藥用植物質(zhì)量性狀的分子研究進(jìn)展＊

詹海仙，杜晨暉，李 睿，尚彩玲，張 瑜，胡 楠，裴香萍

（山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院 晉中 030619）

藥用植物是指全部或部分植株可以直接入藥或作為藥物生產(chǎn)的植物。我國(guó)藥用植物資源豐富，其應(yīng)用已有幾千年歷史。尤其是來源于特定產(chǎn)區(qū)的道地藥材，由于具有藥用成分含量高、臨床效果好的優(yōu)點(diǎn)，屬于我國(guó)的一種特色的傳統(tǒng)藥物[1]。造成藥用植物道地性與非道地性差異的主要原因包括種質(zhì)資源、生長(zhǎng)環(huán)境及氣候條件三個(gè)因素[2]，其中優(yōu)良的種質(zhì)資源是道地藥材優(yōu)良品質(zhì)形成的內(nèi)在因素，由于特定的基因調(diào)控植物次生代謝產(chǎn)物等有效成分的產(chǎn)生，因此，種質(zhì)資源包含的特定基因是藥材道地性形成的關(guān)鍵。由于大多數(shù)藥用植物為蟲媒異花授粉植物，栽培過程中易混雜，容易導(dǎo)致品種退化，進(jìn)而造成品質(zhì)和產(chǎn)量下降。因而研究種質(zhì)資源道地性形成的內(nèi)在機(jī)制和導(dǎo)致道地性形成的特定基因，是提高藥材品質(zhì)和選育優(yōu)良品種的基礎(chǔ)。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，藥用植物道地性相關(guān)質(zhì)量性狀研究、分子遺傳圖譜構(gòu)建及重要性狀基因的定位、克隆和轉(zhuǎn)化方面取得了較大的進(jìn)展，也為優(yōu)良性狀的定向培育提供了有效的指導(dǎo)工具。本文綜述了目前藥用植物道地性研究現(xiàn)狀、標(biāo)記開發(fā)、遺傳圖譜構(gòu)建、相關(guān)性狀數(shù)量性狀位點(diǎn)（QTL）定位、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、基因工程等技術(shù)對(duì)藥用植物相關(guān)性狀基因的挖掘現(xiàn)狀，以期為提高藥用植物種質(zhì)資源的道地性研究提供參考。

1 藥用植物道地性研究進(jìn)展

藥材品質(zhì)關(guān)系到臨床用藥的有效性，而道地藥材是藥材品質(zhì)的關(guān)鍵所在。道地藥材在其道地產(chǎn)區(qū)往往種植面積大，栽培管理規(guī)范，藥用成分含量高，因此，可獲得較大的經(jīng)濟(jì)效益。黃璐琦院士的道地藥材形成的模式假說認(rèn)為種質(zhì)資源、生長(zhǎng)環(huán)境及氣候條件是造成道地藥材與非道地藥材品質(zhì)差異的主要原因[3]。國(guó)內(nèi)外涉及藥用植物道地性相關(guān)的質(zhì)量性狀的研究技術(shù)主要集中在下面幾個(gè)方面，利用高效液相色譜（HPLC）對(duì)道地和非道地的唇形科植物丹參中3 種藥用成分的含量進(jìn)行了比較分析，證實(shí)道地產(chǎn)區(qū)的丹參中藥用成分含量遠(yuǎn)高于非道地產(chǎn)區(qū)[4]。通過對(duì)毛茛科植物白芍進(jìn)行HPLC 分析，建立了白芍道地性化學(xué)特征指紋圖譜，該指紋圖譜可用于白芍道地性和藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)[5]。利用HPLC 比較了不同基源和產(chǎn)地的桔?？浦参稂h參的特征圖譜，并建立了山西道地藥材潞黨參的HPLC 特征圖譜[6]。HPLC 還建立了三白草科植物魚腥草、毛茛科植物附子和白芍以及五加科植物人參等藥用植物的特征指紋圖譜，為研究上述植物的道地性提供了一系列參考數(shù)據(jù)。

采用近紅外光譜技術(shù)可以快速區(qū)分道地產(chǎn)區(qū)與非道地產(chǎn)區(qū)的廣陳皮和當(dāng)歸[7]。利用電子鼻傳感器的響應(yīng)值作為指標(biāo)對(duì)菊科植物白術(shù)和白菊、木犀科植物茉莉、薔薇科植物金櫻子氣味指紋變化進(jìn)行分析[8-9]。分子標(biāo)記技術(shù)在道地性藥材鑒定和分析上發(fā)揮了較大的作用，采用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA（RAPD）標(biāo)記結(jié)合HPLC 技術(shù)研究了3 個(gè)不同產(chǎn)地的山西道地藥材連翹的道地性[10]。將RAPD 標(biāo)記與SCAR 標(biāo)記結(jié)合，對(duì)羅漢果性別進(jìn)行早期鑒定[11]。DNA 條形碼技術(shù)是從基因水平區(qū)分道地中藥材，近年來在中藥真?zhèn)纹疯b別上的應(yīng)用很多，將DNA 條形碼與ISSR 分子標(biāo)記相結(jié)合鑒別不同產(chǎn)區(qū)的唇形科植物廣藿香[12]。通過DNA 條形碼技術(shù)可以準(zhǔn)確區(qū)分紫丹參、冬蟲夏草和雪膽及其偽品[13]。但是，由于道地性為微效多基因控制的數(shù)量性狀，與單基因控制的質(zhì)量性狀相比，數(shù)量性狀遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜，常規(guī)方法難以對(duì)道地性相關(guān)的基因數(shù)目、位置、效應(yīng)及作用方式進(jìn)行分析[3]。隨著現(xiàn)代分子生藥學(xué)和測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，數(shù)量遺傳學(xué)的方法，尤其是以分子遺傳連鎖圖譜和標(biāo)記開發(fā)為基礎(chǔ)的標(biāo)記-QTL 連鎖分析的方法成為揭示藥用植物道地性分子機(jī)理的重要手段。

2 藥用植物標(biāo)記開發(fā)及遺傳圖譜構(gòu)建

高密度的遺傳圖譜及QTL 定位研究有助于挖掘控制復(fù)雜性狀的重要性狀基因，分析相關(guān)性狀的遺傳機(jī)制。多態(tài)性的分子標(biāo)記是構(gòu)建遺傳圖譜并進(jìn)行相關(guān)性狀QTL 分析的基礎(chǔ)。這些標(biāo)記的開發(fā)為了解藥用植物的遺傳多樣性、種間遺傳分化和栽培育種提供分子生物學(xué)依據(jù)。簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）、簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性（ISSR）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性（RAPD）、相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（SRAP、）靶位區(qū)域擴(kuò)增多態(tài)性（TRAP）和擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）等標(biāo)記曾經(jīng)是構(gòu)建藥用植物遺傳圖譜的主要方法，構(gòu)建了茄科植物甘薯、蘭科植物石斛、唇形科植物丹參、杜仲科植物杜仲、龍膽科植物龍膽、旋花科植物甘薯、十字花科植物蘿卜和光茸菌科植物香菇等藥用植物的遺傳圖譜。但是，由于這些標(biāo)記在基因組中的豐富性較差，可用的標(biāo)記數(shù)量少，構(gòu)建的遺傳圖譜密度和飽和度均不高。

近年來，隨著測(cè)序技術(shù)迅猛發(fā)展，構(gòu)建遺傳圖譜的分子標(biāo)記不斷豐富，尤其是單核苷酸多態(tài)性（SNP）標(biāo)記的大量發(fā)掘利用，極大的提高了植物遺傳圖譜的密度和飽和度[14]。SNP 標(biāo)記具有多態(tài)性好、密度高、數(shù)量豐富且覆蓋全基因組的優(yōu)點(diǎn)?；跍y(cè)序技術(shù)開發(fā)相關(guān)標(biāo)記，同時(shí)針對(duì)特異位點(diǎn)設(shè)計(jì)多種標(biāo)記，結(jié)合多種標(biāo)記技術(shù)為構(gòu)建植物高密度遺傳連鎖圖譜提供了技術(shù)保障，這些標(biāo)記已用于藥用植物連鎖圖譜的構(gòu)建。目前，基于高通量技術(shù)的基因芯片技術(shù)、重測(cè)序（BSA）技術(shù)、混池轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）技術(shù)和簡(jiǎn)化基因組測(cè)序（SLAF-seq，GBS）技術(shù)在藥用植物遺傳圖譜構(gòu)建和相關(guān)性狀基因定位方面展現(xiàn)了較大作用。基因芯片技術(shù)構(gòu)建了薔薇科植物桃的遺傳圖譜，簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)（RAD）開發(fā)出蓮科植物栽培荷花、薔薇科植物山楂和玫瑰的高密度遺傳圖譜[15]。測(cè)序基因分型（GBS）和競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR（KASP）分型技術(shù)結(jié)合獲得薔薇科植物杏和芍藥科植物牡丹的連鎖圖譜[16]。SLAF-seq 技術(shù)是通過限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA，降低了基因組的復(fù)雜度，且不依賴參考基因組序列，具有快速、準(zhǔn)確鑒別標(biāo)記優(yōu)點(diǎn)。利用SLAF-seq技術(shù)分別構(gòu)建了唇形科植物丹參、木犀科植物銀杏和桂花、芍藥科植物牡丹、蘭科植物鐵皮石斛、楊柳科植物旱柳、薔薇科植物梅花和豆科植物小豆的高密度遺傳圖譜[17-21]。多數(shù)遺傳圖譜均為該植物的首張遺傳圖譜，其中，梅花的高密度遺傳圖譜，連鎖圖上包含8 007 對(duì)引物，為梅花數(shù)量性狀基因定位和分子育種提供參考[21]。山東農(nóng)業(yè)大學(xué)構(gòu)建的丹參高密度遺傳圖譜，包含有8 個(gè)連鎖群，覆蓋率高達(dá)99.83%，為丹參農(nóng)藝性狀基因的研究提供了重要信息[22]。牡丹的高密度遺傳圖譜全長(zhǎng)920.699 cM，5 個(gè)連鎖群上引物間的距離僅有0.774 cM[23]。

上述遺傳圖譜為藥用植物道地性相關(guān)性狀基因鑒定和分析提供了重要遺傳信息（部分藥物的遺傳圖譜統(tǒng)計(jì)見表1）。同時(shí)，發(fā)出的大量分子標(biāo)記可為藥用植物道地性相關(guān)基因定位和克隆工作奠定了基礎(chǔ)。

表1 部分藥用植物的遺傳圖譜統(tǒng)計(jì)

3 藥用植物相關(guān)性狀QTL定位研究

高密度遺傳圖譜構(gòu)建和分子標(biāo)記開發(fā)有助于對(duì)植物相關(guān)數(shù)量性狀QTL 定位研究。隨著藥用植物連鎖圖譜的不斷構(gòu)建，大量藥用植物物相關(guān)性狀QTL 定位分析也得到了發(fā)展。薔薇科植物梅花的垂枝等15個(gè)重要性狀QTL 分析及候選基因的挖掘，將垂枝性狀定位到第7 號(hào)染色體，挖掘出預(yù)測(cè)參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的基因[21]。菊科植物菊花耐澇性相關(guān)的37 個(gè)非條件QTL 和51個(gè)條件QTL 位點(diǎn)分析，對(duì)于指導(dǎo)菊花耐澇性品種的分子選育工作具有重要意義[29]。薔薇科植物杏的殼硬度相關(guān)基因也進(jìn)行了QTL 定位分析。玫瑰的花色 QTL 位點(diǎn)被定位到第 1、2、6 和 7 號(hào)染色體[30]。通過QTL 分析識(shí)別出與山楂黃酮類化合物含量相關(guān)的21 個(gè)QTL 位點(diǎn)，解釋16.30%-59.00%的變異[25]。豆科植物小豆開花時(shí)間相關(guān)的主效QTLs 位點(diǎn)和2 個(gè)微效QTLs 位點(diǎn)被識(shí)別[27]。篩選出與大豆總異黃酮含量相關(guān)的15 個(gè)QTL 位點(diǎn)50%[31]。18 個(gè)影響杜仲科植物杜仲生長(zhǎng)相關(guān)性狀的QTL 位點(diǎn)被識(shí)別，對(duì)表型變異的解釋率為12.4%-33.3%，該遺傳連鎖圖譜為杜仲基因組標(biāo)記輔助選擇和基因組研究提供了工具[32]。1 個(gè)與十字花科植物蘿卜根部鎘累積有關(guān)的主效QTL qRCd9被定位到第9 號(hào)染色體上，LOD 值為23.6[33]。上述藥用植物以遺傳圖譜為基礎(chǔ)并進(jìn)行了相關(guān)性狀QTL 定位，對(duì)于進(jìn)一步解析這些性狀的遺傳機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

4 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)藥用植物相關(guān)性狀基因的挖掘現(xiàn)狀

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析可以批量挖掘物種功能基因，比較基因在不同樣品中的表達(dá)差異，為藥用植物功能基因的挖掘和次生代謝成分的生物合成途徑探索提供了新方法。目前，千種植物轉(zhuǎn)錄組計(jì)劃已完成1 000余種植物的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)測(cè)序、歸檔和分析研究工作[34]。藥用植物包括唇形科植物丹參、菊科植物青蒿和燈盞花、三白草科植物魚腥草、五加科植物三七和人參、百合科植物七葉一枝花、豆科植物甘草及沙冬青、天南星科植物魔芋、玄參科植物地黃、蘭科植物鐵皮石斛、芍藥科植物牡丹、紅豆杉科植物紅豆杉、麻黃科植物麻黃、粟科植物博落回、茄科植物枸杞、夾竹桃科植物長(zhǎng)春花、葫蘆科植物羅漢果、龍膽科植物龍膽、多孔菌科植物靈芝、木犀科植物連翹和桔?？浦参稂h參等[35-40]。

通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)出海量的分子標(biāo)記，為藥用植物道地性分析、遺傳圖譜構(gòu)建等研究提供了參考。大量的藥用植物分子標(biāo)記被開發(fā)，包括五加科植物刺五加、?？浦参锷］亍⑶芽浦参锖诠坭?、杜仲科植物杜仲、唇形科植物夏枯草、毛茛科植物黃連、爵床科植物穿心連、百合科植物川貝母、蘭科植物金釵石斛、胡頹子科植物沙棘、無患子科植物文冠果、傘形科植物川芎、木犀科植物連翹以及豆科植物苦參、膜莢黃芪、蒙古黃芪、槐葉決明和中間錦雞兒等。涉及利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)出厚樸的SSR 和EST-SSR 標(biāo)記，為厚樸的資源保護(hù)等研究提供了大量數(shù)據(jù)[41]。以轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，開發(fā)出紅花EST-SSR 標(biāo)記經(jīng)不同種質(zhì)紅花驗(yàn)證，獲得多態(tài)性擴(kuò)增條的引物可達(dá)40%以上[42]。肖亮等[43]通過對(duì)葛根轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析，設(shè)計(jì)開發(fā)出28對(duì)多態(tài)性引物，這些引物可用于不同葛根資源的遺傳多樣性分析。從三七轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中確定了2 772個(gè)SSR，這些標(biāo)記的開發(fā)為三七的分子標(biāo)記輔助育種提供了參考數(shù)據(jù)[44]。

通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序挖掘出一些藥用植物活性成分合成的功能基因及相關(guān)的代謝通路，丹參轉(zhuǎn)錄組分析主要涉及丹參酮合成基因，黨參主要涉及黨參多糖合成相關(guān)基因，人參涉及皂苷生物合成途徑的酶和糖基轉(zhuǎn)移酶的基因，銀杏涉及黃酮類生物合成的基因，三七涉及皂甙生物合成途徑中相關(guān)的候選基因，連翹轉(zhuǎn)錄組分析主要涉及金絲桃素生物合成的基因，燈盞花測(cè)序主要涉及燈盞乙素合成的候選基因，羅漢果轉(zhuǎn)錄組測(cè)序涉及甜甙生物合成的候選基因，甘草涉及甘草酸合成的關(guān)鍵酶基因[46-50]。西洋參涉及所有與人參皂苷合成相關(guān)的酶基因，西藏延齡草涉及甾體皂苷生物合成等代謝過程中的基因，蒙古黃芪涉及異丙氨酸和三萜皂苷生物合成相關(guān)的基因，丹參涉及丹參素生物合成早期的編碼酶基因[50-53]。

5 藥用植物基因工程研究現(xiàn)狀

藥用植物的道地性體現(xiàn)在其次生代謝產(chǎn)物的含量及產(chǎn)量上，而人工栽培藥用植物普遍存在有效成分含量減少和品種退化等問題。隨著1983 年世界首例轉(zhuǎn)基因植物培育成功，基因工程技術(shù)近年來在農(nóng)作物領(lǐng)域取得較大進(jìn)展并逐步推廣，已克隆了不同來源的抗病、抗蟲、抗逆和抗除草劑的基因并進(jìn)行轉(zhuǎn)化應(yīng)用，減少了農(nóng)藥和除草劑的使用及殘留，提高了農(nóng)作物抗病性、抗逆性及產(chǎn)量。將上述基因轉(zhuǎn)入藥用植物，通過基因工程手段提高其次生代謝產(chǎn)物含量和病蟲害抗病能力，從而進(jìn)一步提升藥材產(chǎn)量和品質(zhì)。目前主要通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方式將一些抗性和熒光蛋白等模式基因?qū)胼?、石刁柏、枸杞、地黃、甘草、黃芩等藥用植物，且已獲得轉(zhuǎn)基因植株[54-55]。除草劑抗性基因轉(zhuǎn)入顛茄中，提高了顛茄和四倍體菘藍(lán)對(duì)除草劑的抗性[56-57]。四倍體菘藍(lán)和枸杞中分別轉(zhuǎn)入來自蘇云金芽孢桿菌的殺蟲蛋白基因、豇豆胰蛋白酶抑制劑基因和雪花蓮凝集素酶基因，轉(zhuǎn)基因植株分別具有對(duì)小菜蛾和蚜蟲抗蟲能力[58]。將抗微生物活性的抗菌肽分別導(dǎo)入陽(yáng)春砂和魚腥草受體植株，獲得了抗菌活性強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植株[59-60]。將水稻的幾丁質(zhì)酶基因和苜蓿的相關(guān)基因轉(zhuǎn)入白術(shù)植株，獲得了抗白術(shù)立枯病的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株[61]。在已知合成代謝途徑的情況下，還可通過基因工程的手段直接提高藥用植物次生代謝產(chǎn)物的含量。尤其是對(duì)于藥用成分含量比較低，常規(guī)育種已無法滿足生產(chǎn)需要的藥用植物，將反義鯊烯合酶基因轉(zhuǎn)入青蒿植株中，獲得的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株中青蒿素的含量得到較大的提高[62]。

轉(zhuǎn)基因植物需要進(jìn)行安全評(píng)價(jià)和環(huán)境安全性評(píng)價(jià)，食用安全性評(píng)價(jià)包括毒理學(xué)評(píng)價(jià)和致敏性評(píng)價(jià)兩部分，與農(nóng)作物長(zhǎng)期食用不同，中藥僅在治療階段才需要食用，且中藥在食用前已經(jīng)過炮制、煎煮等工藝處理，食用安全性方面相對(duì)比較可靠。環(huán)境安全性評(píng)價(jià)包括生存競(jìng)爭(zhēng)能力評(píng)價(jià)、基因漂移環(huán)境影響評(píng)價(jià)、生物多樣性影響評(píng)價(jià)、靶標(biāo)害蟲抗性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)。藥用植物種植面積較小，環(huán)境安全性方面更容易控制[55]。總之，不論農(nóng)作物還是藥用植物，均需經(jīng)過嚴(yán)格的食用性評(píng)價(jià)、環(huán)境安全性評(píng)價(jià)以及一系列安全評(píng)價(jià)審批程序才可獲得應(yīng)用安全證書。

6 展望

藥用植物道地性提高的關(guān)鍵是適宜的生長(zhǎng)環(huán)境、氣候條件及藥用成分含量高的種質(zhì)資源，其遺傳機(jī)制屬于多基因作用下的數(shù)量性狀，是典型的連續(xù)性變異，主要表現(xiàn)在植物形態(tài)、生理機(jī)能和次生代謝產(chǎn)物上的特化。當(dāng)前，對(duì)道地性形成的遺傳機(jī)制了解不足，成為制約藥用品質(zhì)提高和品種選育的瓶頸之一。隨著現(xiàn)代分子生藥學(xué)和分子育種的快速發(fā)展及應(yīng)用，挖掘與道地性直接相關(guān)的基因是道地性藥材基因工程研究和品種選育基礎(chǔ)。因此，在道地產(chǎn)區(qū)不變的基礎(chǔ)上，可利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，尤其是高通量測(cè)序解析道地性形成的內(nèi)在遺傳機(jī)制，明確道地性形成的數(shù)量性狀位點(diǎn)，定位、克隆相關(guān)基因并導(dǎo)入受體植株中。同時(shí)，除明確藥用植物本身的基因數(shù)量、位置、結(jié)構(gòu)及其功能外，還應(yīng)關(guān)注生長(zhǎng)環(huán)境和氣候條件等外在因素變化對(duì)道地性的影響，了解環(huán)境因子與基因之間的互作關(guān)系，從而利用分子生物學(xué)手段可顯著提高道地藥材的藥用品質(zhì)。