魚油脂肪酸EPA和DHA的分離影響研究

夏堯干，王 宇，鄒雯燕，錢婷婷，古東穎，梁明在*

(1.淮陰工學(xué)院 化學(xué)工程學(xué)院制藥工程系，江蘇 淮安 223003；2.臺(tái)灣義守大學(xué) 化學(xué)工程系，臺(tái)灣 高雄 84001)

魚油是一種從深海多脂魚類中提取的油脂，富含多種對(duì)人體有益的多不飽和脂肪酸[1]。魚油是指包括魚肝油在內(nèi)的魚的脂肪，但是它的主要功效成分有兩種，分別為二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)，目前市場(chǎng)上出現(xiàn)的魚油產(chǎn)品也多以魚油脂肪酸EPA和DHA為主。作為一種新型保健醫(yī)療食品，魚油脂肪酸EPA和DHA具有調(diào)節(jié)血脂、改善視力、預(yù)防老年癡呆和腦血栓等多種功效[2]。但是未經(jīng)過(guò)加工處理的粗魚油中EPA和DHA的含量相對(duì)較低，不能直接滿足保健食品及醫(yī)藥行業(yè)的要求。除此以外，粗魚油中的飽和脂肪酸及膽固醇等物質(zhì)也會(huì)在一定程度上增加服用者患病的風(fēng)險(xiǎn)，所以需要對(duì)粗魚油中的魚油脂肪酸EPA和DHA進(jìn)行富集和純化處理[3]。雖然魚油脂肪酸EPA和DHA都是魚油的主要功效成分，但是二者的生理作用卻存在著一些差異[4]，所以在某些情況下需要根據(jù)不同用途將二者進(jìn)行分開使用。為了便于實(shí)現(xiàn)二者功效最大化，需要制備高純度的魚油脂肪酸EPA和DHA單體。現(xiàn)代企業(yè)制備高純度魚油脂肪酸EPA和DHA單體主要分為兩個(gè)步驟，第一步是對(duì)粗魚油中魚油脂肪酸EPA和DHA進(jìn)行富集處理，第二步是對(duì)富集得到的魚油脂肪酸EPA和DHA混合物進(jìn)行分離純化，最終獲得高純度的魚油脂肪酸EPA和DHA單體[5]。在目前的魚油生產(chǎn)過(guò)程中，大部分的企業(yè)采用低溫結(jié)晶法、尿素包合法、分子蒸餾法等方法來(lái)實(shí)現(xiàn)魚油脂肪酸EPA和DHA的富集[6]，但這些方法或多或少存在著一些缺點(diǎn)，比如富集效率低、能耗大、溶劑用量大、溶劑殘留等，這些缺點(diǎn)都會(huì)對(duì)后期高純度魚油脂肪酸EPA和DHA單體的制備產(chǎn)生一些不好的影響。超臨界流體色譜技術(shù)(SFC)作為一種新型的提取分離技術(shù)，不僅具有超臨界流體萃取操作溫度低、參數(shù)調(diào)節(jié)方便、后處理簡(jiǎn)單、無(wú)溶劑殘留等眾多優(yōu)點(diǎn)，而且還兼?zhèn)淞松V法高效性和高選擇性的特性，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的分離制備[7]。例如任其龍等[8]結(jié)合之前的研究，以超臨界 CO2作為流動(dòng)相、富含苯環(huán)的反相填料作為固定相，發(fā)明了一種超臨界色譜制備高純度魚油脂肪酸EPA和DHA單體的工藝。該工藝將魚油原料液直接注入色譜柱中進(jìn)行分離，最后采用餾分切割裝置制備出純度大于95%的魚油脂肪酸EPA和DHA單體。Zhao等[9]采用超臨界流體色譜技術(shù)有效分離了胡蘆巴中的6對(duì)螺甾皂苷25R/S異構(gòu)體，并對(duì)其進(jìn)行了分析研究。呂惠生等[10]采用超臨界流體色譜技術(shù)直接從檸檬酸發(fā)酵液中分離制備得到純度高達(dá)99.6%的檸檬酸。本研究以魚油脂肪酸EPA、DHA標(biāo)準(zhǔn)品為研究對(duì)象，采用超臨界流體色譜技術(shù)探究溫度、壓力以及輔溶劑比例對(duì)魚油脂肪酸EPA和DHA的分離影響，為后續(xù)分離純化出高純度的魚油脂肪酸EPA和DHA單體提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1儀器

超臨界設(shè)備(臺(tái)灣金屬工業(yè)研究發(fā)展中心)；高效液相色譜儀(泵HITACHIL2130)；檢測(cè)器(HITACHI L-4200 UV-Vis)；SAMPO KB-RD85U型真空烘箱。

1.1.2試劑

魚油脂肪酸EPA及DHA標(biāo)準(zhǔn)品(南京春秋公司)；95%乙醇(景明化工股份有限公司，分析純)；CO2(錦德氣體有限公司，純度>99.9%)。

1.2 方法

1.2.1分析方法的建立

為了比較不同條件下魚油脂肪酸EPA和DHA的分離效果，本實(shí)驗(yàn)確定以分離常數(shù)K作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的分析方法。分離常數(shù)K的計(jì)算如下：

式中t0為不滯留成分的流出時(shí)間，tR為魚油脂肪酸EPA和DHA滯留時(shí)間與死時(shí)間td的差值，Ei表示管柱的孔隙率。

實(shí)驗(yàn)選用的管柱為Viridis silica 2-EP(250 mm × 10 mm，5 μm)，輔溶劑為99.5%的乙醇，CO2的流速為4 g/min。選取實(shí)驗(yàn)條件溫度(30, 40, 50℃)，壓力(120, 140, 150 bar)，輔溶劑比例(8%、10%、12%)進(jìn)行分離效果影響實(shí)驗(yàn)。分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果并通過(guò)二者分離常數(shù)的差值△K來(lái)評(píng)價(jià)魚油脂肪酸EPA和DHA的分離效果。

1.2.2色譜條件

超臨界流體色譜分析條件：流動(dòng)相為二氧化碳-乙醇；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為 215 nm；進(jìn)樣量為20 μL；CO2的流速為4 g/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度的影響

作為一種超臨界流體，CO2的溶解能力以及擴(kuò)散系數(shù)在很大程度上受到柱溫度變化的影響。一般情況下，色譜柱的溫度越大，超臨界CO2流體對(duì)溶質(zhì)的溶解能力越好，同時(shí)其粘滯系數(shù)也會(huì)有所降低[11]。該因素的實(shí)驗(yàn)分析以在120 bar、10% ETOH條件下得到的結(jié)果為例，由表1可知，當(dāng)色譜柱的柱溫度逐漸升高時(shí)，魚油脂肪酸EPA和DHA的滯留時(shí)間也逐漸變長(zhǎng)。與此同時(shí)，隨著色譜柱溫度的升高，魚油脂肪酸EPA和DHA之間分離常數(shù)的差值△K也逐漸增大，因此適當(dāng)提高溫度有利于魚油脂肪酸EPA和DHA的分離。分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，當(dāng)色譜柱溫度達(dá)到50℃時(shí)，魚油脂肪酸EPA與DHA分離常數(shù)的差值△K最大，分離效果最好。

表1 溫度對(duì)魚油脂肪酸EPA和DHA分離效果的影響

2.2 壓力的影響

通過(guò)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)色譜柱壓力對(duì)魚油脂肪酸EPA和DHA分離的影響較為復(fù)雜。在不同的溫度條件下，色譜柱壓力對(duì)魚油脂肪酸EPA和DHA分離的影響不同，這是因?yàn)椴煌瑴囟葪l件下的壓力對(duì)超臨界CO2流體的溶解能力以及擴(kuò)散系數(shù)的影響不同。鑒于色譜柱溫度的提高有利于魚油脂肪酸EPA和DHA分離，因此選取在50℃、10% ETOH條件下得到的結(jié)果為例，分析壓力因素對(duì)魚油脂肪酸EPA和DHA分離的影響。由表2可知，在50℃、10% ETOH條件下，與溫度的影響規(guī)律截然相反，隨著色譜柱壓力的逐漸增大，魚油脂肪酸EPA和DHA的滯留時(shí)間逐漸減小，這很可能是由于壓力的增大影響了魚油脂肪酸分子在固定相表面的吸附以及CO2流體的擴(kuò)散。此外，在50℃、10% ETOH條件下，雖然降低色譜柱的壓力有利于魚油脂肪酸EPA和DHA的分離，但是考慮到超臨界設(shè)備的耐壓能力以及為了提高后續(xù)分離純化魚油脂肪酸EPA與DHA的效能著想，色譜柱的壓力選擇140 bar更為合適。

表2 壓力對(duì)魚油脂肪酸EPA和DHA分離效果的影響

2.3 輔溶劑比例的影響

超臨界流體色譜技術(shù)(SFC)一般采用CO2作為主流動(dòng)相，輔溶劑的選擇也以醇類為主的有機(jī)溶劑。由于流動(dòng)相與固定相的極性相差非常大，因此輔溶劑微小比例的變化就會(huì)對(duì)分離效果帶來(lái)較大的改變。由表3可知，在50℃、140 bar條件下，隨著流動(dòng)相中乙醇比例的增加，魚油脂肪酸EPA和DHA的滯留時(shí)間逐漸減少，因此適當(dāng)增加輔溶劑的比例有利于提高后期模擬移動(dòng)床分離魚油脂肪酸EPA和DHA的效能。不同的輔溶劑比例區(qū)間內(nèi)，輔溶劑比例對(duì)魚油脂肪酸EPA和DHA分離效果的影響不同。這是因?yàn)楫?dāng)乙醇比例過(guò)低或者過(guò)高時(shí)，兩相極性相差過(guò)大，導(dǎo)致魚油脂肪酸EPA和DHA不易在固定相表面吸附，所以輔溶劑比例過(guò)高或者過(guò)低都會(huì)導(dǎo)致魚油脂肪酸EPA和DHA之間的分離效果變差。對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得到，當(dāng)輔溶劑比例為12%時(shí)，魚油脂肪酸EPA和DHA的分離常數(shù)的差值△K最大，同時(shí)二者的滯留時(shí)間也相對(duì)較小，因此輔溶劑比例選擇12%更加有利于魚油脂肪酸EPA和DHA的分離。

表3 輔溶劑比例對(duì)魚油脂肪酸EPA和DHA分離效果的影響

2.4 分離影響的驗(yàn)證

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)考察溫度、壓力和輔溶劑比例對(duì)魚油脂肪酸EPA和DHA的分離影響，發(fā)現(xiàn)適當(dāng)?shù)靥岣邷囟群洼o溶劑比例有利于實(shí)現(xiàn)魚油脂肪酸EPA和DHA的分離。本實(shí)驗(yàn)確定了該色譜條件下魚油脂肪酸EPA和DHA最佳的分離條件，即以Viridis silica 2-EP(250 mm × 10 mm，5 μm)為色譜柱，流動(dòng)相為含12%乙醇的CO2流體，流速為4 g/min，柱溫度為50℃，柱壓力為140 bar?，F(xiàn)對(duì)該色譜條件下魚油脂肪酸EPA和DHA的分離影響進(jìn)行驗(yàn)證。本次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)一共選取3組分離條件進(jìn)行驗(yàn)證，其中包括最佳分離條件A(50℃、140 bar、12%乙醇)、分離條件B(50℃、140 bar、8%乙醇)、分離條件C(30℃、140 bar、12%乙醇)。由圖1可以明顯地看出，隨著溫度以及輔溶劑比例的增加，魚油脂肪酸EPA和DHA的分離效果越來(lái)越好。與此同時(shí)，結(jié)合表4可知，魚油脂肪酸EPA和DHA的滯留時(shí)間也越來(lái)越短。因此適當(dāng)提高溫度和輔溶劑比例不僅有利于魚油脂肪酸EPA和DHA的分離，而且可以提高后期二者分離純化的效能。雖然該色譜條件下的最佳分離條件A并沒(méi)有實(shí)現(xiàn)魚油脂肪酸EPA和DHA完全分離，但是該色譜條件下反映的各因素對(duì)魚油脂肪酸EPA和DHA分離的影響，為實(shí)現(xiàn)二者的分離提供了研究基礎(chǔ)。

圖1 不同分離條件下的魚油脂肪酸EPA和DHA的分離效果

表4 不同分離條件下的魚油脂肪酸EPA和DHA的分離效果

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)旨在探究溫度、壓力和輔溶劑比例對(duì)魚油脂肪酸EPA和DHA的分離影響，為了能夠更好地分析魚油脂肪酸EPA和DHA的出峰情況，本實(shí)驗(yàn)并未采用混標(biāo)法進(jìn)行進(jìn)樣。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)考察溫度、壓力和輔溶劑比例對(duì)魚油脂肪酸EPA和DHA的分離影響，發(fā)現(xiàn)溫度、壓力和輔溶劑比例對(duì)魚油脂肪酸EPA和DHA的分離都存在著一定的影響。其中壓力對(duì)魚油脂肪酸EPA和DHA分離的影響最為復(fù)雜，主要表現(xiàn)為在不同的溫度范圍內(nèi)，壓力對(duì)二者的分離影響不同。相較之下，溫度和輔溶劑比例對(duì)魚油脂肪酸EPA和DHA分離的影響比較直觀，適當(dāng)?shù)靥岣邷囟群洼o溶劑比例不僅可以增強(qiáng)二者的分離效果，而且可以提高后期魚油脂肪酸EPA和DHA分離純化的效能。該色譜條件下反映的各因素對(duì)魚油脂肪酸EPA和DHA分離的影響，為魚油脂肪酸EPA和DHA的分離純化研究提供了良好的基礎(chǔ)。