜止3 - 5min后輕輕搖動(dòng)。用四層擦鏡紙濾去組織碎片。濾液以1000 - 1500 r/min離心5min，去除大部分上清液，剩約0.5ml液體與沉淀物搖勻后，用滴管吸取1滴將其滴于潔凈的載玻片上，涂片，每只小鼠涂2張玻片，在空氣中干燥后，用甲醇固定5min。干燥后用2%伊紅染色1h，用蒸餾水輕沖，干燥備檢。

計(jì)數(shù)1000個(gè)精子中的畸形精子數(shù)，主要觀察以下畸形類型：無鉤、香蕉型、無定型、胖頭、尾折、雙頭、雙尾取其平均值，精子畸形率按下式計(jì)算：

（三）統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

每個(gè)劑量組之間，劑量組與相應(yīng)的陰性，陽性對(duì)照組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)方法比較，用生物統(tǒng)計(jì)中的T檢驗(yàn)處理數(shù)據(jù)。

三、結(jié)果與分析

（一）微核試驗(yàn)

由微核率統(tǒng)計(jì)可知，麻佛微素兩個(gè)劑量組與陰性對(duì)照組比較差異不顯著（P > 0. 05），兩個(gè)劑量組之間比較差異不顯著（P >0. 05）；兩個(gè)劑量組、陰性對(duì)照組與陽性對(duì)照組比較差異極顯著（P < 0. 01）。結(jié)果見表1。

微核見圖1-2：

（二）精子畸形試驗(yàn)

由精子畸形率統(tǒng)計(jì)可知，麻佛微素兩個(gè)劑量組與陰性對(duì)照組比較差異不顯著（P > 0. 05）；兩個(gè)劑量組之間比較差異不顯著（P >0. 05）；兩個(gè)劑量組、陰性對(duì)照組與陽性對(duì)照組比較差異極顯著（P < 0. 01）。結(jié)果見表2

精子畸形包括尾折疊，無定形，無鉤，香蕉形，胖頭，雙頭，雙尾等

見圖3-10：

四、討論與結(jié)論

新藥的特殊毒性試驗(yàn)包括致突變?cè)囼?yàn)和致畸試驗(yàn)，致突變?cè)囼?yàn)包括體外Ames試驗(yàn)，哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞（CHO、CHL）染色體畸變和體內(nèi)微核試驗(yàn)，精子畸形試驗(yàn)，小鼠睪丸精原細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)，顯性致死試驗(yàn)。

在致突變?cè)囼?yàn)中，小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)主要是對(duì)染色體結(jié)構(gòu)完整性的改變進(jìn)行評(píng)估，微核試驗(yàn)通過檢測(cè)哺乳動(dòng)物骨髓細(xì)胞中嗜多染紅細(xì)胞的微核率，間接反映骨髓細(xì)胞染色體畸變發(fā)生率的高低，從而判斷受試動(dòng)物是否具有致突變作用。小鼠微核試驗(yàn)是目前檢測(cè)化學(xué)物質(zhì)導(dǎo)致染色體損傷的方便快速的方法。

微核試驗(yàn)具有經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、快速的優(yōu)點(diǎn)，是檢測(cè)外來化合物對(duì)染色體損傷作用的重要試驗(yàn)，是檢測(cè)染色體或有絲分裂器損傷的一種遺傳毒性試驗(yàn)方法。無著絲粒的染色體片段或因紡錘體受損而丟失的整個(gè)染色體，在細(xì)胞分裂后期仍留在子細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)成為微核。于顯微鏡下計(jì)數(shù)PCE中的微核。如果與對(duì)照組比較，處理組PCE微核率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的增加，并有劑量-反應(yīng)關(guān)系，則可認(rèn)為該受試物是哺乳動(dòng)物體細(xì)胞的致突變物。

精子畸形是決定精子形成的基因發(fā)生突變的結(jié)果。常染色體和Y-性連鎖基因突變及某些染色體重排，如性-常染色體易位，也可使精子發(fā)生畸形。小鼠精子畸形試驗(yàn)?zāi)茉u(píng)價(jià)受試物對(duì)精子生成、發(fā)育的影響，可檢測(cè)受試物在體內(nèi)對(duì)生殖細(xì)胞的遺傳毒性作用。小鼠精子畸形試驗(yàn)是對(duì)已知的生殖細(xì)胞致突變物具有高度的敏感性，它已被公認(rèn)為檢測(cè)受試物對(duì)生殖細(xì)胞致突變作用的一種標(biāo)準(zhǔn)的體內(nèi)試驗(yàn)方法。此兩種方法是對(duì)藥物進(jìn)行毒理學(xué)評(píng)價(jià)中很好的體內(nèi)試驗(yàn)項(xiàng)目。

在微核試驗(yàn)中，麻佛微素劑量組中有微核出現(xiàn)，但各劑量組與陰性對(duì)照組比較差異不顯著，各劑量組之間比較差異也不顯著，且各劑量組、陰性組與陽性組比較差異顯著。說明麻佛微素對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞染色體無致畸變作用。

在精子畸形試驗(yàn)中，麻佛微素劑量組中有畸形精子出現(xiàn)，但各劑量組與陰性對(duì)照組比較差異不顯著，各劑量組之間比較差異也不顯著，且各劑量組、陰性組與陽性組比較差異顯著。說明麻佛微素對(duì)雄性小鼠的精子無致畸變作用。

化學(xué)物質(zhì)的致突變性與其致癌性密切相關(guān)。有些與麻佛微素同屬氟喹諾酮類藥物如培氟沙星可引起精子畸變率增高和睪丸萎縮，氧氟沙星能引起哺乳動(dòng)物胎兒死亡率增加，已經(jīng)顯示出一定的致突變性。據(jù)沈建中等報(bào)道，馬波沙星對(duì)哺乳動(dòng)物體細(xì)胞和生殖細(xì)胞無致突變性。本文選擇了微核試驗(yàn)和精子畸形試驗(yàn)觀察麻佛微素對(duì)哺乳動(dòng)物體細(xì)胞，生殖細(xì)胞的致突變性（染色體突變）。試驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為，麻佛微素對(duì)哺乳動(dòng)物體細(xì)胞和生殖細(xì)胞無致突變性。與沈建中報(bào)道的結(jié)論相符合。

綜上所述，麻佛微素不具有致突變性，不存在遺傳毒性，是一種安全的新一代氟喹諾酮類抗菌藥，可以在臨床上安全使用該藥。

參考文獻(xiàn)：

[1] 王志強(qiáng)，陳杖榴.動(dòng)物專用氟喹諾酮類抗菌新藥—麻保沙星[J].中獸醫(yī)藥雜志，2001（04）.

[2] Eyett Burton C. Marbofloxacln：an advanced fluoroquinolone for use in beef and dairy cattle[J].Cattleprac-tice ，1997（4）.

[3] 邱銀生，吳佳.動(dòng)物專用氟喹諾酮類藥物研究進(jìn)展簡(jiǎn)介[J].中國獸藥雜志，1998（03）.

[4] 唐雪蓮，佟恒敏.喹諾酮類藥物研究進(jìn)展及在獸醫(yī)臨床的應(yīng)用問題[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2001（03）.

[5] 朱蓓蕾主編.動(dòng)物性食品藥物殘留[M].上海科學(xué)技術(shù)出版社，1994.

[6] 王昱，朱宇熹.微核的研究及應(yīng)用[J].重慶醫(yī)學(xué)，2003（05）.

[7] 沈建中主編.動(dòng)物毒理學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002.

[8] 黃幸紓，陳星若.環(huán)境化學(xué)物致突變、致畸、致癌試驗(yàn)方法[M].浙江科學(xué)技術(shù)出版社，1985.

[9] 沈建忠，肖希龍，張素霞，等.馬波沙星的致突變性和致畸性研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2003（03）.

[10]李洪龍，胡闖，王智航，等.中藥腸寧Ⅱ?qū)π∈蟮木踊卧囼?yàn)和微核試驗(yàn)[J].中國獸醫(yī)雜志，2008（08）.

[11] 關(guān)立增，鞠玉琳.中藥“壯陽促孕散”對(duì)小白鼠微核和精子畸形試驗(yàn)的研究[J].延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào)，2005（04）.

[12] 李湘鳴，陳秀云，周華珠，等.萊克多巴胺的微核與精子畸形試驗(yàn)評(píng)價(jià)[J].衛(wèi)生毒理學(xué)雜志，2003.

[13] 黃繼漢，黃曉暉，陳志揚(yáng)，等.藥理試驗(yàn)中動(dòng)物間和動(dòng)物與人體間的等效劑量換算[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2004（09）.

[14] 徐淑云，卞如潦，陳修.藥理實(shí)驗(yàn)方法[M ].北京：人民衛(wèi)生出版社，2001.

[15] Chapin E Robert. Method in Toxicology （Part A），Male Repro-ductive Toxicology[M].Academic Pr，1993.

[16] 明道緒主編.生物統(tǒng)計(jì)附實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[M].北京.中國農(nóng)業(yè)出版社，2002.

[17] 李大軍，權(quán)伍榮.過氧化氫對(duì)小鼠骨髓微核率和孕鼠胚胎著床及生長(zhǎng)的影響[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007（06）.

[18] 孫立魁，黃經(jīng)春，朱雪濤.用小鼠精子畸形試驗(yàn)評(píng)價(jià)正海生物膜遺傳毒性的研究[J].醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)與臨床，2006（02）.

[19] 于增杰，聶芳紅，陳進(jìn)軍.千里光提取物的小鼠精子畸形試驗(yàn)[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2007（02）.