灰色關聯(lián)分析丹梔逍遙散調節(jié)T2DM 胰島抵抗主效應*

★ 許星明 譚榮榮 王曉敏*（江西中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院 南昌 330004）

灰色關聯(lián)分析模型是近年一種成熟系統(tǒng)建模方法，具有需要的樣本少，無典型的分布規(guī)律，計算量小等特點。其通過求因素的發(fā)展態(tài)勢和系統(tǒng)之間的關聯(lián)度來說明各個因素的變化對系統(tǒng)整體行為的影響程度［1］。該方法已在農(nóng)業(yè)、水利、材料科學、宏觀經(jīng)濟等多方面得到廣泛應用［2-3］，但在生物系統(tǒng)尤其涉及調節(jié)機理的應用研究卻非常少見。

丹梔逍遙散是中醫(yī)學調節(jié)情志的名方［4］，由當歸、白芍、茯苓、白術、柴胡、丹皮、梔子、甘草等中藥組成，為針對臨床肝郁血虛，內有郁熱證的糖尿病合并抑郁的病機特點所立之方，其主要功效為疏肝解郁、清熱［5］。

本課題組前期研究結果表明丹梔逍遙散能降低血糖、血脂、降低胰島素抵抗，能提高外周胰島素靶組織―肝組織胰島素信號通路的IRS-2mRNA和PI3-KmRNA 表達，但對肝組織的AktmRNA 表達影響不大［6-7］。可能是外周胰島素抵靶點的多樣性引起，但其互相關系未見報道。因此本研究運用灰色關聯(lián)模型探討丹梔逍遙散對胰島外周抵抗靶部位肌肉和脂肪Akt、Bcl-2、Casepase-9、Bax、ERK、Glp mRNA 六種基因對糖尿病大鼠血糖影響。

1 材料

1.1 動物 清潔級雄性SD 大鼠60 只，體重200～250 g，購自湖南斯萊克斯實驗動物有限公司。動物飼養(yǎng)于江西中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院實驗動物中心。室溫保持在20 ℃～25 ℃，濕度45 %～65 %，12 h 光照，12 h 黑暗。

1.2 藥物及配制 柴胡6 g、當歸6 g、白芍6 g、茯苓6 g、白術6 g、丹皮3 g、梔子3 g、甘草3 g。購于江西省南昌市老百姓藥店，按人與動物體表面積折算法折算大鼠等效劑量為5 g/（kg·d），用5 倍于藥材的冷水浸泡20 min，用武火煎至水沸，改用文火30 min，濾出藥液加冷水適量，煎至水沸，改用文煎煮20 min，濾渣，將兩次煎取藥液混勻濃縮成每毫升含生藥2 g 的藥液，冰箱0 ℃～ 4 ℃保存，每周新鮮配制。

1.3 試劑與儀器 膽固醇、膽酸鈉（生工生物工程（上海）有限公司）；水合氯醛（天津市福晨化學試劑廠）；鹽酸二甲雙胍（正大天晴藥業(yè)集團股份有限公司）；羅氏活力血糖儀（Roche 公司）、羅氏活力血糖儀試紙（Roche 公司）。臺式低溫高速離心機CR15T（德國IKA）；SHZ-82 氣浴恒溫振蕩器（金壇市順華儀器公司）；微型離心機D1008E（SCILOGEX），超低溫冰箱Eppendorf 410（美國Eppendorf 公司）；Aquelix 5 二級純水儀（美國Millipore），DU730 型核酸蛋白分析儀GeneAmpPCR System2400；實時熒光定量PCR 儀Applied Biosystems StepOne； Fluor Chem M（凝 膠成像系統(tǒng)）（美國Protein Simple 公司）。

2 方法

2.1 動物模型建立方法和給藥 SD 大鼠，給予高糖高脂乳劑灌胃（66.6 % 基礎料、20 % 豬油、20 %蔗糖、10 %豬油、2.5 %膽固醇、1 %膽酸鈉）1 mL/100（g·d），3 周后，禁食12 h，一次性腹腔注射STZ30 mg/kg 體重（STZ 溶于檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，所配濃度為10 mg/mL），72 h 后內眥靜脈采血測定空腹血糖，篩選血糖＞11.1 mmol/L 大鼠40 只［8］。空白對照組和模型組每日以2 mL 飲用水灌胃；丹梔逍遙散高劑量組10g/（kg·d）、低劑量組5 g/（kg·d）；二甲雙胍組，鹽酸二甲雙胍懸濁液20.8 mg/（kg·d），共8 周。

2.2 血糖 禁食12h 處死大鼠，取其血清測血糖（酶法）。

2.3 組織mRNA 的表達情況 取大鼠的肌肉組織和脂肪組織分別進行RNA 的提取，然后RT-PCR法檢測Akt、Bcl-2、Casepase-9、Bax、ERK、Glp mRNA 的表達情況，并通過AlphaView SA 軟件測量出灰度值。

2.4 灰色分析模型的構建［9］

2.4.1 肌肉和脂肪相關基因的RNA 表達量進行無量綱化處理 取大鼠肌肉和脂肪分別進行RNA 的提取，然后RT-PCR 檢測Akt、Bcl-2、Casepase-9、Bax、ERK、Glp mRNA 的 表 達 情 況，并 通 過AlphaView SA 軟件測量出灰度值，計算各自與內參比值后，采用初值化法進行無量綱化處理。以模型組為對照組，作為初值，根據(jù)X'i（k）=Xi 實際（k）/Xi模型（k）（i 為正常、二甲雙胍、高劑量、低劑量組，k 為基因Akt、Bcl-2、Casepase-9、Bax、ERK、Glp）得到無量綱化數(shù)組，見表1-2。

表1 各組肌肉中相關基因RNA的無量綱化數(shù)值

表2 各組脂肪中相關基因RNA的無量綱化數(shù)值

2.4.2 計算絕對差值 逐個計算每個被評價對象指標序列（比較序列）與參考序列對應元素的絕對差值，即|X模型（k）-Xi（k）|（i 為正常、二甲雙胍、高劑量、低劑量組，k 為基因Akt、Bcl-2、Casepase-9、Bax、ERK、Glp），得到絕對差值，見表3-4。

表3 各組肌肉相關目的基因的絕對差值

表4 各組脂肪相關目的基因的絕對差值

2.4.3 找出最大最小絕對差值 肌肉中最大絕對差值為0.56、最小絕對差值為0.03；脂肪中最大絕對差值為0.54 最小絕對差值為0.01。

2.4.4 計算各組關聯(lián)系數(shù)和關聯(lián)度 根據(jù)公式分別計算每個比較序列與參考序列對應元素的關聯(lián)系數(shù)，見表5-6。

（其中X（K）為模型組的無量綱化序列，i為正常、二甲雙胍、高劑量、低劑量組，k 為基因Akt、Bcl-2、Casepase-9、Bax、ERK、Glp，min為最小絕對差值，max 為最大絕對差值，ρ 為分辨系數(shù)在［0，1］之間，在這取0.5［10］。）

對各評價對象（比較序列）分別計算其個指標與參考序列對應元素的關聯(lián)系數(shù)的均值，以反映各評價對象與參考序列的關聯(lián)關系，并稱其為關聯(lián)度。

根據(jù)公式得

表5 各組肌肉中的關聯(lián)系數(shù)和關聯(lián)度

表6 各組脂肪的關聯(lián)系數(shù)和關聯(lián)度

3 結果

3.1 各組的血糖值比較 給藥前，高脂飼料聯(lián)合低劑量STZ 造模的各組大鼠血糖明顯升高，與空白對照組比較具有顯著性差異（P＜0.05）。給藥后，與模型組比較，丹梔逍遙散低、高劑量組，陽性對照組對大鼠的血糖下降明顯，有顯著性差異（P＜0.05），見表7。

表7 各組的血糖變化的比較（）組別 n 給藥前（ummol/L） 給藥后（ummol/L）空白對照 8 5.5±0.7 4.8±0.7模型 7 21.0±6.1** 16.6±5.4二甲雙胍 8 20.5±7.6** 10.1±4.7#高劑量 8 19.6±6.2** 12.8±5.1#低劑量 7 20.1±8.4** 12.4±5.2#與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組，#P＜0.05，##P＜0.01。

3.2 肌肉組織相關靶基因對血糖的影響和關聯(lián)度 模型組為對照，肌肉組織中各組靶基因表達對血糖的影響：空白對照組0.67，二甲雙胍組0.70，高劑量組0.66，低劑量組0.73。肌肉組織中相關靶基因對血糖的關聯(lián)度，其中Bax、Caspase-9、Erk基因對血糖的影響比較明顯。

3.3 脂肪組織各組靶基因表達對血糖的影響和關聯(lián)度 空白對照組0.64，二甲雙胍組0.70，高劑量組0.69，低劑量組0.65。相關靶基因對血糖的關聯(lián)度，其中Bax、Caspase-9、Erk 基因對血糖的影響比較明顯。

3.4 肌肉組織和脂肪組織的相關靶基因對血糖影響的關聯(lián)度 具有一致性。

4 討論

灰色關聯(lián)理論是1982 年由鄧聚龍創(chuàng)立的一門學說，將信息不完全作為灰的基本定義即：信息不完全的系統(tǒng)就為灰色系統(tǒng)。信息不完全一般是指的是：系統(tǒng)之間的關系不完全明確、單個系統(tǒng)中各因素關系不完全明確、系統(tǒng)結構不完全知道、系統(tǒng)的作用原理不完全清楚。本研究中，各個基因之間對糖尿病大鼠血糖的影響調控不明確，肌肉和脂肪兩個系統(tǒng)之間對糖尿病大鼠血糖的影響調控不明確，完全符合灰色系統(tǒng)的定義，因此本研究采用了灰色關聯(lián)理論分析相關基因對糖尿病大鼠血糖的調控影響，并得出了一致性的結論：外周抵抗靶部位肌肉和脂肪組織中的Bax、Caspase-9、Erk 對糖尿病大鼠血糖的調控影響大，且對血糖影響的關聯(lián)度具有一致性。其中Bax、Caspase-9 屬于凋亡基因，而ERK 是細胞外調節(jié)蛋白激酶屬于信號通路蛋白。我們推測是否ERK 基因所在的信號通路，對凋亡基因起到調控作用，抑制胰島細胞凋亡，從而促進胰島素的分泌，減低糖尿病大鼠的血糖。不過他們之間是否有聯(lián)系，及如何進行聯(lián)系的，還需要進一步深入研究。