魚(yú)油脂肪酸EPA和DHA的分離影響研究

夏堯干，王 宇，鄒雯燕，錢(qián)婷婷，古東穎，梁明在*

(1.淮陰工學(xué)院 化學(xué)工程學(xué)院制藥工程系，江蘇 淮安 223003；2.臺(tái)灣義守大學(xué) 化學(xué)工程系，臺(tái)灣 高雄 84001)

魚(yú)油是一種從深海多脂魚(yú)類中提取的油脂，富含多種對(duì)人體有益的多不飽和脂肪酸[1]。魚(yú)油是指包括魚(yú)肝油在內(nèi)的魚(yú)的脂肪，但是它的主要功效成分有兩種，分別為二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)，目前市場(chǎng)上出現(xiàn)的魚(yú)油產(chǎn)品也多以魚(yú)油脂肪酸EPA和DHA為主。作為一種新型保健醫(yī)療食品，魚(yú)油脂肪酸EPA和DHA具有調(diào)節(jié)血脂、改善視力、預(yù)防老年癡呆和腦血栓等多種功效[2]。但是未經(jīng)過(guò)加工處理的粗魚(yú)油中EPA和DHA的含量相對(duì)較低，不能直接滿足保健食品及醫(yī)藥行業(yè)的要求。除此以外，粗魚(yú)油中的飽和脂肪酸及膽固醇等物質(zhì)也會(huì)在一定程度上增加服用者患病的風(fēng)險(xiǎn)，所以需要對(duì)粗魚(yú)油中的魚(yú)油脂肪酸EPA和DHA進(jìn)行富集和純化處理[3]。雖然魚(yú)油脂肪酸EPA和DHA都是魚(yú)油的主要功效成分，但是二者的生理作用卻存在著一些差異[4]，所以在某些情況下需要根據(jù)不同用途將二者進(jìn)行分開(kāi)使用。為了便于實(shí)現(xiàn)二者功效最大化，需要制備高純度的魚(yú)油脂肪酸EPA和DHA單體?，F(xiàn)代企業(yè)制備高純度魚(yú)油脂肪酸EPA和DHA單體主要分為兩個(gè)步驟，第一步是對(duì)粗魚(yú)油中魚(yú)油脂肪酸EPA和DHA進(jìn)行富集處理，第二步是對(duì)富集得到的魚(yú)油脂肪酸EPA和DHA混合物進(jìn)行分離純化，最終獲得高純度的魚(yú)油脂肪酸EPA和DHA單體[5]。在目前的魚(yú)油生產(chǎn)過(guò)程中，大部分的企業(yè)采用低溫結(jié)晶法、尿素包合法、分子蒸餾法等方法來(lái)實(shí)現(xiàn)魚(yú)油脂肪酸EPA和DHA的富集[6]，但這些方法或多或少存在著一些缺點(diǎn)，比如富集效率低、能耗大、溶劑用量大、溶劑殘留等，這些缺點(diǎn)都會(huì)對(duì)后期高純度魚(yú)油脂肪酸EPA和DHA單體的制備產(chǎn)生一些不好的影響。超臨界流體色譜技術(shù)(SFC)作為一種新型的提取分離技術(shù)，不僅具有超臨界流體萃取操作溫度低、參數(shù)調(diào)節(jié)方便、后處理簡(jiǎn)單、無(wú)溶劑殘留等眾多優(yōu)點(diǎn)，而且還兼?zhèn)淞松V法高效性和高選擇性的特性，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的分離制備[7]。例如任其龍等[8]結(jié)合之前的研究，以超臨界 CO2作為流動(dòng)相、富含苯環(huán)的反相填料作為固定相，發(fā)明了一種超臨界色譜制備高純度魚(yú)油脂肪酸EPA和DHA單體的工藝。該工藝將魚(yú)油原料液直接注入色譜柱中進(jìn)行分離，最后采用餾分切割裝置制備出純度大于95%的魚(yú)油脂肪酸EPA和DHA單體。Zhao等[9]采用超臨界流體色譜技術(shù)有效分離了胡蘆巴中的6對(duì)螺甾皂苷25R/S異構(gòu)體，并對(duì)其進(jìn)行了分析研究。呂惠生等[10]采用超臨界流體色譜技術(shù)直接從檸檬酸發(fā)酵液中分離制備得到純度高達(dá)99.6%的檸檬酸。本研究以魚(yú)油脂肪酸EPA、DHA標(biāo)準(zhǔn)品為研究對(duì)象，采用超臨界流體色譜技術(shù)探究溫度、壓力以及輔溶劑比例對(duì)魚(yú)油脂肪酸EPA和DHA的分離影響，為后續(xù)分離純化出高純度的魚(yú)油脂肪酸EPA和DHA單體提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1儀器

超臨界設(shè)備(臺(tái)灣金屬工業(yè)研究發(fā)展中心)；高效液相色譜儀(泵HITACHIL2130)；檢測(cè)器(HITACHI L-4200 UV-Vis)；SAMPO KB-RD85U型真空烘箱。

1.1.2試劑

魚(yú)油脂肪酸EPA及DHA標(biāo)準(zhǔn)品(南京春秋公司)；95%乙醇(景明化工股份有限公司，分析純)；CO2(錦德氣體有限公司，純度>99.9%)。

1.2 方法

1.2.1分析方法的建立

為了比較不同條件下魚(yú)油脂肪酸EPA和DHA的分離效果，本實(shí)驗(yàn)確定以分離常數(shù)K作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的分析方法。分離常數(shù)K的計(jì)算如下：

式中t0為不滯留成分的流出時(shí)間，tR為魚(yú)油脂肪酸EPA和DHA滯留時(shí)間與死時(shí)間td的差值，Ei表示管柱的孔隙率。

實(shí)驗(yàn)選用的管柱為Viridis silica 2-EP(250 mm × 10 mm，5 μm)，輔溶劑為99.5%的乙醇，CO2的流速為4 g/min。選取實(shí)驗(yàn)條件溫度(30, 40, 50℃)，壓力(120, 140, 150 bar)，輔溶劑比例(8%、10%、12%)進(jìn)行分離效果影響實(shí)驗(yàn)。分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果并通過(guò)二者分離常數(shù)的差值△K來(lái)評(píng)價(jià)魚(yú)油脂肪酸EPA和DHA的分離效果。

1.2.2色譜條件

超臨界流體色譜分析條件：流動(dòng)相為二氧化碳-乙醇；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為 215 nm；進(jìn)樣量為20 μL；CO2的流速為4 g/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度的影響

作為一種超臨界流體，CO2的溶解能力以及擴(kuò)散系數(shù)在很大程度上受到柱溫度變化的影響。一般情況下，色譜柱的溫度越大，超臨界CO2流體對(duì)溶質(zhì)的溶解能力越好，同時(shí)其粘滯系數(shù)也會(huì)有所降低[11]。該因素的實(shí)驗(yàn)分析以在120 bar、10% ETOH條件下得到的結(jié)果為例，由表1可知，當(dāng)色譜柱的柱溫度逐漸升高時(shí)，魚(yú)油脂肪酸EPA和DHA的滯留時(shí)間也逐漸變長(zhǎng)。與此同時(shí)，隨著色譜柱溫度的升高，魚(yú)油脂肪酸EPA和DHA之間分離常數(shù)的差值△K也逐漸增大，因此適當(dāng)提高溫度有利于魚(yú)油脂肪酸EPA和DHA的分離。分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，當(dāng)色譜柱溫度達(dá)到50℃時(shí)，魚(yú)油脂肪酸EPA與DHA分離常數(shù)的差值△K最大，分離效果最好。

表1 溫度對(duì)魚(yú)油脂肪酸EPA和DHA分離效果的影響

2.2 壓力的影響

通過(guò)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)色譜柱壓力對(duì)魚(yú)油脂肪酸EPA和DHA分離的影響較為復(fù)雜。在不同的溫度條件下，色譜柱壓力對(duì)魚(yú)油脂肪酸EPA和DHA分離的影響不同，這是因?yàn)椴煌瑴囟葪l件下的壓力對(duì)超臨界CO2流體的溶解能力以及擴(kuò)散系數(shù)的影響不同。鑒于色譜柱溫度的提高有利于魚(yú)油脂肪酸EPA和DHA分離，因此選取在50℃、10% ETOH條件下得到的結(jié)果為例，分析壓力因素對(duì)魚(yú)油脂肪酸EPA和DHA分離的影響。由表2可知，在50℃、10% ETOH條件下，與溫度的影響規(guī)律截然相反，隨著色譜柱壓力的逐漸增大，魚(yú)油脂肪酸EPA和DHA的滯留時(shí)間逐漸減小，這很可能是由于壓力的增大影響了魚(yú)油脂肪酸分子在固定相表面的吸附以及CO2流體的擴(kuò)散。此外，在50℃、10% ETOH條件下，雖然降低色譜柱的壓力有利于魚(yú)油脂肪酸EPA和DHA的分離，但是考慮到超臨界設(shè)備的耐壓能力以及為了提高后續(xù)分離純化魚(yú)油脂肪酸EPA與DHA的效能著想，色譜柱的壓力選擇140 bar更為合適。

表2 壓力對(duì)魚(yú)油脂肪酸EPA和DHA分離效果的影響

2.3 輔溶劑比例的影響

超臨界流體色譜技術(shù)(SFC)一般采用CO2作為主流動(dòng)相，輔溶劑的選擇也以醇類為主的有機(jī)溶劑。由于流動(dòng)相與固定相的極性相差非常大，因此輔溶劑微小比例的變化就會(huì)對(duì)分離效果帶來(lái)較大的改變。由表3可知，在50℃、140 bar條件下，隨著流動(dòng)相中乙醇比例的增加，魚(yú)油脂肪酸EPA和DHA的滯留時(shí)間逐漸減少，因此適當(dāng)增加輔溶劑的比例有利于提高后期模擬移動(dòng)床分離魚(yú)油脂肪酸EPA和DHA的效能。不同的輔溶劑比例區(qū)間內(nèi)，輔溶劑比例對(duì)魚(yú)油脂肪酸EPA和DHA分離效果的影響不同。這是因?yàn)楫?dāng)乙醇比例過(guò)低或者過(guò)高時(shí)，兩相極性相差過(guò)大，導(dǎo)致魚(yú)油脂肪酸EPA和DHA不易在固定相表面吸附，所以輔溶劑比例過(guò)高或者過(guò)低都會(huì)導(dǎo)致魚(yú)油脂肪酸EPA和DHA之間的分離效果變差。對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得到，當(dāng)輔溶劑比例為12%時(shí)，魚(yú)油脂肪酸EPA和DHA的分離常數(shù)的差值△K最大，同時(shí)二者的滯留時(shí)間也相對(duì)較小，因此輔溶劑比例選擇12%更加有利于魚(yú)油脂肪酸EPA和DHA的分離。

表3 輔溶劑比例對(duì)魚(yú)油脂肪酸EPA和DHA分離效果的影響

2.4 分離影響的驗(yàn)證

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)考察溫度、壓力和輔溶劑比例對(duì)魚(yú)油脂肪酸EPA和DHA的分離影響，發(fā)現(xiàn)適當(dāng)?shù)靥岣邷囟群洼o溶劑比例有利于實(shí)現(xiàn)魚(yú)油脂肪酸EPA和DHA的分離。本實(shí)驗(yàn)確定了該色譜條件下魚(yú)油脂肪酸EPA和DHA最佳的分離條件，即以Viridis silica 2-EP(250 mm × 10 mm，5 μm)為色譜柱，流動(dòng)相為含12%乙醇的CO2流體，流速為4 g/min，柱溫度為50℃，柱壓力為140 bar?，F(xiàn)對(duì)該色譜條件下魚(yú)油脂肪酸EPA和DHA的分離影響進(jìn)行驗(yàn)證。本次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)一共選取3組分離條件進(jìn)行驗(yàn)證，其中包括最佳分離條件A(50℃、140 bar、12%乙醇)、分離條件B(50℃、140 bar、8%乙醇)、分離條件C(30℃、140 bar、12%乙醇)。由圖1可以明顯地看出，隨著溫度以及輔溶劑比例的增加，魚(yú)油脂肪酸EPA和DHA的分離效果越來(lái)越好。與此同時(shí)，結(jié)合表4可知，魚(yú)油脂肪酸EPA和DHA的滯留時(shí)間也越來(lái)越短。因此適當(dāng)提高溫度和輔溶劑比例不僅有利于魚(yú)油脂肪酸EPA和DHA的分離，而且可以提高后期二者分離純化的效能。雖然該色譜條件下的最佳分離條件A并沒(méi)有實(shí)現(xiàn)魚(yú)油脂肪酸EPA和DHA完全分離，但是該色譜條件下反映的各因素對(duì)魚(yú)油脂肪酸EPA和DHA分離的影響，為實(shí)現(xiàn)二者的分離提供了研究基礎(chǔ)。

圖1 不同分離條件下的魚(yú)油脂肪酸EPA和DHA的分離效果

表4 不同分離條件下的魚(yú)油脂肪酸EPA和DHA的分離效果

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)旨在探究溫度、壓力和輔溶劑比例對(duì)魚(yú)油脂肪酸EPA和DHA的分離影響，為了能夠更好地分析魚(yú)油脂肪酸EPA和DHA的出峰情況，本實(shí)驗(yàn)并未采用混標(biāo)法進(jìn)行進(jìn)樣。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)考察溫度、壓力和輔溶劑比例對(duì)魚(yú)油脂肪酸EPA和DHA的分離影響，發(fā)現(xiàn)溫度、壓力和輔溶劑比例對(duì)魚(yú)油脂肪酸EPA和DHA的分離都存在著一定的影響。其中壓力對(duì)魚(yú)油脂肪酸EPA和DHA分離的影響最為復(fù)雜，主要表現(xiàn)為在不同的溫度范圍內(nèi)，壓力對(duì)二者的分離影響不同。相較之下，溫度和輔溶劑比例對(duì)魚(yú)油脂肪酸EPA和DHA分離的影響比較直觀，適當(dāng)?shù)靥岣邷囟群洼o溶劑比例不僅可以增強(qiáng)二者的分離效果，而且可以提高后期魚(yú)油脂肪酸EPA和DHA分離純化的效能。該色譜條件下反映的各因素對(duì)魚(yú)油脂肪酸EPA和DHA分離的影響，為魚(yú)油脂肪酸EPA和DHA的分離純化研究提供了良好的基礎(chǔ)。