培養(yǎng)基類型和植物生長物質(zhì)濃度對王棗子愈傷組織誘導和繼代的影響＊

張媛媛，朱智慧，張苗苗，蘇 勇，方政宇，孫 偉，薛建平＊＊

（1. 淮北師范大學生命科學學院安徽省特色資源植物利用工程實驗室 淮北 235000；2. 中國中醫(yī)科學院中藥研究所 北京 100700）

王 棗 子Isodon amethystoides（Benth）Cy Wu et Hsuan 系唇形科香茶菜屬多年生草本植物，學名香茶菜[1]，又被稱為蛇總管[2]、鐵角棱、山薄荷、痱子草等[3]，其根、莖和葉皆可入藥[4]，具有藥食兩用功能[5]。王棗子廣泛分布于河南、安徽、湖北、浙江、廣西、江蘇等地[6]，“宿州王棗子”成為安徽宿州市獲得的地理標志證明商標之一[7]，民間常用于治療毒蛇咬傷、肺膿瘍、惡瘡和急性肝炎等疾病[2,8]，具有抑菌消炎、解熱鎮(zhèn)痛[4]、抗氧化[9-10]和抗腫瘤[11-12]等作用。研究[13-16]表明，王棗子的主要活性成分為王棗子甲素、王棗子乙素和王棗子丙素等二萜類化合物以及齊墩果酸、熊果酸等三萜類化合物，被譽為“天然植物抗生素”。王棗子因其毒性低、副作用小和安全性高等優(yōu)點，應用前景較為廣闊。

近年來，隨著對王棗子藥用功能的深入研究，王棗子的需求日益增大。由于野生王棗子的生長環(huán)境限制、生長速度慢和過度采挖，導致王棗子野生資源驟減。因此，利用植物細胞工程技術(shù)開展細胞組織培養(yǎng)法大規(guī)模生產(chǎn)王棗子有效成分研究具有重要的現(xiàn)實意義。利用細胞懸浮培養(yǎng)體系大規(guī)模生產(chǎn)植物細胞內(nèi)的有用次生代謝產(chǎn)物首先要獲得疏松的愈傷組織，這是進行植物細胞懸浮培養(yǎng)的重要前提。目前，對于王棗子的研究主要集中在成分鑒定(如王棗子甲素、王棗子乙素和王棗子丙素[13-15]和三萜類鑒定[16,24])、抗氧化活性的研究[10]、提取物總黃酮的治病機制[25]、臨床抗菌作用[4]、王棗子乙素新型給藥系統(tǒng)的制備[26]、種子萌發(fā)條件的探究[27]、試管苗的繼代快繁[29]和再生體系的構(gòu)建[30]等方面。劉芳等[28]以王棗子的莖、葉篩選了外植體的類型，在此基礎(chǔ)上研究了誘導王棗子愈傷組織最佳NAA（α-萘乙酸）與2，4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）的濃度配比，在試驗中我們發(fā)現(xiàn)，該配方得到的愈傷組織狀態(tài)不佳且容易褐化，影響后續(xù)再生體系的構(gòu)建以及基因功能的驗證。

基本培養(yǎng)基是愈傷組織誘導和控制愈傷組織結(jié)構(gòu)狀態(tài)的關(guān)鍵條件，愈傷組織的生長對無機鹽濃度的要求較高，基本培養(yǎng)基中的某些成分亦可起到外源調(diào)控因子的作用從而影響愈傷組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)，含有高鹽和高硝酸鹽的培養(yǎng)基對愈傷組織的誘導和細胞的培養(yǎng)有利，含有中鹽和低鹽的培養(yǎng)基對根的形成有利[20-21]。王海波等[22]在研究培養(yǎng)基類型對小麥愈傷組織狀態(tài)的影響時發(fā)現(xiàn)硝態(tài)氮會抑制愈傷組織的生長，還原態(tài)氮促進愈傷組織的生長。B5、MS、1/2MS 和N6培養(yǎng)基是愈傷組織常用的誘導培養(yǎng)基。王棗子的組織培養(yǎng)一般采用MS 培養(yǎng)基，在試驗中發(fā)現(xiàn)愈傷組織的狀態(tài)不佳，且容易褐化。植物生長在物質(zhì)是愈傷組織增殖培養(yǎng)的關(guān)鍵因素，繼代愈傷組織活力較弱的可增大生長素的使用量，愈傷組織活力強的通過加大細胞分裂素的使用量來調(diào)節(jié)愈傷組織的生長狀態(tài)。不同質(zhì)地的愈傷組織可通過生長素與細胞分裂素的種類和濃度配比來調(diào)控，增大生長素濃度愈傷組織的質(zhì)地越疏松[23]。本試驗研究了不同的培養(yǎng)基類型對愈傷組織誘導的影響和添加不同濃度配比植物生長物質(zhì)對王棗子疏松愈傷組織增殖的影響，以期得到生長旺盛、疏松的愈傷組織，為王棗子細胞懸浮培養(yǎng)體系的構(gòu)建奠定初步基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

11 月從安徽淮北相山采集當年生王棗子種子，經(jīng)淮北師范大學生命科學學院薛建平教授鑒定為王棗子Isodon amethystoides（Benth）Cy Wu et Hsuan。種子去殼曬干備用。

1.2 方法

1.2.1 供試無菌苗的獲得

挑選黑褐色有花紋的飽滿的種子，用200 mg·L-1赤霉素浸泡過夜，流水下沖洗干凈，在超凈工作臺上用75%酒精處理30-60 s，用無菌水沖洗2 次，0.1%升汞溶液處理5-8 min，無菌水沖洗3-5 次，用無菌紙吸干種子表面水分放入MS 培養(yǎng)基中，恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10 天，轉(zhuǎn)移到恒溫光照培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)5 天，選擇健壯的生長狀態(tài)相同的無菌苗作為供試無菌苗。

1.2.2 培養(yǎng)基類型對愈傷組織誘導的影響

采用單因素完全隨機試驗設計，通過對比確定出最佳的誘導培養(yǎng)基類型。在超凈工作臺上將供試王棗子無菌苗的幼葉用解剖刀劃開小口子，參照段永波[30]等人的王棗子愈傷組織培養(yǎng)條件，將無菌苗的幼葉接入分別添加了6-BA(6-芐氨基腺嘌呤)1.0 mg·L-1和NAA 0.5 mg·L-1的B5、1/2MS和MS(添加蔗糖3%、瓊脂0.7%，調(diào)節(jié)pH 5.8-6.0)培養(yǎng)基中，每個試驗組6 瓶，外植體數(shù)目5-6個/瓶，培養(yǎng)溫度為(25±1)℃，培養(yǎng)濕度為70%-80%，25 天后統(tǒng)一計算誘導率。誘導率(%)=長出愈傷數(shù)/總接種數(shù)×100%。試驗重復3次。

1.2.3 王棗子愈傷組織增殖培養(yǎng)試驗

1.2.3.1 供試愈傷組織的獲得

參照段永波等[30]的王棗子組織培養(yǎng)條件，將王棗子供試無菌苗幼苗葉片接入1.2.2 試驗所得添加了NAA 0.5 mg·L-1、6-BA 1.0 mg·L-1（含有7 g·L-1瓊脂和30 g·L-1蔗糖，pH 5.8-6.0）的最佳基本培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為(25±1)℃，相對培養(yǎng)濕度為70%-80%，遮光培養(yǎng)25天后得到供試愈傷組織。

1.2.3.2 愈傷組織的增殖培養(yǎng)

采用L9(32)正交試驗設計，設置2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)濃度為0.5、1.5、2.5 mg·L-1和KT(激動素)濃度為0.2、0.5、1.0 mg·L-1，共9組試驗。將不同質(zhì)量濃度的這兩種植物生長物質(zhì)分別添加至試驗1.2.2 得到的最佳基本培養(yǎng)基中。在超凈工作臺上選取生長速度快、生長狀態(tài)佳且狀態(tài)一致的淡黃色王棗子供試愈傷組織，輕輕用鑷子捏碎并接種至含有不同組合濃度的2，4-D、KT 的培養(yǎng)基中，每個試驗組6 瓶，外植體數(shù)目5-6個/瓶，遮光培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為(25±1)℃，相對培養(yǎng)濕度為70%-80%，每隔幾天統(tǒng)計生長增殖及褐化情況，28 d后統(tǒng)一取樣稱量鮮重，并計算增殖倍數(shù)。增殖倍數(shù)=(28天后稱重－初始稱重)/初始稱重。試驗重復3次。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析

用Excel 2003 進行數(shù)據(jù)處理，SPSS 17.0 軟件進行方差分析、極差分析和Duncan分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基本培養(yǎng)基類型對王棗子愈傷組織誘導的影響

在其他培養(yǎng)條件均一致的條件下，三種不同類型的培養(yǎng)基對王棗子愈傷組織的出愈時間、誘導率和生長狀態(tài)的影響見表1。

由表1 可知，三種不同基本培養(yǎng)基類型對王棗子幼葉愈傷組織出愈時間和誘導率的影響差異顯著。王棗子幼葉在不同類型的培養(yǎng)基上均能誘導出愈傷組織。從愈傷組織的啟動時間來看，在MS、1/2MS 和B5培養(yǎng)基上的愈傷組織的啟動時間呈現(xiàn)逐漸減小的趨勢，在MS 培養(yǎng)基上的平均出愈時間最晚，為（7.00±1.00）天；1/2MS 培養(yǎng)基的平均出愈時間次之為（5.33±0.58）天，比MS 培養(yǎng)基的出愈時間提前了23.86%；B5培養(yǎng)基上最先出現(xiàn)幼葉傷口膨大，平均出愈時間最短為（3.67±0.58）天，比MS和1/2MS培養(yǎng)基的平均出愈時間分別提前了47.57%和31.14%。從王棗子幼葉愈傷組織的誘導率來看，在三種不同類型的培養(yǎng)基中誘導率呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，以MS 培養(yǎng)基上最小，為（85.56±1.11）%；1/2MS培養(yǎng)基的誘導率增大到（91.48±1.28）%，比MS 培養(yǎng)基增大了6.92%；B5培養(yǎng)基上愈傷的誘導率最大為（97.41±1.70）%，比1/2MS 和MS 培養(yǎng)基分別增大了6.48%和13.85%。從愈傷組織的形態(tài)特征來看，愈傷組織的顏色均為健康的淡黃色，其中在B5和1/2MS培養(yǎng)基上愈傷組織的質(zhì)地較軟，MS培養(yǎng)基上愈傷組織的質(zhì)地較硬且致密程度較大，見圖1。從愈傷組織的生長狀態(tài)來看，從MS、1/2MS 到B5培養(yǎng)基上愈傷組織的生長狀況呈現(xiàn)逐漸轉(zhuǎn)好的趨勢，B5培養(yǎng)基上愈傷組織的生長狀態(tài)最佳，1/2MS 培養(yǎng)基上次之，MS 培養(yǎng)基上愈傷組織的生長狀態(tài)稍差。綜合以上分析結(jié)果認為，王棗子幼葉愈傷組織的誘導以B5培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基優(yōu)于MS、1/2MS培養(yǎng)基。

2.2 植物生長物質(zhì)的濃度對王棗子愈傷組織增殖培養(yǎng)的影響

植物生長物質(zhì)的不同濃度配比對王棗子愈傷組織增殖培養(yǎng)的影響見表2。繼代培養(yǎng)時培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量濃度配比的2，4-D 和KT 均能使王棗子愈傷組織出現(xiàn)不同程度的生長。第9 組試驗中，即2，4-D濃度為2.5 mg·L-1和KT濃度為1.0 mg·L-1時，王棗子愈傷組織増殖倍數(shù)最小為19.78 倍；第2 組試驗中2，4-D濃度為1.5 mg·L-1和KT濃度為0.2 mg·L-1時，王棗子愈傷組織増殖倍數(shù)最大，達到27.34 倍，比第9 組試驗增大了38.22%。數(shù)據(jù)的直觀分析結(jié)果顯示，增殖倍數(shù)中2，4-D 的極差為 6.02，KT 的極差為 1.83，可見 2，4-D在增殖培養(yǎng)中作用大于KT，即2，4-D 與KT 對王棗子愈傷組織增殖倍數(shù)影響的主次關(guān)系為2，4-D>KT。數(shù)據(jù)的方差分析結(jié)果顯示，不同質(zhì)量濃度的2，4-D 對王棗子愈傷組織的增殖倍數(shù)有極顯著影響(P<0.01)，KT對王棗子愈傷組織的增殖沒有顯著影響(P=0.091)。

由表2可知，9組培養(yǎng)基上的愈傷組織生長狀態(tài)不一且出現(xiàn)了不同程度的褐化，愈傷組織在KT 濃度為0.2 mg·L-1時褐化程度普遍較嚴重，其中在第1 組試驗（2，4-D 濃度為 0.5 mg·L-1和 KT 濃度為 0.2 mg·L-1）中愈傷組織的褐化程度最嚴重、致密程度較大且生長狀態(tài)最差；第5 組試驗（2，4-D 濃度為 1.5 mg·L-1和KT 濃度為0.5 mg·L-1）中愈傷組織的褐化程度輕、較為疏松且生長狀態(tài)較好（見圖2）。

綜合極差分析和方差分析結(jié)果，王棗子疏松愈傷組織增殖培養(yǎng)基中選擇第5組試驗的植物生長物質(zhì)濃度配比為佳的，即適合王棗子疏松愈傷組織繼代的植物生長物質(zhì)濃度配比為2，4-D 1.5 mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1。

表1 不同基本培養(yǎng)基類型對愈傷組織誘導的影響

圖1 不同類型基本培養(yǎng)基上葉片誘導的愈傷組織狀況

表2 不同濃度植物生長物質(zhì)對王棗子愈傷組織增殖的影響

圖2 王棗子愈傷組織增殖培養(yǎng)增殖情況

3 討論

愈傷組織的狀態(tài)是植物基因型和生長環(huán)境的共同作用的結(jié)果，生長環(huán)境能在很大程度上影響愈傷組織的質(zhì)地、顏色和生理狀態(tài)等[31-32]。愈傷組織的誘導和繼代是王棗子組織培養(yǎng)的重要內(nèi)容，基本培養(yǎng)基中的某些組分和外源添加植物生長物質(zhì)的種類以及濃度成為影響王棗子愈傷組織狀態(tài)的重要因素。

在進行植物細胞組織培養(yǎng)時，不同類型的培養(yǎng)基提供的營養(yǎng)、離子濃度、滲透壓和細胞生長環(huán)境也不同，培養(yǎng)基中各種元素的種類與含量會影響植物材料的培養(yǎng)效果，也是試驗成功的必要條件[33]。植物材料的不同品種一般所采用的基本培養(yǎng)基類型都會有所差異[34]，陳英等研究發(fā)現(xiàn)[35]，B5培養(yǎng)基在峨眉擬單性木蘭的誘導中有較好的誘導效果。本試驗中，在其他培養(yǎng)條件都一致的條件下，選用了MS、1/2MS、B5培養(yǎng)基探究對王棗子幼葉愈傷組織誘導的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)愈傷組織的誘導率和出愈時間在三種不同類型培養(yǎng)基中有顯著差異，B5培養(yǎng)基的誘導效果最好，1/2MS培養(yǎng)基次之，MS 培養(yǎng)基的效果稍差。由此可見，基本培養(yǎng)基成分對王棗子愈傷組織誘導有一定影響，與前人的研究結(jié)果相符。大量研究表明，培養(yǎng)基中的某些成分和外源添加的植物生長物質(zhì)種類以及濃度成都可起到調(diào)控作用，改變愈傷組織的質(zhì)地和生長狀態(tài)等。

不同濃度配比的植物生長物質(zhì)對植物疏松愈傷組織增殖培養(yǎng)有重要作用[36]。為了維持愈傷組織的生長狀態(tài)、保持其不分化又具有分化能力的特性，需要在繼代培養(yǎng)過程中調(diào)整植物生長物質(zhì)的種類和使用濃度。本試驗為了獲得細胞懸浮培養(yǎng)所需的疏松且生長迅速的愈傷組織，探究了不同植物生長物質(zhì)(2，4-D 和KT)的配比對王棗子愈傷組織繼代培養(yǎng)的影響，從試驗的結(jié)果來看，2，4-D和KT的不同配比對王棗子疏松愈傷組織的增殖培養(yǎng)有很大影響，適當濃度的2，4-D 能促進細胞的生長，在繼代培養(yǎng)過程中2，4-D 比KT 的影響效應大，唐麗等[37]研究紅翅槭愈傷組織繼代的過程中試驗中證明了這一點。曾超珍等[38]在研究虎杖疏松愈傷組織誘導條件時發(fā)現(xiàn)，2，4-D對虎杖愈傷組織增殖培養(yǎng)時的細胞分裂有顯著影響。程佑發(fā)等[39]在研究棗愈傷組織誘導和再生植株時發(fā)現(xiàn)，2，4-D對增殖培養(yǎng)的作用大于IBA、6-BA、NAA、IAA、ZT、2iP和KT。

本研究表明，不同培養(yǎng)基類型對王棗子愈傷組織的誘導有一定影響，應選擇B5培養(yǎng)基作為王棗子愈傷組織誘導的基本培養(yǎng)基；在繼代培養(yǎng)過程中，2，4-D對王棗子疏松愈傷組織的增殖效應影響較大。此外，本試驗中發(fā)現(xiàn)王棗子愈傷組織在增殖培養(yǎng)過程中出現(xiàn)不同程度的褐化狀況，可以嘗試通過添加適當?shù)目购只瘎┖臀絼p輕褐化現(xiàn)象，關(guān)于減輕增殖過程中褐化方面的研究還需深入研究。