GC-MS/MS 法同時分析煙葉中42 種有機酸

王 冰，余晶晶，蔡君蘭，郭吉兆，鄒西梅，李小蘭，崔華鵬，張曉兵，劉紹峰，謝順萍，吳晶晶*

1. 中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2 號 450001

2. 廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，南寧市西鄉(xiāng)塘區(qū)北湖南路28 號 530001

3. 貴州中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，貴陽市小河區(qū)開發(fā)大道96 號 550000

煙草中有機酸可分為脂肪酸和非脂肪酸。各短鏈及長鏈脂肪酸由于其揮發(fā)、半揮發(fā)性及其特征香氣和本身的酸性，對卷煙香氣質(zhì)量如卷煙的勁頭、刺激性等產(chǎn)生顯著影響［1-3］。而非脂肪類有機酸（羥基酸、氧代酸、芳香酸等），也具有特征的香氣和吃味；例如，乳酸具有奶香味，能使煙氣更柔順醇和；4-氧代壬酸具有刺激的、辛辣的味道，能增加煙氣豐滿度；苯甲酸表現(xiàn)為弱的、淡的醇和香味；肉桂酸具有和順的、醇和的，微弱的香脂香味等［4-5］。因此，研究煙葉中有機酸的種類和含量對了解煙草的感官品質(zhì)和改進卷煙配方具有重要的價值和意義。目前國內(nèi)外關(guān)于有機酸定性定量的方法較多，主要有離子色譜法［6-8］、毛細管電泳法［9-11］、液相色譜法［12-13］、氣相色譜法等［14-17］。離子色譜、毛細管電泳、液相色譜法基本用于含量高的多元酸和多羥基酸的分析。在氣相色譜法中，由于前處理中應(yīng)用了甲酯化、硅烷化等衍生方法，基本能分析揮發(fā)性酸及半揮發(fā)性酸，但是，對于煙葉中含量低的揮發(fā)性脂肪酸（如：異丁酸、巴豆酸、4-甲基戊酸、2-辛烯酸等），高級脂肪酸（十一酸、12-甲基十四烷酸、十七酸、二十酸）及其他非脂肪有機酸（如4-氧代壬酸、肉桂酸、3-苯基丙酸、2-甲氧基苯甲酸等），由于受儀器靈敏度的限制及雜質(zhì)干擾影響，均難以準確定量。近年來，串聯(lián)質(zhì)譜由于其更高的選擇性和靈敏度被用于農(nóng)藥［18］、代謝物［19］等分析研究工作中，2014 年，Lin 等［20］應(yīng)用GC-MS/MS 對煙葉中的有機酸進行了分析,由于樣品沒有經(jīng)過衍生化，目標物僅包含個別揮發(fā)酸及部分高級脂肪酸，且峰形拖尾。本研究中基于GC-MS/MS 技術(shù)，建立了硅烷化衍生同時檢測煙葉中42 種有機酸的方法，旨在為煙葉有機酸高通量分析提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

選擇4 種類型煙葉（烤煙、白肋煙、香料煙、曬紅煙）樣品。其中烤煙樣本又包括清香型、中間香型、濃香型樣品。實驗樣品共計16 個，其信息見表1。

甲酸、乙酸、丁酸、2-甲基丁酸、巴豆酸、異戊酸、戊酸、異戊烯酸、惕各酸、己酸、庚酸、辛酸、癸酸、十七酸、亞油酸、油酸、亞麻酸、硬脂酸、十九酸、二十酸（純度均＞98.0%，加拿大TRC 公司）；3-甲基戊酸、4-甲基戊酸、2-辛烯酸、壬酸、反-2-己烯酸、十一酸、十二酸、十四酸、12-甲基十四烷酸、十六酸（純度均＞98.0%，北京百靈威公司）；乳酸、乙酰丙酸、2-呋喃甲酸、3-羥基丙酸、苯甲酸、苯乙酸、間甲基苯甲酸、4-氧代壬酸、2-羥基苯甲酸、肉桂酸（＞98.0%，美國Sigma Aldrich 公司）；二氯甲烷（色譜純，美國Acros Organics 公司）；磷酸（分析純，天津科密歐試劑開發(fā)中心）；N,O-雙（三甲硅基）三氟乙酰胺（BSTFA，美國 Sigma Aldrich 公司）。

TRACE 1310／TSQ QUANTUM XLS 氣 相 色譜/串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS/MS，美國Thermo Scientific 公司）；CP224S 電子天平（感量0.000 1 g，德國Sartorius 公司）；Advanced Multi-Tube Vortexer數(shù)顯型渦旋儀（美國Talboys 公司）；702 SM Titrino pH 計（瑞士Metrohm 公司）。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液配制

分別稱取42 種一定量的有機酸標品于10 mL容量瓶中，配制單標母液。取一定量的各單標母液于10 mL 容量瓶中，配制混標母液。梯度取混標母液于7 個10 mL 容量瓶中，配制7 級混標，制作標準曲線。采用反-2-己烯酸為內(nèi)標，內(nèi)標質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL。

表1 樣品信息Tab.1 Leaf sample information

1.2.2 樣品處理及分析

pH 調(diào)節(jié)溶液配制：將 60 g NaH2PO4·2H2O 溶于 90 mL 水中，再加入 9.5 g 85% H3PO4配成泡發(fā)液。

萃取及衍生化：稱取煙粉2 g，加入2 mL pH調(diào)節(jié)溶液，細玻棒攪拌后，用1 mL pH 調(diào)節(jié)溶液淋洗玻棒，使煙粉充分浸潤。加入75 μ g/mL 的反-2-己烯酸內(nèi)標溶液100 μL，泡發(fā)30 min，此時體系pH 約為2.5。加入15 mL 二氯甲烷萃取液，于2 500 r/min 下渦旋20 min，靜置，過有機相濾膜。取濾液1 mL，加入BSTFA 衍生化試劑150 μL，擰緊密封蓋后搖勻，于60 ℃下衍生40 min，樣品冷卻至室溫，進GC-MS/MS 分析。分析條件如下：

色譜柱：DB-5MS（60 m×0.25 mm id×0.25 μm df）毛細管柱；進樣口溫度：280 ℃；載氣：He（＞99.999%），流速1.0 mL/min；程序升溫：40 ℃保持3 min，以4 ℃/min 升至 280 ℃并保持20 min；進樣量：1.0 μL，分流比10∶1；傳輸線溫度：280 ℃；電離（EI）能量：70 eV；離子源溫度：300 ℃；四極桿溫度：180 ℃；電子倍增器電壓：1.491 kV；掃描方式：SIM 和SCAN；質(zhì)量掃描范圍：50～400 amu；監(jiān)測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）。42 種化合物質(zhì)譜采集參數(shù)見表2。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

采用標樣對照，NIST98 譜庫檢索方法定性，內(nèi)標工作曲線法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗條件的優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件的確定

通過對500 ng/mL 混標溶液一級全掃描，選取信號響應(yīng)較高且基質(zhì)無干擾的特征離子為母離子。以母離子為前體離子，進行產(chǎn)物離子掃描，選取信號響應(yīng)高，基質(zhì)無干擾的離子為子離子。每種化合物選取兩對離子對，分別為定性定量離子對，依次加以 5、10、15、20、25 和 30 eV 碰撞能，選取離子對響應(yīng)最高的碰撞能。優(yōu)化好的定性定量離子對及相應(yīng)的碰撞能量如表2 所示。通過色譜分離及串聯(lián)質(zhì)譜的進一步降噪，提高了方法的靈敏度及選擇性，實現(xiàn)了42 種有機酸的同時準確定量。代表性有機酸在串聯(lián)質(zhì)譜與一級質(zhì)譜上的響應(yīng)比較如圖1 所示：在一級質(zhì)譜上無法準確定量的8 種化合物（異丁酸、4-氧代壬酸、3-苯基丙酸、2-甲氧基苯甲酸、丙酸、巴豆酸、4-甲基戊酸、肉桂酸）在串聯(lián)質(zhì)譜上均能準確定量。

2.1.2 前處理條件的確定

選取代表性酸性成分甲酸、乙酸、3-甲基丁酸、戊酸、己酸、十六酸、亞油酸、乳酸、苯甲酸進行前處理條件的優(yōu)化。分別對泡發(fā)煙葉pH（5.4、4.4、3.9、3.4、2.9、2.5、2.0）、渦旋萃取時間（5、10、15、20、25 min）、衍生溫度（室溫、60 ℃）、衍生時間（10、20、30、40、50 min）、衍生化試劑用量（50、100、150、200、250、300 μL）條件進行了考察。確定將泡發(fā)煙葉體系pH 調(diào)整至2.5，萃取20 min 后，取 1 mL 上清液加入 150 μL BSTFA 于 60 ℃衍生40 min 為前處理條件。按每組實驗數(shù)據(jù)最大值歸一化結(jié)果作圖，結(jié)果見圖2。

表2 42 種有機酸保留時間及質(zhì)譜參數(shù)Tab.2 RT and MS parameters for 42 organic acids

圖1 代表性化合物串聯(lián)質(zhì)譜與一級質(zhì)譜離子流圖比較Fig.1 Comparison of ion current diagrams by MS-MS and MS of representative compounds

圖2 前處理條件優(yōu)化結(jié)果Fig.2 Optimized pretreatment conditions

2.2 方法評價

2.2.1 標準曲線、檢出限及定量限

以各目標物與內(nèi)標物的離子對響應(yīng)面積比為縱坐標，濃度（ng/mL）為橫坐標作圖，得到標準工作曲線。分別以3 倍和10 倍信噪比（S/N）確定檢出限（LOD）和定量限（LOQ）。結(jié)果（表3）顯示，目標物的線性關(guān)系良好，可以滿足定量分析要求。

2.2.2 方法精密度及回收率

選取典型烤煙樣品，一天內(nèi)進行5 平行實驗以考察方法日內(nèi)精密度，對所選樣品連續(xù)5 天進行實驗以考察方法日間精密度。以實際樣品含量為參考，根據(jù)所對應(yīng)的酸在煙末中含量的0.5、1、2 倍進行低、中、高加標回收率實驗。結(jié)果表明：各目標酸性成分平均回收率為76%～110%，日內(nèi)、日間精密度（除3-甲基戊酸、4-甲基戊酸、癸酸外）均小于10%。

2.3 樣品分析

采用所建立的方法對12 個烤煙C3F 樣品（清香型烤煙4 個，中間香型烤煙4 個，濃香型烤煙4個），2 個白肋煙樣品，1 個香料煙和1 個曬紅煙樣品進行測定，具體樣品信息見表1。

2.3.1 3 種香型烤煙之間酸性成分差異分析

對清香型、中間香、濃香型烤煙的測定結(jié)果分別求平均值后進行比較分析，篩選出不同香型間差異性酸性成分21 種，對每種目標物進行最大值歸一化作圖。結(jié)果（表4、圖3）顯示：①3 種香型烤煙中差異性大的酸性成分主要是C5～C8碳鏈脂肪酸（0.1～2 μg/g）、芳香酸（2～6 μg/g）、羥基酸（1～7μg/g）及氧代酸（0.05～0.8 μg/g），高級脂肪酸僅需關(guān)注十四酸（15～22 μg/g）和亞麻酸（300～500 μg/g）。②C5～C8中碳鏈直鏈脂肪酸（戊酸、己酸、庚酸、辛酸）、芳香酸（苯甲酸、苯乙酸、肉桂酸、2-羥基苯甲酸）及十四酸、惕各酸在濃香型煙葉中含量顯著高于清香型及中間香型煙葉；4-甲基戊酸含量顯著低于清香型及中間香型煙葉。③異戊酸、3-甲基戊酸，短鏈羥基酸（3-羥基丙酸、乳酸）及亞麻酸、2-呋喃甲酸在中間香型烤煙中含量顯著高于濃香型和清香型。④清香型烤煙中4-氧代壬酸、2-甲氧基苯甲酸含量最高。

2.3.2 不同類型煙葉之間酸性成分差異分析

比較分析烤煙（取均值）、白肋煙（取均值）、香料煙、曬紅煙的測定結(jié)果，篩選出不同類型煙葉間差異性酸性成分34 種，對每種化合物進行最大值歸一化作圖。結(jié)果（表5、圖4）顯示：①大多數(shù)低級、高級脂肪酸及羥基酸、氧代酸在香料煙中含量最高，在烤煙中含量最低，白肋煙及曬紅煙中的含量居中。②代表性芳香酸如苯甲酸、苯乙酸及異戊酸和巴豆酸在白肋煙中含量最高，遠高于在其他3 種類型煙葉中的含量。③以往未檢出的2-辛烯酸、2-甲氧基苯甲酸在曬紅煙中含量最高。

表3 42 種目標物的線性方程、回收率、RSD（n=5）和檢出限Tab.3 Linear equations, spiked recoveries, RSD（n=5）and limits of detection of 42 organic acids

表4 3 種香型烤煙中21 種酸性成分含量Tab.4 Contents of 21 organic acids in flue-cured tobacco of 3 flavor types （μg·g-1）

圖3 3 種香型烤煙中21 種有機酸含量雷達圖Fig.3 Radar diagram displaying the contents of 21 organic acids in flue-cured tobacco of 3 flavor types

表5 4 種類型煙葉中34 種酸性成分含量Tab.5 Contents of 34 organic acids in 4 types of tobacco （μg·g-1）

圖4 4 種類型煙葉中34 種有機酸含量雷達圖Fig.4 Radar diagram displaying the contents of 34 organic acids in 4 types of tobacco

3 結(jié)論

建立了基于硅烷化-GC-MS/MS 技術(shù)的煙葉中有機酸分析方法，本方法可分析的目標化合物多，涵蓋了C1～C20脂肪酸、羥基酸、芳香酸、氧代酸等，本研究中共定量分析了煙草中的42 種有機酸。本方法精密度好，準確度高，操作簡單。與一級質(zhì)譜檢測方法相比，本方法靈敏度與選擇性大幅提高，對于在一級質(zhì)譜上檢測不到的目標物（如：異丁酸、4-氧代壬酸、3-苯基丙酸、2-甲氧基苯甲酸）、有干擾不能進行準確定量的目標物（如：丙酸、巴豆酸、4-甲基戊酸、肉桂酸）及含量較低的酸性成分（如：2-辛烯酸、十一酸、12-甲基十四烷酸、十七酸、二十酸等），均可準確定量。本方法可用于研究不同類型及同一類型不同香型煙葉中的有機酸。