菟絲子多糖的抗氧化活性和抑制腫瘤細(xì)胞增殖的研究

葉春林，KHUDOYBERDIEV Ilkhomjon，陳 穎，李瀚鑫

浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310023

菟絲子是菟絲子屬植物菟絲子(CuscutachinensisLam.)的種子，是一味普遍使用的中藥材，具有益精、明目、補(bǔ)肝腎、抗氧化和抗衰老的作用，還可以增強(qiáng)免疫力、調(diào)節(jié)血脂與血糖[1-2]。菟絲子中含有許多種化學(xué)成分，如黃酮類、多糖類、多酚類、甾體類、皂苷類和生物堿類等[3]。多糖是組成生命、生物體和遺傳物質(zhì)的重要成分之一，植物、微生物細(xì)胞壁和動(dòng)物細(xì)胞膜中含有大量多糖，多糖還參與分子間的識(shí)別、信號(hào)傳導(dǎo)等生理生化活動(dòng)[4-5]。菟絲子多糖是中藥菟絲子(Semen Cuscutae)的主要藥理藥效成分之一，目前，對(duì)其生物活性的研究主要集中在抗衰老以及增強(qiáng)免疫系統(tǒng)功能等方面[6-7]，對(duì)其抗氧化研究有零星的報(bào)道[8]，對(duì)其抗腫瘤活性研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

作者通過(guò)菟絲子多糖對(duì)DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基的清除效果以及多糖的總還原能力的測(cè)定等抗氧化模型，研究其抗氧化活性。在此基礎(chǔ)上，考察了菟絲子多糖對(duì)人肺腺癌細(xì)胞A549、人肝癌細(xì)胞HepG2、人胰腺癌細(xì)胞PANC-1和人正常肝細(xì)胞L-02、人胚肺成纖維細(xì)胞HFL-1生長(zhǎng)的抑制作用，從而確定菟絲子多糖的抗腫瘤活性，為其開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

菟絲子：杭州市西湖區(qū)藥房，粉碎過(guò)60目篩；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、維生素C(Vc)和MTT：Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基和RPMI 1640培養(yǎng)基：美國(guó)Life Technologies公司；小牛血清：杭州四季青生物技術(shù)有限公司；L-02、HFL-1、A549、HepG2和PANC-1細(xì)胞：中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

BS2202S精密天平：Sartorius公司；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水式真空泵：河南鞏義市英峪予華儀器廠；DKS-24型電熱恒溫水浴鍋：杭州藍(lán)天化驗(yàn)儀器廠；752紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司；XD202倒置顯微鏡：南京江南永新光學(xué)有限公司；MK3酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀：美國(guó)Thermo公司；BB15 CO2培養(yǎng)箱：德國(guó)Heraeus公司。

1.2 方法

1.2.1 菟絲子多糖的提取

菟絲子多糖的提取工藝參考文獻(xiàn)[8]，采用熱水浸提法。修改如下：稱取適量的菟絲子粉于三口燒瓶中，在80 ℃和料液比1∶30 (g/mL)條件下，提取100 min，提取液減壓抽濾，去除濾渣。將濾液在真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮至適當(dāng)體積，加入4倍體積的無(wú)水乙醇，靜置、沉淀1 d，在4 200 r/min下離心，收集沉淀，獲得粗多糖。將粗多糖溶解，用半透膜透析1 d，然后在多糖溶液中加入氯仿和正丁醇的混合溶液(V氯仿∶V正丁醇=4∶1)，除去蛋白，然后在脫除蛋白的多糖溶液中加入無(wú)水乙醇(乙醇的加入體積為母液體積的4倍)，得到的沉淀依次用乙醇、丙酮及乙醚反復(fù)洗滌，經(jīng)離心、真空干燥得到菟絲子多糖。

1.2.2 DPPH自由基的清除活性測(cè)定

菟絲子多糖DPPH自由基的清除活性測(cè)定參考文獻(xiàn)[9]。修改如下：取不同濃度的菟絲子多糖溶液4 mL，加入等體積的DPPH乙醇溶液，混勻后，于暗處室溫放置0.5 h,然后在517 nm處測(cè)定吸光度(As)。同時(shí)測(cè)定不加樣品的DPPH乙醇溶液作為空白對(duì)照的吸光度(A0)，測(cè)定不加DPPH的多糖溶液和乙醇混合后的吸光度(Ac)。以抗壞血酸(Vc)做陽(yáng)性對(duì)照，計(jì)算菟絲子多糖及Vc的DPPH自由基清除率。

1.2.3 羥自由基的清除活性測(cè)定

參考文獻(xiàn)[10-11]測(cè)定羥自由基的清除能力。修改如下：2 mL不同質(zhì)量濃度的多糖樣品(0.2～1.0 mg/mL)與1 mL鄰二氮菲溶液(5 mmol/L)、0.5 mL硫酸亞鐵(7.5 mmol/L)、0.5 mL H2O2(3%)和1 mL的0.05 mol/L磷酸鈉緩沖液(pH 7.4)混勻后37 ℃水浴1 h，在510 nm處的吸光度記錄為A1，用蒸餾水代替樣品吸光度記為A2，用蒸餾水代替 H2O2溶液吸光度記為A3。Vc做陽(yáng)性對(duì)照，計(jì)算菟絲子多糖及Vc的羥自由基清除率。

1.2.4 超氧陰離子的清除活性測(cè)定

參考文獻(xiàn)[12]測(cè)定超氧陰離子的清除活性。修改如下：取4 mL不同濃度的多糖溶液，然后分別加入0.1 mol/L的Tris-HCl (pH 8.2)溶液2.5 mL(25 ℃水浴中預(yù)熱)、6 mmol/L的鄰苯三酚溶液2.5 mL，充分混勻，反應(yīng)5 min后，加入0.5 mL鹽酸(8 mol/L)終止反應(yīng)，299 nm處測(cè)吸光度，以Vc做陽(yáng)性對(duì)照。A0為對(duì)照品的吸光度，A1為樣品的吸光度。

1.2.5 菟絲子多糖的總還原能力測(cè)定

菟絲子多糖的總還原能力測(cè)定參考文獻(xiàn)[13]。修改如下：0.5 mL不同質(zhì)量濃度的多糖溶液(0.2～1.0 mg/mL)與0.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液、0.5 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.6)充分混勻；溶液在50 ℃的水浴中反應(yīng)0.5 h后，再加入10%的三氯乙酸0.5 mL，混勻。溶液在1 500g條件下，離心10 min。取上清液0.5 mL，與0.1 mL 0.1% FeCl3以及1.5 mL蒸餾水混勻，常溫放置5 min，在700 nm處測(cè)吸光度。以BHT做陽(yáng)性對(duì)照，吸光度越高，還原力越強(qiáng)。

1.2.6 菟絲子多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞以及正常細(xì)胞增殖的影響

在96孔培養(yǎng)板中，分別接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L-02、HFL-1、A549、HepG2和PANC-1細(xì)胞，每孔0.2 mL(細(xì)胞數(shù)約104個(gè))，培養(yǎng)24 h后，分別加入一定濃度的藥物，每濃度平行3孔，加等量體積的培養(yǎng)液作為對(duì)照，置于37 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d，試驗(yàn)終止前4 h每孔加入5 mg/mL MTT 10 μL，培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入150 μL 0.04 mol/L DMSO (二甲基亞砜)，振蕩10 min，以492 nm為試驗(yàn)波長(zhǎng)，630 nm為參照波長(zhǎng)，用MK3型酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度，分別計(jì)算多糖對(duì)各種細(xì)胞的毒性。以細(xì)胞的存活率和藥物的不同濃度作圖，確定細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)[14-15]。IC50為細(xì)胞存活率達(dá)到一半時(shí)的藥物作用濃度。

細(xì)胞存活率=測(cè)試組OD平均值/對(duì)照組OD平均值×100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 7.5軟件，計(jì)算3次重復(fù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差并作圖。使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用t檢驗(yàn)分析組間差異的顯著性，P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 菟絲子多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力

在測(cè)定抗氧化劑清除自由基活性的模型中，DPPH自由基作為一個(gè)穩(wěn)定的自由基，被廣泛地應(yīng)用在抗氧化模型中[16]。由圖1可知，菟絲子多糖和Vc對(duì)DPPH自由基具有很好的清除作用，且清除率隨質(zhì)量濃度的升高而逐漸增大。菟絲子多糖的IC50為0.25 mg/mL，Vc的IC50為0.26 mg/mL，說(shuō)明菟絲子多糖具有很強(qiáng)的DPPH自由基清除能力，清除作用與Vc很接近?？赡苁禽私z子多糖中的羥基容易釋放·H，并與DPPH·配對(duì)，所以對(duì)DPPH自由基有很強(qiáng)的清除效果[17]。

注：與Vc對(duì)照組比較，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。圖2—圖3同。圖1 菟絲子多糖對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.1 DPPH scavenging activities of the polysaccharides

2.2 菟絲子多糖對(duì)羥自由基的清除作用

羥自由基是最具有活性和生理毒性的自由基，可導(dǎo)致生物體內(nèi)DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)氧化等不可逆損傷[18]。由圖2可知，菟絲子多糖和Vc對(duì)羥自由基的清除率具有濃度依賴性，隨著濃度的升高，清除率逐漸增大。菟絲子多糖的IC50為0.36 mg/mL，Vc的IC50為0.29 mg/mL，表明菟絲子多糖具有強(qiáng)的羥自由基清除活性?？赡苁窃摱嗵鞘莵嗚F離子螯合劑，能通過(guò)抑制Fenton反應(yīng)而減少羥自由基的生成，提高羥自由基的清除能力[19]。

圖2 菟絲子多糖對(duì)羥自由基的清除作用Fig.2 Hydroxyl scavenging activities of the polysaccharides

2.3 菟絲子多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力

超氧陰離子自由基被認(rèn)為是許多活性氧物質(zhì)的前體，對(duì)細(xì)胞非常有害[20]。在299 nm下測(cè)定菟絲子多糖和Vc對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用，結(jié)果見(jiàn)圖3，多糖質(zhì)量濃度從0.2 mg/mL增加到1.0 mg/mL時(shí)，對(duì)超氧陰離子的清除率從53.5%增長(zhǎng)到75.3%。菟絲子多糖對(duì)超氧陰離子自由基有很好的清除作用，多糖的IC50為0.18 mg/mL，Vc的IC50為0.16 mg/mL，IC50越小說(shuō)明抗氧化活性越好。可能是因?yàn)檩私z子多糖的伯、仲羥基的協(xié)同作用使鄰苯三酚在自氧化初期產(chǎn)生的超氧陰離子自由基形成穩(wěn)定的分子，從而有效地阻斷了自由基的反應(yīng)鏈[21]。

圖3 菟絲子多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用Fig.3 Superoxide scavenging activities of the polysaccharides

2.4 菟絲子多糖總還原能力的測(cè)定

由圖4可知，菟絲子多糖的還原能力隨質(zhì)量濃度的升高逐漸增大，呈濃度依賴性。當(dāng)質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí)，多糖和BHT的還原力(以700 nm處的OD值表示)分別為0.55和1.07，盡管多糖的還原能力比具有極強(qiáng)還原能力的BHT要低，但仍表現(xiàn)出較好的還原能力。菟絲子多糖的還原力與其抗氧化活性之間存在關(guān)系，菟絲子多糖通過(guò)自身的還原作用，給出電子將Fe3+還原成Fe2+，使Fe2+發(fā)生Perl’s Prussian藍(lán)反應(yīng)，普魯士藍(lán)的生成量越多，則700 nm處的吸光度越高[22]。

注：與BHT對(duì)照組比較，**表示差異極顯著(P<0.01)。圖4 菟絲子多糖的總還原能力Fig.4 Total reducing power of the polysaccharides

2.5 菟絲子多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞以及正常細(xì)胞的毒性研究

注：a為腫瘤細(xì)胞，b為正常細(xì)胞。與空白對(duì)照組比較，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。圖5 菟絲子多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞及正常細(xì)胞的毒性Fig.5 Cytotoxic effects of the polysaccharides on A549, HepG2, PANC-1, L-02, and HFL-1 cells

采用MTT的方法，考察菟絲子多糖對(duì)細(xì)胞的毒性。如圖5a所示，菟絲子多糖對(duì)人肺腺癌細(xì)胞A549、人肝癌細(xì)胞HepG2和人胰腺癌細(xì)胞PANC-1的生長(zhǎng)均有抑制作用，且隨著多糖質(zhì)量濃度的增加，抑制率也增加。當(dāng)菟絲子多糖質(zhì)量濃度分別為137.6、341.7、625.4 μg/mL時(shí)，對(duì)A549、HepG2和PANC-1生長(zhǎng)抑制率可達(dá)50%。表明菟絲子多糖能有效地抑制腫瘤細(xì)胞增殖，且對(duì)不同腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)的抑制效果存在一定的差異。菟絲子多糖對(duì)A549細(xì)胞的抑制作用比苦蕎茶多糖強(qiáng)[23]，對(duì)HepG2細(xì)胞的IC50與五葉地錦果實(shí)多糖接近[24]，而有關(guān)其對(duì)PANC-1細(xì)胞的增殖抑制作用還未見(jiàn)報(bào)道。

從圖5b可知，菟絲子多糖對(duì)人正常肝細(xì)胞L-02和人胚肺成纖維細(xì)胞HFL-1的毒性極小，IC50分別為1.223、1.299 mg/mL。在A549、HepG2和PANC-1腫瘤細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度時(shí)，正常細(xì)胞L-02和HFL-1的成活率在90%以上，表明菟絲子多糖可以選擇性抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，而對(duì)正常細(xì)胞增殖抑制作用很小。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)探究了菟絲子多糖的抗氧化和抗腫瘤活性。結(jié)果表明：隨著菟絲子多糖質(zhì)量濃度的增加，抗氧化和抗腫瘤活性增強(qiáng)。菟絲子多糖對(duì)DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基有很強(qiáng)的清除作用，清除能力與Vc接近。菟絲子多糖的還原力雖比極強(qiáng)還原性的BHT弱，但仍表現(xiàn)出較強(qiáng)的還原能力。菟絲子多糖對(duì)人肺腺癌細(xì)胞A549、人肝癌細(xì)胞HepG2和人胰腺癌細(xì)胞PANC-1細(xì)胞都有較好的抑制作用，IC50分別為137.6、341.7、625.4 μg/mL，而對(duì)正常細(xì)胞的增值抑制作用很小，對(duì)人正常肝細(xì)胞L-02和人胚肺成纖維細(xì)胞HFL-1的IC50分別為1.223、1.299 mg/mL，說(shuō)明菟絲子多糖能夠選擇性抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。