圓斑星鰈(Verasper variegatus)wt1基因的克隆與表達(dá)分析*

楊珍珍 邊 力 張 巖 陳四清 常 青 張盛農(nóng) 劉長琳 葛建龍

圓斑星鰈(Verasper variegatus)wt1基因的克隆與表達(dá)分析*

楊珍珍1, 2邊 力1, 3張 巖1陳四清1, 3①常 青1張盛農(nóng)1劉長琳1葛建龍1

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071；2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306；3. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室 海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實驗室 青島 266071)

圓斑星鰈()雌魚生長快, 成熟雌魚個體大小是雄魚的2倍以上, 開展性別相關(guān)基因的功能研究, 對于探究圓斑星鰈性別決定機(jī)制, 建立單性培育技術(shù)具有重要意義。本研究獲得了及兩個同源基因,基因全長為3263bp, 預(yù)測開放閱讀框(ORF)長為1245bp, 編碼415個氨基酸, 5′-UTR和3′-UTR分別長372bp和1640bp；基因全長為2312bp, 預(yù)測開放閱讀框(ORF)長為1281bp, 編碼427個氨基酸, 5’-UTR和3’-UTR分別長369bp和659bp。基因編碼氨基酸分子量為46.2kDa, 理論等電點為9.24, 無跨膜結(jié)構(gòu)及信號肽, 在ORF末端有4個鋅指結(jié)構(gòu), 編碼KTS三肽；基因編碼氨基酸分子量為46.95kDa, 理論等電點為8.99, 無跨膜結(jié)構(gòu)及信號肽, 在ORF末端有4個鋅指結(jié)構(gòu), 并且編碼 KTS三肽?；虮磉_(dá)結(jié)果表明:和基因主要在圓斑星鰈性腺中表達(dá), 精巢的表達(dá)高于卵巢, 腎臟的表達(dá)量顯著高于其他組織, 推測基因和基因在性腺和腎臟發(fā)育過程及功能方面均發(fā)揮重要作用；在早期發(fā)育階段,基因在原腸期之前微弱表達(dá), 從原腸早期開始逐漸上升至神經(jīng)胚期表達(dá)量達(dá)到最高, 之后逐漸下降, 直至孵化階段, 推測基因在圓斑星鰈原始生殖細(xì)胞分化過程及性腺發(fā)育中發(fā)揮重要作用。

圓斑星鰈；；基因克隆；表達(dá)分析

腎母細(xì)胞瘤系嬰幼兒最常見的惡性腫瘤之一, 多發(fā)生于3歲以內(nèi)兒童(Pelletier, 1991), 發(fā)病率約為1/10000(Sharma, 1992)。1899年Max Wilms首次對腎母細(xì)胞瘤進(jìn)行了詳細(xì)描述(Kreidberg, 1993), 因此, 又將其命名為Wilms瘤。1990年Gessler等分離克隆出一個與Wilms瘤相關(guān)的基因(Gessler, 1990), 命名為Wilms’tumor 1()。基因可編碼含有鋅指結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì), 在性腺發(fā)育及分化過程中識別、結(jié)合和調(diào)控雄性性別決定基因(Hossain, 2001)類固醇生成因子-1(sf-1) (Wilhelm, 2002)及苗勒管抑制物(Hossain, 2003)等性別發(fā)育關(guān)鍵基因。人類基因突變會導(dǎo)致性腺和腎臟等器官發(fā)育異常及相關(guān)功能障礙(Klamt, 1998), 導(dǎo)致Denys-Drash綜合征、Frasier綜合征及小兒腎癌等疾病。敲除小鼠基因后, 其性腺及腎臟等器官均出現(xiàn)發(fā)育缺陷, 甚至導(dǎo)致腎功能衰竭(Wiener, 1996; Moore,1999)。由于魚類特有的基因組復(fù)制,基因分化為了和兩個同源基因, 目前已在斑馬魚()(Bollig, 2006)、青鳉()(Klüver,2009)、半滑舌鰨()(張紅等, 2014)、牙鲆()(孫近近, 2016)、黃鱔()(胡青等, 2014)及尼羅羅非魚()(江東能, 2016)等開展了基因的克隆及功能研究。

圓斑星鰈俗稱花斑寶、花片等, 屬脊索動物門(Chordata)、硬骨魚綱(Osteichthyes)、鰈形目(Pleuronectiformes)、鰈科(Pleuronectidae)、星鰈屬()。其外觀漂亮, 體型較大, 食性范圍廣, 生長速度快, 出肉率高, 抗病能力強(qiáng), 肉質(zhì)細(xì)膩鮮美, 鰭邊堅韌有彈性, 富含多種氨基酸、維生素及微量元素, 屬于名貴的海水品種, 目前已成為我國北方優(yōu)良的養(yǎng)殖對象。在生長過程中, 雄性個體3年可性成熟, 雌性個體需要4年才可達(dá)到性成熟, 而且雌性個體的生長明顯快于雄性個體。目前, 在圓斑星鰈中僅對基因(柳學(xué)周等, 2013)、基因(張樂樂, 2018)、基因(張樂樂等, 2018)及基因(楊珍珍等, 2020)做了相關(guān)研究, 其性別決定和生殖調(diào)控的分子機(jī)制仍不清楚, 因此我們利用RACE末端擴(kuò)增技術(shù)克隆了圓斑星鰈和基因cDNA全長并分析了其序列結(jié)構(gòu)特征, 利用實時熒光定量PCR技術(shù)對其不同發(fā)育時期的胚胎、仔魚以及雌雄成魚的不同組織進(jìn)行表達(dá)分析, 以闡明和基因在圓斑星鰈性腺分化及發(fā)育中的作用, 為研究圓斑星鰈性別決定及單性繁育等提供新的靶標(biāo)基因。

1 材料與方法

1.1 樣品制備及wt1基因全長序列克隆

從山東省煙臺天源水產(chǎn)有限公司采集圓斑星鰈不同發(fā)育時期的胚胎, 包括單細(xì)胞期(卵裂前胚盤隆起時期)(0h)、2細(xì)胞期(4h)、8細(xì)胞期(10h)、16細(xì)胞期(12h)、32細(xì)胞期(13h)、桑椹期(18h)、高囊胚期(20h)、低囊胚期(26h)、原腸早期(27h)、原腸中期(29h)、原腸晚期(77h)、神經(jīng)胚期(98h)、晶體形成期(136h)、心跳出現(xiàn)期(163h)、孵化前期(188h)、脫膜孵化期(197h), 不同時期的仔稚魚(孵化后5d, 10d, 20d, 30d, 45d, 58d, 68d, 78d, 92d)及雌雄成魚[體長(24.0±0.5)cm, 體重(330±20)g]的不同組織(腦、眼、鰓、心、肝、腸、脾、性腺、腎及肌肉), 將采集的樣品用液氮充分研磨, 根據(jù)Trizol(TaKaRa)實際說明書提取各組織的總RNA, 經(jīng)Thermo紫外分光光度計(NanoDrop 2000)和1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測, 將高質(zhì)量的RNA用SMARTTMRACE cDNA Amplification RACE (TaKaRa)試劑盒分別合成3’RACE和5’RACE cDNA。之后根據(jù)本實驗室構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫獲得和基因的EST序列, 利用Primer Primer 5.0軟件設(shè)計和基因的3′RACE和5′RACE特異性引物(表1), 以圓斑星鰈成魚性腺組織cDNA為模板分別進(jìn)行擴(kuò)增, PCR反應(yīng)體系(20μL)為: Premix TaqTM(LA TaqTMVersion 2.0) 10μL、3’或5’特異性引物0.8μL、UPM(或NUP) 0.8μL、RACE-cDNA 1μL及ddH2O 6.4μL。PCR反應(yīng)條件為: 94°C 5min；94°C 30s, 3’或5’特異性引物溫度30s, 72°C 1min, 35個循環(huán)；72°C 10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測, 并在紫外線下切膠, 并用SanPrep柱氏DNA凝膠回收試劑盒回收, 利用PMD18-T Vector試劑盒(TaKaRa)進(jìn)行連接(PMD18-T Vector 1μL, Solution I 5μL及純化產(chǎn)物4μL), 16°C反應(yīng)3h。之后將連接液加入融化好的DH5α (Code No 9057, TaKaRa)中培養(yǎng), 挑取陽性單克隆, 經(jīng)菌落PCR鑒定后, 篩選目的菌液送至華大基因進(jìn)行測序。

1.2 wt1基因序列分析

使用ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ projects/gorf/orfig.cgi), ExPASy (https://web.expasy. org/compute_pi/), SMART (http://smart.emblheidelberg. de/), Signal4.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/ wrpsb.cgi)在線生物學(xué)軟件分析基因的開放閱讀框、分子量、理論等電點、信號肽及跨膜結(jié)構(gòu)域。并用DNAMAN (Zemann,2006)和MEGA5.2 (Tamura,2011)軟件, 進(jìn)行多重序列比對及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3 wt1基因的表達(dá)特征分析

根據(jù)已獲得的基因全長序列, 設(shè)計熒光定量特異性引物,-actin作為內(nèi)參基因(表1)。使用Applied BiosystemsTM7500 Real Time PCR instrument定量儀檢測, 反應(yīng)程序: 95°C 10min；95°C 30s, 95°C 5s, 60°C 34s, 40個循環(huán)；95°C 15s；60°C 1min；95°C 15s。采用2–DDCT的計算方法分析相對表達(dá)量, 通過SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素分析, 利用OriginPro 2017作圖,<0.05代表具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 圓斑星鰈wt1基因全長和序列分析

通過擴(kuò)增獲得基因全長為3263bp, 經(jīng)預(yù)測開放閱讀框(ORF)長為1245bp, 編碼415個氨基酸, 5’-UTR和3’-UTR分別長372bp和1640bp。經(jīng)過生物學(xué)分析, 推斷的415個氨基酸分子量為46.2kDa, 理論等電點為9.24, 無跨膜結(jié)構(gòu)及信號肽, ORF末端有4個鋅指結(jié)構(gòu), 編碼KTS三肽(圖1)?；蛉L為2312bp, ORF長1281bp, 編碼427個氨基酸, 5’-UTR和3’-UTR分別長369bp和659bp。的415個氨基酸分子量為46.95kDa, 理論等電點為8.99, 無跨膜結(jié)構(gòu)及信號肽, ORF末端有4個鋅指結(jié)構(gòu), 編碼KTS三肽(圖2)。

表1 本研究中所使用的引物

Tab.1 Nucleotide sequences of the PCR primers used in this study

2.2 wt1基因同源性和系統(tǒng)發(fā)育分析

圖1 wt1a基因cDNA序列全長及其編碼的氨基酸序列

注: 起始密碼子(ATG)與終止密碼子(TGA)用單線邊框標(biāo)出, KTS是選擇性剪接, 鋅指結(jié)構(gòu)區(qū)用單下劃線標(biāo)出, polyA結(jié)尾用雙下劃線標(biāo)出

圖2 wt1b基因cDNA序列全長及其編碼的氨基酸序列

注: 起始密碼子ATG與終止密碼子TGA用單線邊框標(biāo)出, KTS是選擇性剪接, 鋅指結(jié)構(gòu)區(qū)用單下劃線標(biāo)出, polyA結(jié)尾用雙下劃線標(biāo)出

2.3 Wt1基因在不同發(fā)育時期及不同組織中的表達(dá)分析

胚胎發(fā)育期研究結(jié)果顯示(圖6),基因在原腸期之前微弱表達(dá), 從原腸早期開始逐漸上升至神經(jīng)胚期表達(dá)量達(dá)到最高, 之后開始呈下降趨勢, 直至孵化階段；基因從原腸晚期開始表達(dá)量逐漸升高, 上升至神經(jīng)胚期后開始下降, 并逐漸穩(wěn)定。研究基因和基因在仔稚魚不同發(fā)育時期中的表達(dá)量, 結(jié)果顯示(圖7)基因在孵后10d時的表達(dá)量顯著高于本實驗中的其他時期,基因在孵后5d時的表達(dá)量顯著高于本實驗中的其他時期, 之后逐漸下降。

圖3 wt1a基因編碼氨基酸與其他物種wt1a基因編碼氨基酸的多序列比對

注: 黑色邊框為鋅指結(jié)構(gòu)區(qū), 紅色邊框為KTS。各物種WT1a蛋白序列登錄號: 尼羅羅非魚(XP_013121197.1)、點帶石斑魚(AFV66805.1)、大黃魚(XP_027128155.1)、黃尾鰤(XP_023262779.1)、黃鱔(XP_020460125.1)、斑馬魚(NP_571121.1)和青鳉(NP_001098171.1)

圖4 wt1b基因編碼氨基酸與其他物種wt1b基因編碼氨基酸的多序列比對

注: 黑色邊框為鋅指結(jié)構(gòu)區(qū), 紅色邊框為KTS。各物種WT1b蛋白序列登錄號: 牙鲆(XP_019954195.1)、大菱鲆(AWP01692.1)、尼羅羅非魚(ARU81315.1)、黃鱔(XP_020471329.1)、大黃魚(XP_010740189.1)、點帶石斑魚(AFV66806.1)、攀鱸(XP_026234955.1)、紅鰭東方鲀(XP_011617397.1)和青鳉(NP_001098390.1)

圖5 wt1基因編碼氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖6 wt1 基因在胚胎發(fā)育不同階段中的表達(dá)

注: 1: 單細(xì)胞期; 2: 2細(xì)胞期; 8: 8細(xì)胞期; 16: 16細(xì)胞期; 32: 32細(xì)胞期; M: 桑椹胚期; Hb: 高囊胚期; Lb: 低囊胚期; Eg: 原腸早期; Mg: 原腸中期; Lg: 原腸晚期; N: 神經(jīng)胚期; El: 晶體形成期; Hp: 心跳出現(xiàn)期; Bh: 孵化前期; H: 脫膜孵化。不同字母間表示差異顯著(<0.05), 下同

組織表達(dá)結(jié)果顯示(圖8)基因和基因在雌雄成魚的各個組織中均有表達(dá)?；蚝突蛟谛坌猿婶~精巢組織的表達(dá)量最高, 其次是雌性成魚的卵巢組織, 腎組織中也有較高表達(dá), 3個組織的表達(dá)量均顯著高于其他組織。

3 討論

本研究用RACE方法獲得了圓斑星鰈和基因全長, 分別命名為基因和基因。兩個同源基因在ORF末端均具有連續(xù)四個(Cys)2(His)2型鋅指結(jié)構(gòu), 編碼KTS三肽。同源性分析發(fā)現(xiàn)基因和基因編碼氨基酸在羧基端鋅指結(jié)構(gòu)區(qū)域均具有很高的相似性?；蛳到y(tǒng)分析結(jié)果顯示, 哺乳類、鳥類及爬行類聚為一大支, 魚類的WT1a及WT1b分別為一大支, 其中圓斑星鰈WT1b與大菱鲆WT1b聚為一支, 關(guān)系較近。此外, 相較于WT1b, 魚類WT1a與哺乳類等的WT1關(guān)系較近, 該結(jié)果與半滑舌鰨(張紅等, 2014)相似。研究發(fā)現(xiàn)基因可通過鋅指結(jié)構(gòu)與DNA、RNA 結(jié)合, 從而正常行使其功能(Morrison,2008)。此外由于基因具有多個翻譯起始位點及不同的選擇性剪接方式, 可編碼多種蛋白亞型(Dong, 2015), 其中較為常見的+KTS亞型蛋白主要在RNA加工過程中起重要作用, 并在小鼠的性別決定中起重要作用(Hammes, 2001)。綜上, 我們推測基因和基因在圓斑星鰈性腺發(fā)育中具有重要作用。

圖7 wt1基因在不同發(fā)育時期仔魚中的表達(dá)

圖8 wt1基因在不同組織中的表達(dá)

注: Br: 腦; Ey: 眼; Gi: 鰓; He: 心臟; Li: 肝臟; In: 腸; Sp: 脾; Go: 性腺; Ki: 腎; Mu: 肌肉

在哺乳動物中,基因的突變會導(dǎo)致其性腺及腎臟等器官發(fā)育異常。如小鼠中缺失基因后, 其腎單位將無法形成, 導(dǎo)致間充質(zhì)細(xì)胞無法正常增殖(Davies, 2004)。性腺分化過程中, 僅在小鼠精巢的支持細(xì)胞及卵巢的顆粒細(xì)胞中表達(dá)的基因可以促進(jìn)生殖細(xì)胞的成熟, 小鼠基因缺失后, 精原細(xì)胞的分裂過程將被中斷(Zheng, 2013),

基因在原腸期前表達(dá)低, 從原腸早期開始逐漸上升至神經(jīng)胚期表達(dá)量達(dá)到最高, 之后逐漸下降, 該結(jié)果與斑馬魚(Bollig, 2006)、半滑舌鰨(張紅等, 2014)及牙鲆(孫近近, 2016)的表達(dá)模式相似。研究發(fā)現(xiàn), 神經(jīng)胚期是原始生殖細(xì)胞分化的關(guān)鍵時期(康現(xiàn)江等, 2010), 因此推測基因在圓斑星鰈原始生殖細(xì)胞分化過程中發(fā)揮作用。基因從原腸晚期開始表達(dá)量逐漸升高, 至神經(jīng)胚期后下降, 并逐漸穩(wěn)定, Bollig等(2006)研究發(fā)現(xiàn)在斑馬魚胚胎時期檢測到基因在12h(原腸期之后)時的表達(dá)量顯著增加, 同時原位雜交結(jié)果顯示基因在間介中胚層(原腸胚末期)表達(dá), 而間介中胚層將分化為泌尿生殖系統(tǒng)的主要器官, 因此推測基因在性腺分化形成中發(fā)揮作用。作為同源性基因,和基因在圓斑星鰈胚胎發(fā)育過程中的神經(jīng)胚期表達(dá)量均達(dá)到最高, 表明和基因均在圓斑星鰈原始生殖細(xì)胞分化過程中發(fā)揮作用,基因在圓斑星鰈胚胎發(fā)育中表達(dá)量顯著上升時間較早, 因此推測基因在圓斑星鰈胚胎發(fā)育中較早地發(fā)揮作用, 仍需進(jìn)一步驗證。

基因在孵后10d時的表達(dá)量顯著高于其他時期, 這一表達(dá)模式與牙鲆相似, 在牙鲆中基因?qū)ζ渖臣辜?xì)胞的存活起著重要作用(孫近近, 2016), 因而基因可能在圓斑星鰈性腺的發(fā)育過程中起作用；基因在孵后5d時的表達(dá)量顯著高于其他時期, 之后逐漸下降, 其表達(dá)量顯著升高的時間早于基因, 推測在仔稚魚發(fā)育過程中基因更早地發(fā)揮作用, 但因相關(guān)研究較少, 其在圓斑星鰈性腺發(fā)育中的作用仍需進(jìn)一步研究。

基因和基因在精巢與卵巢中的表達(dá)量均顯著高于其他組織, 且精巢的表達(dá)量顯著高于卵巢, 其次在腎臟組織中的表達(dá)量顯著高于其他組織。在斑馬魚(Bollig, 2006)和青鳉(Klüver,2009)中,基因在性腺及腎臟中均具有較高表達(dá), 且在青鳉中發(fā)現(xiàn)基因的突變會導(dǎo)致原始生殖細(xì)胞數(shù)量減少。在半滑舌鰨(張紅等, 2014)中,基因在性腺及腎臟中也有較高表達(dá), 且該研究顯示基因在性腺分化及發(fā)育過程中持續(xù)表達(dá)。在牙鲆(孫近近, 2016)中,基因主要在性腺中表達(dá), 同樣在精巢中的表達(dá)量高于卵巢, 表明基因在性腺發(fā)育及功能維持方面起重要作用。在黃鱔(胡青等, 2014)中,基因在性腺及腎臟中高表達(dá), 且該基因?qū)S鱔精母細(xì)胞及卵母細(xì)胞的生長及成熟起一定的作用。綜上, 我們推測基因和基因在性腺和腎臟發(fā)育過程及功能維持方面發(fā)揮重要作用。

4 結(jié)論

本研究用RACE方法獲得了圓斑星鰈和基因全長, 分別命名為基因和基因, 其均具有4個鋅指結(jié)構(gòu), 編碼 KTS三肽?；虮磉_(dá)結(jié)果表明:和基因主要在圓斑星鰈性腺中表達(dá), 精巢的表達(dá)高于卵巢, 腎臟的表達(dá)量顯著高于其他組織, 推測基因和基因在性腺和腎臟發(fā)育過程及功能方面均發(fā)揮重要作用；在早期發(fā)育階段,基因在圓斑星鰈原始生殖細(xì)胞分化過程及性腺發(fā)育中發(fā)揮重要作用。基因在性腺分化過程的發(fā)揮作用仍需進(jìn)一步研究。

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CLONING AND EXPRESSION OF THEGENE IN SPOTTED HALIBUT ()

YANG Zhen-Zhen1, 2, BIAN Li1, 3, ZHANG Yan1, CHEN Si-Qing1, 3, CHANG Qing1, ZHANG Sheng-Nong1, LIU Chang-Lin1, GE Jian-Long1

(1. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China; 2. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 3. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266071, China)

The spotted halibut () is a rare and valuable marine fish species that inhabits the coast of the northern China. Mature females are much larger than males because of their faster growth. It will create substantial economic benefits to establish an all-female breeding technique for. A better understanding of sex-related genes will contribute to the improvement of a single-sex breeding technique. In this study, we successfully isolated thegene of, which is namedand. The total length ofwas3263bp, including a 1245bp open reading frame (ORF), encoding 415 amino acids, the 5′UTR was 372bp and the 3′UTR was 1640bp. The total length ofwas 2312bp, including a 1281bp open reading frame (ORF), encoding 427 amino acids, the 5′UTR was 369bp and the 3′UTR was 659bp. Through biological analysis, thegene encoded amino acids, with a predicted molecular weight of 46.2kDa and an isoelectric point of 9.24, no transmembrane structure or signal peptide site was detected, there were four zinc finger structures at the end of ORF and encode KTS. Thegene encoded amino acids, with a predicted molecular weight of 46.95kDa and an isoelectric point of 8.99, no transmembrane structure or signal peptide site was detected, there were four zinc finger structures at the end of ORF and encode KTS. Real-time fluorescence quantitative PCR technique was used to analyze the expression patterns of thegene at different stages of embryo and larvae. The results show that the expression level ofandgenes in gonads was significantly higher than other tissues’, and the expression level in the testis was significantly higher than in the ovary. Therefore, we speculated thatandgenes play important roles in gonad and kidney development and function. In the early stage of development,gene weakly expressed before the early gastrula, then the expression level gradually rose to the highest level in the neural embryo stage, followed by a decline until the hatching stage. It is speculated thatgene might played a role in the differentiation process of primitive germ cells and gonad development.

;; gene cloning; expression analysis

*中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所基本科研業(yè)務(wù)費項目, 20603022016005號。楊珍珍, 碩士研究生, E-mail: 1163603557@qq.com

陳四清, 博士生導(dǎo)師, 研究員, E-mail: chensq@ysfri.ac.cn

2020-03-04,

2020-06-08

S917.4

10.11693/hyhz20200300055