酒黃連HPLC特征圖譜的建立及聚類分析和主成分分析＊

康念欣，袁炎炎，張 瀟，路穎慧，李晴霞，李 飛，譚 鵬

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 北京市科委 中藥生產(chǎn)過程控制與質(zhì)量評價北京市重點實驗室 北京 102400）

黃連為毛茛科植物黃連（Coptis chinensisfranch）、三角葉黃連（Coptis deltoideaC. Y. cheng et Hsiao）、云連（Coptis teetawall.）的干燥根莖，味苦、性寒，歸心、肝、胃、大腸經(jīng)，具有清熱燥濕、瀉火解毒的作用[1]。黃連中主要含非洲防己堿、藥根堿、表小檗堿、黃連堿、小檗堿、巴馬汀等生物堿類成分[2]，還含有阿魏酸、綠原酸、黃柏酮、槲皮素和微量元素等非生物堿類成分[3]。

黃連的炮制首次記載于南朝劉宋時期雷敩所著的《雷公炮炙論》，有“凡使黃連，以布拭上肉毛，然后用漿水［炊粟米熟，投冷水中，浸五、六日，味?。ㄋ嵛叮?，生白花，色類漿，故名漿水］浸二伏時，漉出，于柳火中焙干用”的記載。黃連的炮制品有生黃連、酒制黃連、姜制黃連、吳茱萸制黃連等，采用不同的輔料炮制可改變黃連的性味，從而改變其功效，如黃連經(jīng)酒制后可引藥上行，緩和寒性，清頭目之火；經(jīng)姜制可緩和黃連過于苦寒之性，止嘔作用增強；吳茱萸制黃連可抑制黃連苦寒之性，使其寒而不滯，清氣分濕熱[4]。

目前，對于黃連及其炮制品質(zhì)量鑒別的方法學(xué)研究以指紋圖譜的研究較多,且集中于黃連不同炮制品指紋圖譜及炮制前后化學(xué)成分含量差異、變化研究。性狀量化鑒別方法主要包括電子舌[5]、電子鼻[6]等，化學(xué)成分及指紋圖譜的研究多使用高效液相色譜（HPLC）[7]、超高效液相色譜—三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）[8]等方法。廖慶文等[9]采用 HPLC 法，研究了黃連不同炮制品的炮制機理，建立黃連六種炮制品的HPLC 圖譜，采用指紋圖譜相似度分析和聚類方法分析其結(jié)果，可將六種黃連炮制品分為兩類，表明其分類結(jié)果與藥性相關(guān)，符合傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論中的“叢制”“反制”理論；有研究采用3 批黃連藥材建立了黃連片、酒黃連、姜黃連、萸黃連四種飲片的特征圖譜，測定了小檗堿、木蘭堿、巴馬汀、黃連堿、藥根堿等5 種化學(xué)成分的含量，結(jié)果顯示黃連不同炮制品間色譜峰數(shù)量和峰面積均有差異，黃連炮制前后化學(xué)成分含量發(fā)生有規(guī)律變化[10]；已有研究建立黃連片、萸黃連和姜黃連各十批飲片的指紋圖譜和紅外圖譜，對三種飲片的指紋圖譜進行聚類分析，對紅外圖譜進行主成分分析，三者的指紋圖譜和紅外圖譜相似度差異較小，分別經(jīng)聚類分析、主成分分析后，可將三種飲片區(qū)分開[11]。關(guān)于結(jié)合聚類分析和主成分分析方法分析酒黃連特征圖譜的研究鮮有發(fā)現(xiàn)。

目前，藥品標(biāo)準(zhǔn)中黃連炮制品與黃連飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)基本相同，使得質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)模糊[12]。酒黃連為黃連的炮制品之一，在《中華人民共和國藥典》2015 年版及全國各地炮制規(guī)范中其炮制方法均為酒炙，并且《中華人民共和國藥典》中無酒黃連炮制工藝的具體工藝參數(shù)；各地方炮制規(guī)范中酒黃連輔料用量，炮制程度等存在差異，導(dǎo)致飲片質(zhì)量不穩(wěn)定。

聚類分析是將隨機現(xiàn)象歸類的統(tǒng)計學(xué)方法，即根據(jù)已知數(shù)據(jù)，計算變量與個體之間的距離或相關(guān)系數(shù)等統(tǒng)計量來表明不同個體與變量之間的相關(guān)性，并根據(jù)“最短距離法”“最長距離法”等法則使得同類個體差別較小，不同類個體差別較大，從而將原始數(shù)據(jù)劃分為不同的類別，類別的數(shù)目和其組成未知。主成分分析是一個正交化線性變換的過程，通過線性變換，將原始數(shù)據(jù)中多個相關(guān)指標(biāo)組合成幾個綜合指標(biāo)（主成分），即原始指標(biāo)的線性組合，綜合指標(biāo)可保留原始指標(biāo)的主要信息，但互不相關(guān)，即主成分可代表原始數(shù)據(jù)，簡化分析模型。將主成分分析和聚類分析相結(jié)合的分析方法已經(jīng)用于工業(yè)生產(chǎn)、空氣質(zhì)量評價和農(nóng)業(yè)等方面[13-15]，并且已應(yīng)用于中藥材和中藥飲片質(zhì)量評價。王悅云等[16]建立了不同產(chǎn)地的34 批粗毛淫羊藿的指紋圖譜，并結(jié)合聚類分析、主成分分析和因子分析評價各產(chǎn)地粗毛淫羊藿質(zhì)量，選出其質(zhì)量較好的產(chǎn)地為貴陽、凱里、麻江等地。有研究[17]結(jié)合聚類分析和主成分分析研究檀香13 批藥材的指紋圖譜，揮發(fā)油含量較低的S3、S4 批次的檀香歸為一類，其他批次藥材歸為一類，表明該方法可合理地評價檀香藥材質(zhì)量。還有研究采用主成分分析和聚類分析方法對青皮[18]、尖尾風(fēng)[19]等飲片質(zhì)量進行評價。

本研究以前期實驗中優(yōu)選的最佳炮制工藝（取凈黃連，加黃酒（黃酒進行稀釋1∶4）悶潤2 h，至液吸盡，(150±10)℃炒制20 min，每100 kg黃連，用黃酒12.5 kg）炮制不同批次黃連所得到的酒黃連、中試所得酒黃連以及收集得來的酒黃連為研究對象，應(yīng)用HPLC 法建立酒黃連的特征圖譜，并在酒黃連的特征圖譜研究中運用聚類分析、主成分分析等方法結(jié)合處理實驗數(shù)據(jù)，對酒黃連質(zhì)量進行評價，以期為酒黃連的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Waters 2695 高效液相色譜儀（包括2695 四元梯度泵，在線脫氣機，自動進樣器，柱溫箱，2489 紫外檢測器，Empower 色譜工作站）；超聲波清洗器（SB25-12DTDN 型，寧波新芝生物科技股份有限公司）；循環(huán)多用真空泵（SHB-3 型，鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；BT-25S 電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；BS210S 電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）。

1.2 試劑

鹽酸藥根堿（批號B21451，純度≥98%）、非洲防己堿（批號B20391，純度≥98%）、黃連堿（批號B20560，純度≥98%）、表小檗堿（批號B20108，純度≥98%）、巴馬?。ㄅ朆21433，純度≥98%）、小檗堿（批號B21379，純度≥98%），購于上海源葉生物科技有限公司。乙腈和氨水（色譜純，美國Fisher 公司）；水為娃哈哈純凈水；其余試劑為分析純。

1.3 藥材

酒黃連飲片共20 批，其中S14、S15、S19、S20 為市售酒黃連，其他批次為根據(jù)優(yōu)選工藝炮制的自制樣品和中試樣品，用于炮制的黃連藥材經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定系楊瑤君教授鑒定為毛茛科植物黃連（Coptis chinensisFranch.）的干燥根莖。各批酒黃連粉碎，過二號篩備用。酒黃連樣品來源見表1。

表1 酒黃連樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：XtimateC18（4.6 mm*250 mm，5 μm）；流動相：A:30 mmol·L-1碳酸氫銨水溶液（1 000 mL碳酸氫銨水溶液含氨水7 mL、三乙胺1 mL），B：乙腈。乙腈梯度 洗 脫（0-12 min，10%-25%B；12-23 min，25%-30%B；23-35 min，30%-40%B；流速1 mL·min-1；檢測波長270 nm；柱溫30℃；進樣量10 μL。該條件下，基線平穩(wěn)、峰形較好，分離度符合要求。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液

精密稱取藥根堿、非洲防己堿、黃連堿、表小檗堿、巴馬汀、小檗堿6 種對照品適量，置于10 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度。其中各成分濃度分別為123 μg·mL-1、122 μg·mL-1、214 μg·mL-1、123 μg·mL-1、315 μg·mL-1、413 μg·mL-1。

2.2.2 供試品溶液

按照2015 年版《中華人民共和國藥典》黃連項下含量檢測方法，精密稱取20批酒黃連粉末（過二號篩）0.1 g，置具塞錐形瓶內(nèi)，精密加入甲醇∶鹽酸（100∶1）的混合液50 mL，稱定重量，密塞，超聲30 min（功率250 W，頻率40 kHz），放冷，用甲醇補足失重，濾過，濾液過微孔濾膜（0.45 μm），即得供試品溶液，備用[1]。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：D809010101），按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6 次，記錄色譜圖，將其導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”，以巴馬汀的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有色譜峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果顯示13 個共有峰的相對保留時間的RSD 值在0.04%-1.37%之間，相對峰面積的RSD 在1.21%-4.84%（n=6），表明儀器精密度符合要求。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：D809010101），分別在室溫下放置 0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h 時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以巴馬汀的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有色譜峰的相對相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果顯示13 個共有峰的相對保留時間的RSD 值在0.01%-0.78%之間，相對峰面積的RSD值在1.10%-4.53%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：D809010101）0.1 g，共6 份，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件進樣，以巴馬汀的保留時間和峰面積為參照，計算各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積。1-13 號峰的相對保留時間的RSD 值在0.02%-0.58%之間，相對峰面積的RSD 值在1.21%-4.89%之間。表明此方法重現(xiàn)性良好。

2.4 HPLC特征圖譜的生成及相似度評價

2.4.1 HPLC特征圖譜的生成

取20 批酒黃連粉末，按照“2.2.2”項下方法，制備供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件進行測定。記錄色譜圖，將其導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”，分析20 批酒黃連的HPLC 色譜圖，選取分離度、峰形較好的13 個峰為共有峰，得到特征圖譜，見圖1；藥材的共有模式圖譜見圖2。8-13 號峰分別與藥根堿、非洲防己堿、表小檗堿、黃連堿、巴馬汀和小檗堿的對照品保留時間相一致（混合對照品圖譜見圖3）。

2.4.2 相似度評價

圖1 20批酒黃連的疊加特征圖譜

圖2 酒黃連對照樣品的HPLC特征圖譜

圖3 混合對照品色譜圖

以酒黃連樣品的對照特征圖譜為參照圖譜，對20批酒黃連飲片的特征圖譜進行相似度分析，分析結(jié)果見表2。20 批酒黃連樣品的相似度為0.999-1.000，各批樣品相似度差異小，表明飲片質(zhì)量穩(wěn)定。

2.5 聚類分析

本研究將20 批酒黃連特征圖譜13 個共有峰的峰面積做標(biāo)準(zhǔn)化處理后作為變量，利用SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件，采用系統(tǒng)聚類法結(jié)合歐氏距離（Euclidean distance）作為樣品的測度，進行聚類分析。通過聚類分析可得到樹狀圖，其中同組樣本相關(guān)性較高，不同組樣本相關(guān)性較小，樹狀圖可以更加直觀地分析各樣本間的相關(guān)性，結(jié)果見圖4。

由圖 4 可知，d=20 時，20 批酒黃連可以分為 2 類，S4-S13 為一類，酒黃連藥材產(chǎn)地為四川，S1-S3 及S14-S20 為一類，即酒黃連藥材來源為重慶和湖北的分為一類。d=18 時，20 批酒黃連樣品可以分為3 類，將產(chǎn)地為重慶和湖北的酒黃連區(qū)分開，在生物堿含量方面，S1、S2、S3聚為一類，生物堿含量較低；S4-S13聚為一類，生物堿含量高；S14-S20 聚為一類，生物堿含量較高。20 批酒黃連生物堿含量見表3，主要測定各批酒黃連中藥根堿、非洲防己堿、表小檗堿、黃連堿、巴馬汀、小檗堿等六種生物堿含量及總生物堿含量。聚類結(jié)果與其產(chǎn)地相一致，表明聚類分析可以用來區(qū)分不同產(chǎn)地和不同質(zhì)量的酒黃連。

2.6 主成分分析

主成分分析是一個正交化線性變換的過程，通過線性變換，將原始數(shù)據(jù)中多個相關(guān)指標(biāo)組合成幾個綜合指標(biāo)（主成分），即原始指標(biāo)的線性組合，綜合指標(biāo)可保留原始指標(biāo)的主要信息，但互不相關(guān)，即主成分可代表原始數(shù)據(jù)，簡化分析模型。

本研究中用SPSS 19.0 統(tǒng)計分析軟件將20 批酒黃連13個共有峰的峰面積做標(biāo)準(zhǔn)化處理后，以主成分的特征值和貢獻率為依據(jù)，對其進行主成分分析。主成分分析中坐標(biāo)系的轉(zhuǎn)化將數(shù)據(jù)變換到新的坐標(biāo)系統(tǒng)中，每個變量在新軸上的投影稱為其載荷，表示該軸上每個變量的相對重要性并有相關(guān)得分。為了使分析結(jié)果更加直觀，主成分分析選取3個主成分，特征值分別為9.096、2.386、0.513，累積方差貢獻率分別是69.968%、88.322%、92.271%，結(jié)果見表4。

表2 20批酒黃連樣品相似度

圖4 20批酒黃連聚類分析樹狀圖

表3 20批酒黃連生物堿含量（n=2）

表4 2個主成分的特征值和方差貢獻率

20 批酒黃連根據(jù)主成分得分 Y1、Y2、Y3作散點圖分析其聚類結(jié)果。主成分分析聚類結(jié)果見圖5，在主成分空間中距離較近的為同類樣本，距離較遠(yuǎn)的為不同類樣本。圖5 顯示20 批酒黃連可聚為三類，S1、S2、和 S3 距離較近，S4-S13 聚在一起，S14-S20 中 S17、S18、S19 在主成分空間中比較分散，此結(jié)果與聚類分析結(jié)果較一致。

3 討論

本研究前期探究了酒黃連的較優(yōu)炮制工藝。以炮制品外觀性狀和藥根堿、非洲防己堿、表小檗堿、黃連堿、巴馬汀、小檗堿等六種生物堿含量為指標(biāo)綜合評分，采用正交實驗的方法，考察黃酒稀釋倍數(shù)、悶潤時間、炒制溫度、炒制時間等因素對酒黃連質(zhì)量的影響，優(yōu)選出酒黃連的較優(yōu)炮制工藝：取凈黃連，加黃酒（黃酒進行稀釋 1∶4）悶潤 2 h，至液吸盡，（150±10）℃炒制20 min，每100 kg 黃連，用黃酒12.5 kg。經(jīng)驗證實驗、中試實驗表明該工藝穩(wěn)定、可行。使用該工藝炮制的酒黃連及購買的酒黃連用作本研究中的樣品。

本研究建立了酒黃連的HPLC 特征圖譜并進行相似度分析。特征圖譜的建立選擇碳酸氫銨水溶液-乙腈為流動相，梯度洗脫；檢測波長270 nm；柱溫30℃；進樣量10 μL的色譜條件，在此條件下基線平穩(wěn)、峰形較好，分離度符合要求，具有較好的重復(fù)性和專屬性。HPLC 法較為全面地反應(yīng)了酒黃連飲片中化學(xué)成分的信息，選取分離度較好地13 個特征峰形成特征圖譜，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品對照可知8號峰為藥根堿、9號峰為非洲防己堿、10號峰為表小檗堿、11號峰為黃連堿、12號峰為巴馬汀、13號峰為小檗堿。相似度分析結(jié)果表明20批酒黃連相似度為0.999-1.000，相似度較高，20 批酒黃連飲片質(zhì)量穩(wěn)定。

圖5 20批酒黃連主成分分析圖

主成分分析和聚類分析是較為常用的多元統(tǒng)計方法，用于探索數(shù)據(jù)和分組之間的關(guān)系尚不清楚的樣本之間的相似性和隱藏模式。主成分分析（PCA）可對大型多元數(shù)據(jù)集的變量進行重組，使重構(gòu)數(shù)據(jù)集的前幾個變量占數(shù)據(jù)方差的絕大部分，其目的是確定若干變量之間最重要的相關(guān)關(guān)系，以便在原始變量的基礎(chǔ)上用很少的線性組合描述總體方差。聚類分析方法可發(fā)現(xiàn)各樣本之間的相似性，根據(jù)相似性大小將樣本聚類，并生成聚類圖。聚類分析應(yīng)用數(shù)據(jù)的所有方差進行分類，但會丟失每類中變量的相關(guān)關(guān)系信息；主成分分析選擇的主成分代表60%-90%的原始信息，但可表明原始數(shù)據(jù)間的相關(guān)性，與單獨使用這兩種方法相比，將主成分分析與聚類分析結(jié)合使用可以提供更多的信息[20]。

在飲片質(zhì)量穩(wěn)定的基礎(chǔ)上應(yīng)用SPSS 19.0 數(shù)據(jù)處理軟件根據(jù)特征圖譜對20批酒黃連飲片聚類分析，表明聚類分析可對酒黃連進行較好地分類，分析結(jié)果為當(dāng)歐式距離d=18 時，20 批酒黃連可分為三類：生物堿總含量較低的S1-S3，即產(chǎn)地為重慶的酒黃連聚為一類；生物堿總含量高的S4-S13，即產(chǎn)地為四川的酒黃連聚為一類；生物堿總含量較高的S14-S20，即產(chǎn)地為湖北的酒黃連聚為一類，表明基于生物堿成分含量差異評價酒黃連質(zhì)量的差異與其產(chǎn)地有關(guān)。對酒黃連的特征圖譜進行主成分分析，共選擇了3個主成分，累積方差貢獻率達(dá)到90%以上，各批飲片在主成分空間中相距較近的為一類，主成分分析同樣將20批酒黃連分為三類：S1-S3 聚為一類；S4-S13 聚為一類；S14-S20 中 S17、S18、S19 在主成分空間中與其他批次距離較遠(yuǎn)，主成分分析結(jié)果與聚類分析結(jié)果相近，這表明兩種分析結(jié)果的一致性和科學(xué)性。此外，聚類分析和主成分分析相結(jié)合可發(fā)揮二者的優(yōu)勢，相互驗證、補充，實現(xiàn)快速分析。綜上所述，本研究基于聚類分析和主成分分析研究酒黃連HPLC 特征圖譜可作為酒黃連質(zhì)量評價的方法和依據(jù)。