藏藥余甘子主要成分含量測定研究＊

吳玲芳 ，梁文儀 ，張?zhí)m珍 ＊＊

（1. 北京中醫(yī)藥大學中藥學院 北京 100102；2. 河北中醫(yī)學院藥學院 石家莊 050091；3. 河北省中藥配方顆粒工程技術(shù)研究中心 石家莊 050091；4. 河北省中藥材品質(zhì)評價與標準化工程研究中心 石家莊 050091）

余甘子為大戟科Euphorbiaceae葉下珠屬植物余甘子Phyllanthus emblicaL．的干燥成熟果實。余甘子初食味酸澀，良久乃甘，故名“余甘子”，又稱油甘子、牛甘子、喉甘子、魚木果等[1]。余甘子味甘、酸、澀、涼，歸肺、胃經(jīng)，具有清熱涼血，消食健胃，生津止咳的功效。余甘子在全球分布較為廣泛，主要分布于菲律賓、馬來西亞、南美、印度、斯里蘭卡、印度尼西亞、中南半島和中國。在我國主產(chǎn)于江西、福建、臺灣、廣東、海南、廣西、四川、貴州和云南等省區(qū)。余甘子為藏族習用藥材，與訶子、毛訶子統(tǒng)稱三果。大三果為藏醫(yī)經(jīng)典小復方，應用極為廣泛。在傳統(tǒng)藏藥中，余甘子主治培根病、赤巴病、血病、高血壓病等?，F(xiàn)代藥理學研究表明，余甘子具有抗炎[2-4]，抗氧化[5-15]，抗衰老[5-15]，保肝[16-17]，抗腫瘤[17-34]等藥理作用。余甘子富含鞣質(zhì)類、酚酸類、黃酮類、生物堿類和維生素C 等成分[1-34]，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)余甘子中鞣質(zhì)和酚酸類成分具有較強的抗腫瘤作用。

中國藥典中余甘子質(zhì)量控制方法主要有分光光度法測定余甘子總鞣質(zhì)的含量，高效液相色譜（HPLC）法測定余甘子藥材中沒食子酸的含量。國內(nèi)外有不少學者研究并報道了余甘子中少量幾種化學成分含量測定的方法[35-53]。例如張文莉等[35]采用UPLC法測定了余甘子中沒食子酸、柯里拉京、訶子鞣質(zhì)和鞣花酸4個成分的含量。李琦等[36]采用HPLC 法同時測定余甘子中沒食子酸、沒食子兒茶素、柯里拉京、訶子聯(lián)苯酸、鞣花酸5個成分的含量。李斌等[41]報道了余甘子中沒食子酸、柯里拉京、鞣花酸3種成分含量測定的方法。另有多篇文獻報道余甘子及其制劑中單一成分沒食子酸含量測定的方法，但是同時測定余甘子中多種鞣質(zhì)和酚酸類成分含量的方法未見報道。本課題組多年來致力于藏藥的研究，先后研究了藏藥余甘子、訶子、毛訶子三種單味藥，以及這三味藥所組成的藏醫(yī)經(jīng)典小復方三果湯。對其主要化學成分、藥理作用及作用機制、體內(nèi)外代謝等內(nèi)容進行了系列探索。發(fā)現(xiàn)藏藥多富含鞣質(zhì)，并且以可水解鞣質(zhì)居多，且藏藥中的可水解鞣質(zhì)及小分子酚酸類成分有良好的抗腫瘤作用，體內(nèi)外抗腫瘤效果均較好，有望開發(fā)為一種抗腫瘤新藥。

本課題組前期研究并報道了余甘子鞣質(zhì)部位的提取純化工藝、體內(nèi)外抗腫瘤活性、總鞣質(zhì)含量測定方法、沒食子酸、鞣花酸、柯里拉京三個單體成分的含量測定方法及指紋圖譜評價研究[22-23,52-58]，對余甘子進行了化學成分、藥理作用、藥代動力學、組織分布、排泄、代謝組學和蛋白質(zhì)組學等一系列研究。本研究建立了HPLC 法同時測定余甘子藥材中主要成分沒食子酸、安石榴苷B、沒食子酸甲酯、老鸛草素、柯里拉京、訶子林鞣酸、訶黎勒酸和鞣花酸含量的方法，填補了余甘子藥材多種化學成分同時進行含量測定的空白，可為余甘子藥材的質(zhì)量控制提供依據(jù)，為藏醫(yī)藥現(xiàn)代化和藏藥質(zhì)量標準的提高奠定基礎(chǔ)。

1 實驗材料

1.1 儀器

Waters 1525 型高效液相色譜儀；Waters 2996 型DAD檢測器；Empower軟件；自動進樣器；微孔濾膜（津騰）；注射器（國藥集團）；離心管（北京匯海科儀有限責任公司）；十萬分之一電子分析天平：Sartorious BT 25S型（北京賽多利斯儀器有限公司）；超聲波清洗器（功率：100 W，型號：KQ-500DE，昆山超聲儀器有限公司）；稱量紙（洛陽北方玻璃技術(shù)股份有限公司）；棕色進樣瓶（Thermo Scientific，北京匯?？苾x科技有限公司）。

1.2 材料

余甘子藥材購自北京藏醫(yī)院（產(chǎn)地為尼泊爾）、經(jīng)北京中醫(yī)藥大學生藥系劉春生教授鑒定為大戟科植物余甘子Phyllanthus emblicaL.的干燥果實。沒食子酸（CAS No：149-91-7），安石榴苷（CAS No：65995-63-3），沒食子酸甲酯（CAS No：99-24-1），均購自成都曼斯特生物科技有限公司，貯藏條件：4 ℃，密封，避光保存。老鸛草素：（CAS No：2360976-49-0）；柯里拉京（CAS No：23094-69-1），訶子林鞣酸（CAS No：18942-26-2），訶黎勒酸（CAS No：23049-71-5），鞣花酸（CAS No：476-66-4）均購自上海源葉生物科技有限公司，貯藏條件：4℃，密封，避光保存，純度為98%，符合含量測定的要求。

1.3 試劑

甲醇（Fisher, 色譜純）；蒸餾水（屈臣氏）；其他試劑均為分析純。

2 方法和結(jié)果

2.1 高效液相色譜條件

Diamonsil C18 色譜柱（250×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30℃；流動相為A（甲醇）：（B）0.2% 醋酸水；流速為1 mL?min-1；檢測波長：270 nm。樣品及對照品色譜圖如圖1和圖2所示。

圖1 混合對照品色譜圖

圖2 余甘子藥材色譜圖

2.2 供試液的制備

余甘子藥材供試液制備：稱取余甘子藥材粉末（過 50 目篩）約200 mg，精密稱定，轉(zhuǎn)移至 100 mL 錐形瓶中，加入50% 甲醇水溶液50 mL，稱重，100 MHz超聲30 min，補足失量，濾過，取續(xù)濾液 2.00 mL，置10 mL 棕色容量瓶中，加50% 甲醇水溶液稀釋至刻度線，搖勻，備用，進樣前經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過。

2.3 線性關(guān)系考察

分別稱取沒食子酸對照品2.34 mg，安石榴苷對照品8.23 mg，其中安石榴苷A 含量為35.221%，其中安石榴苷B 含量為63.619%，沒食子酸甲酯對照品2.33 mg，老鸛草素對照品8.00 mg，柯里拉京對照品13.75 mg，訶子林鞣酸對照品2.74 mg，訶黎勒酸對照品2.10 mg，鞣花酸對照品4.50 mg，精密稱定，置于25 mL棕色量瓶，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度線，搖勻作為混合對照品儲備液。精密吸取混合對照品儲備液25、50、100、200、400、600、800 μL 于 1 mL 容量瓶，加50%的甲醇稀釋至刻度，即得標準系列對照品溶液，進樣前經(jīng)0.45 μm 濾膜濾過。按照上述色譜條件進樣20 μL，記錄色譜峰面積，以濃度為橫坐標X（μg），以峰面積為縱坐標，得到回歸方程，見表1和2。

2.4 精密度實驗

分別取同一混合對照品，連續(xù)進樣6 次，分別測定沒食子酸、安石榴苷B、沒食子酸甲酯、老鸛草素、柯里拉京、訶子林鞣酸、訶黎勒酸、鞣花酸的峰面積。計算色譜峰峰面積 RSD 分別為1.03、0.55、1.55、2.10、0.26、1.56、0.20、0.097%, 表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性實驗

稱取同一批余甘子藥材粉末，按“供試品溶液的制備”項下方法制備供試液，分別于樣品制備后0、2、4、6、8、12、24 h 進樣，測定沒食子酸、安石榴苷B、沒食子酸甲酯、柯里拉京、訶黎勒酸、訶子林鞣酸、鞣花酸的峰面積。計算各時間點的峰面積RSD 分別為0.12、2.90、1.18、0.96、1.36、1.01、1.51、1.18%，表明樣品在24 h之內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復性實驗

稱取6 份余甘子藥材樣品，按“供試品溶液的制備”項下方法制備供試液，平行制備6 份，分別測定峰面積并計算含量，沒食子酸、安石榴苷B、沒食子酸甲酯、柯里拉京、訶黎勒酸、訶子林鞣酸、鞣花酸的含量分別為：2.50、0.22、0.18、056、0.68、0.26、0.90、2.10%，RSD 值分別為：3.52、1.94、1.24、0.95、0.66、2.03、1.23、0.76%。結(jié)果表明，該方法重復性良好。

表 1 流動相梯度

表2 回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍

2.7 加樣回收實驗

混合對照品溶液配置：精密稱取安石榴苷3.46 mg（安石榴苷B 含量為63.62%，2.20 mg）、老鸛草素5.60 mg、柯里拉京6.80 mg、訶子林鞣酸2.60 mg、訶黎勒酸 9.00 mg，得安石榴苷 B 0.22 mg?mL-1、老鸛草素0.56 mg?mL-1，柯里拉京濃度為 0.68 mg?mL-1、訶子林鞣酸0.26 mg?mL-1、訶黎勒酸0.90 mg?mL-1的混合對照品溶液1，備用。精密稱取沒食子酸對照品5.00 mg、鞣花酸對照品4.02 mg，沒食子酸甲酯3.60 mg，置于1 mL 量瓶中，50%甲醇定容至刻度線，得到混合對照品溶液2，備用。

稱取余甘子藥材粉末（過50 目篩）6 份，每份約100 mg，分別向每一份樣品中分別精密加入“混合對照品溶液 1”1 mL 和“混合對照品溶液 2”0.5 mL，加50%甲醇48.50 mL，稱重，超聲，100 MHz 超聲30 min，補足原重量，濾過，取續(xù)濾液2.00 mL，置于10 mL 容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜濾過，精密吸取20 μL 進樣，計算沒食子酸、安石榴苷B、沒食子酸甲酯、老鸛草素、柯里拉京、訶子林鞣酸、訶黎勒酸、鞣花酸色譜峰的平均加樣回收率依次分別為 ：100.15%，102.04%，101.20%，99.94%，99.75%，100.69%，100.30%，100.30%。RSD 依次分別為0.63%，3.76%，3.37%，1.08%，1.53%，1.22%，0.98%，1.98%（n=6）。

2.8 HPLC法測定余甘子藥材中8種成分的含量

稱取產(chǎn)地為尼泊爾、廣西、新疆、福建、四川、印度、云南、貴州產(chǎn)余甘子藥材粉末（過50 目篩）200 mg，每個產(chǎn)地取6 份，精密稱定，轉(zhuǎn)移至100 mL 錐形瓶中，加入50%甲醇水溶液50 mL，稱重，100 MHz 超聲30 min，補足失量，濾過，取續(xù)濾液2.00 mL，置10 mL棕色容量瓶中，加50%甲醇水溶液稀釋至刻度線，搖勻，備用，制備6 份余甘子藥材供試品溶液，進樣前經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過。按照“液相色譜條件”項下方法進行含量測定計算平均值及RSD 值，結(jié)果見表3。

表3 不同產(chǎn)地余甘子藥材中8個成分的含量

3 總結(jié)和討論

3.1 檢測波長的選擇

本論文采用梯度洗脫法分離了余甘子藥材中主要成分，62 min 內(nèi)分離完全，各成分分離效果良好，符合含量測定的要求。實驗前期通過二極管陣列檢測器對樣品進行了全波長（190-400 nm）掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各個成分在270 nm 處有最大吸收，且雜質(zhì)成分干擾較小，故選擇270 nm作為檢測波長。

3.2 流動相的選擇

本文考察了乙腈和甲醇兩種有機相，純水、不同濃度的醋酸水、不同濃度磷酸水作為水相，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以乙腈為有機相時，各成分都包裹在一起，分離效果不好，于是選擇甲醇作為有機相。同時所測成分均為弱酸性成分，添加少量的醋酸可以使峰形良好，減少色譜峰拖尾現(xiàn)象，故最終選擇甲醇-0.2%的醋酸水作為流動相。

3.3 柱溫的選擇

本文考察了25℃，30℃，35℃柱溫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)30℃時，各成分分離效果較好，于是選擇30℃為柱溫。

3.4 含量測定結(jié)果的分析

從6 份樣品中各成分含量可以看出，酚酸類成分沒食子酸、鞣花酸含量相對較高，鞣質(zhì)類成分含量相對較低，其原因可能有兩種，其一，沒食子酸和鞣花酸在藥材中本身含量相對較高。其二，沒食子酸和鞣花酸是其他可水解鞣質(zhì)類成分的基本結(jié)構(gòu)單元，可水解鞣質(zhì)類成分不穩(wěn)定，在酸、堿、酶以及受熱的條件下容易水解，生成沒食子酸，鞣花酸等小的結(jié)構(gòu)單元。需要說明的是由于安石榴苷A 在藥材中信號太低，采用普通液相和紫外檢測器不能對其定量，故只定了其余8個成分的量，但是后期采用UPLC-MSn法對藥材化學成分進行定性分析時，檢測到了安石榴苷A，說明其在余甘子藥材中確實存在，只是含量較低。另分離富集的余甘子抗癌有效部位中安石榴苷A 含量顯著提高，可以定量，這些將在后續(xù)論文中進行報道。各份樣品中每種成分含量RSD 值較小，說明樣品制備方法比較可靠，平行操作，各成分差異較小。本方法簡便、準確、穩(wěn)定，可為余甘子的質(zhì)量控制提供依據(jù)。