實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)及細胞培養(yǎng)法在流感病毒檢測中的應(yīng)用價值

羅周正 張麗艷 李 賀 杜 波

（阜新市衛(wèi)生健康服務(wù)中心（阜新市疾病預(yù)防控制中心）檢驗檢測部，遼寧 阜新 123000）

流感病毒又被稱之為流行性感冒病毒，在臨床上屬于極為常見的傳染性疾病之一，且具有傳播速度快、傳染范圍廣及發(fā)病率高等特點，這與流感病毒極易發(fā)生變異有直接的關(guān)系。流感患者的主要臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、頭疼畏寒以及全身酸痛等癥狀，對患者的生理、心理造成了嚴重的影響，這一現(xiàn)象引起了社會的高度重視。為有效分離及鑒定流感病毒，有必要尋找一種精準(zhǔn)、實用的監(jiān)測方法，是預(yù)防及控制流感的關(guān)鍵[1]。因此，本研究對阜新市流感監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)實驗室進行檢測的流感病毒樣本分別實施實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)及細胞培養(yǎng)法，旨在探討二者在流感病毒檢測中的應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年1月至2018年12月阜新市哨點醫(yī)院采集的4026份疑似流感咽拭樣本作為研究對象，由專業(yè)病毒采樣管進行操作，均于3 d內(nèi)未服用過任何抗病菌藥物的患者咽拭樣本。以《甲型H1N1流感病毒實驗室檢測技術(shù)方案》、《流行性感冒診斷標(biāo)準(zhǔn)》、《病原生物學(xué)檢驗-病毒》及《流行性感冒病毒》為參考依據(jù)。將以上所有咽拭樣本及時送往流感監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)實驗室，將24 h內(nèi)未能及時送檢的樣本放置在-70 ℃的冰箱中進行冷凍保存。

1.2 檢查儀器及檢測方法

1.2.1 儀器型號與試劑 ABI 7500 Fast熒光PCR擴增儀購自美國Thermo公司；核酸提取采用RNA病毒提取試劑盒RNeasy Mini Kit（德國QIAGEN公司，型號74104）；PCR反應(yīng)試劑購自碩世生物科技有限公司；狗腎傳代細胞由遼寧省疾病預(yù)防控制中心感染與傳染性疾病防制所提供[2-3]。

1.2.2 樣本采集與處理 采用核酸提取盒實時熒光定量PCR法提取樣本。擴增條件為：1個循環(huán)50 ℃/30 min，95 ℃/5 min，95 ℃/10 s，45個循環(huán)，55 ℃/40 s，45個循環(huán)，采取羧基熒光素（FAM）信道在55 ℃下進行熒光檢測[4-5]。

1.2.3 病毒細胞分離鑒定 將提取的樣本病毒置入10000 U/mL雙抗后，嚴密觀察細胞病理形態(tài)變化，并采用紅細胞凝集試驗檢測樣本，若超過1∶16比例應(yīng)結(jié)合紅細胞凝集抑制試驗檢測及鑒定有關(guān)亞型血清[6-7]。

1.3 觀察指標(biāo) 統(tǒng)計兩組研究期間流感病毒不同類型檢測結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行分析。流感病毒不同類型陽性率等計數(shù)資料采用[n（%）]表示，組間比較行χ2檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。兩個連續(xù)變量間呈線性相關(guān)時，使用Pearson積差相關(guān)系數(shù)進行分析。

2 結(jié)果

2.1 兩組流感病毒樣本不同分型檢測結(jié)果比較 研究組檢出陽性樣本512份。其中，檢出新甲H1型149份，對照組分離毒株62株；研究組H3亞型206份，對照組分離毒株109株；研究組B型157份，對照組分離毒株97株，各組均未檢出H5、H7、H9亞型。研究組檢出陽性樣本總數(shù)與對照組毒株總數(shù)呈正相關(guān)，且新甲H1型、H3型、B型與毒株分別呈正相關(guān)（P＜0.05）。見表1。

2.2 兩組流感病毒標(biāo)本不同類型陽性率比較 研究組檢出流感病毒陽性率為25.68%，對照組檢出流感病毒陽性率為6.66%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2

表1 兩組流感病毒樣本不同分型檢測結(jié)果比較（n）

表2 兩組流感病毒標(biāo)本不同類型陽性率比較[n（%）]

3 討論

流感病毒的特點為潛伏期短、傳染性強及容易發(fā)生變異，屬于RNA病毒[8]。為此，加強流感的預(yù)防及控制，已成為眾多學(xué)者需面臨解決的首要問題。目前，針對流感病毒的檢測方式有很多，包括膠體金快速檢測、細胞培養(yǎng)等方法。其中，膠體金快速檢測敏感度相對較低，往往無法單獨用于診斷及篩查疾病中[9]。細胞培養(yǎng)法作為流感病原學(xué)監(jiān)測的基礎(chǔ)，是流感病毒檢測最可靠的方式之一。但因其無法實現(xiàn)快速診斷的要求，未得以在臨床進一步推廣[10-11]。實時熒光定量PCR技術(shù)是1996年美國學(xué)者研發(fā)的一種新型技術(shù)，該技術(shù)不僅具備解決PCR污染的問題，同時還有較強的自動化程度及特異性，被臨床譽為流感病毒檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”[12]。實時熒光定量PCR技術(shù)可通過擴增至每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號，促使熒光信號強度增強，經(jīng)過一個循環(huán)后，被熒光強度信號收集，進一步通過熒光強度觀察產(chǎn)物量的變化情況，最終建立熒光擴增曲線圖[13-15]。

本研究結(jié)果顯示，研究組檢出流感病毒陽性率高于對照組（P＜0.05），由此可證實，實時熒光定量PCR法檢測的準(zhǔn)確性、靈敏度更高。但從根本上而言，細胞培養(yǎng)法的靈敏度相對較高，但因受樣本采集時間、樣本活病毒含量、樣本運輸以及保存要求差異等因素的影響，最終導(dǎo)致樣本中具有感染狗腎代謝細胞活力的活病毒存在假陰性現(xiàn)象。而實時熒光定量PCR檢測對象為病毒核酸，不管是活病毒還是病毒降解物，只需1～10 RNA拷貝數(shù)少量核酸即可迅速檢出。

總而言之，根據(jù)流感病毒臨床特點采用實時熒光定量PCR技術(shù)能夠有效預(yù)防及控制流感大流行，可將其作為病毒篩查的一種行之有效的檢測方法。