SH2B3 基因單核苷酸多態(tài)性與自身免疫性肝病相關(guān)性分析

湯斌斌 余 光 王宏剛 莫霏霏 王國祥

自身免疫性肝病是一組病因不明，與自身免疫異常有關(guān)的肝組織損傷、肝功能異常疾病[1]。根據(jù)其臨床表現(xiàn)、免疫學(xué)、生化、組織病理學(xué)特點(diǎn)，主要分為自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）、原發(fā)性膽汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis，PBC）、原發(fā)性硬化性膽管炎等，其中較常見的兩種自身免疫性肝病為PBC 和AIH[2]。自身免疫性肝病無特異性臨床病癥，確診時(shí)間晚，危害嚴(yán)重，目前缺乏明確的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。SH2B 銜接蛋白3（SH2B3）屬于SH2B 銜接蛋白家族中的成員，是一種細(xì)胞內(nèi)銜接蛋白，在多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中作為負(fù)調(diào)節(jié)物而發(fā)揮作用，包括炎癥信號通路[4-5]。Zhou 等[6]研究表明，人類染色體12q24 位點(diǎn)以SH2B3 和ATXN2 基因?yàn)楹诵?，與1 型糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化等自身免疫疾病有關(guān)。本研究通過對SH2B3 基因中Rs3184504 的單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行探究，進(jìn)而探討SH2B3 基因單核苷酸多態(tài)性與自身免疫性肝病的關(guān)聯(lián)性，以期為自身免疫性肝病患者提供潛在的基因診斷標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013 年7 月—2020 年1 月于浙江省臺(tái)州市立醫(yī)院就診的自身免疫性肝病患者162 例為研究對象，其中PBC 患者84 例（PBC 組），年齡34～67 歲；AIH 患者78 例（AIH 組），年齡33～68歲；同期選取健康體檢者72 名為對照組，年齡33～67歲。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過，符合《赫爾辛基宣言》倫理原則；所有受試對象均由專業(yè)人員詳細(xì)告知研究內(nèi)容并自愿參加，同時(shí)簽署知情同意書。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) （1）PBC 和AIH 診斷參照《自身免疫性肝病診斷和治療指南》[7]中的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)；（2）不伴有肝癌或其他惡性腫瘤者；（3）臨床資料保存完整者；（4）研究對象均為漢族人群，年齡≥18 歲，性別不限。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) （1）伴有嚴(yán)重心血管疾病、腎臟疾病等嚴(yán)重疾病者；（2）伴有急慢性感染性疾病及各種免疫系統(tǒng)疾病者；（3）妊娠期或哺乳期婦女。

1.4 主要試劑與儀器 血液基因組DNA 提取試劑盒（批號DK604）購自上海萊楓生物科技有限公司；PCR buffer Set（PCR buffer 及MgCl2 稀釋液，批號11160010-1）購自蘇州瑞諾德生物科技有限公司；白細(xì)胞介素-12（interleukin-12，IL-12）酶聯(lián)免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（批號SEKH-0020）購自北京索萊寶科技有限公司；白細(xì)胞介素-17（interleukin-17，IL-17）ELISA 試劑盒（批號orb405970）購自武漢博歐特生物科技有限公司。PUZS-300 型自動(dòng)生化分析儀購自上海帝博思生物科技有限公司

1.5 研究方法

1.5.1 血清學(xué)指標(biāo)測定 抽取三組受試者清晨空腹外周靜脈血樣，置于-80℃保存。ELISA 法檢測血清IL-12、IL-17 表達(dá)水平；常規(guī)自動(dòng)生化分析儀測定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanineaminotrarsferase，ALT）和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-Glutamyltranspeptidase，GGT）水平。操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒及儀器使用說明書進(jìn)行。

1.5.2 SH2B3 基因單核苷酸多態(tài)性檢測 參照試劑盒說明書提取外周血DNA，核酸定量儀測定A260/A280，計(jì)算DNA 純度和濃度，并將濃度稀釋到50ng/μL，-20℃保存。引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR 引物序列（見表1）。反應(yīng)體系共25μL：10×PCR Buffer 2.5μL，MgCl21.5μL，上下游引物各0.5μL，dNTP 2.0μL，模 板DNA 2.0μL，Taq DNA polymerase 0.2μL，ddH2O 15.8μL。反應(yīng)條件：95℃5min；94℃1min，55℃1min，72℃1min，40 個(gè)循環(huán)。瓊脂糖凝膠電泳后采用凝膠成像儀分析，將單一明亮條帶的PCR 產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司純化并測序，BLAST 進(jìn)行測序結(jié)果比對。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較行t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以[例/百分比（%）]表示，行χ2檢驗(yàn)；Logistic 回歸分析影響PBC、AIH 發(fā)生的因素。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組一般資料比較 三組研究對象年齡、性別、病程、體質(zhì)指數(shù)（BMI）、吸煙比例、飲酒比例比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

2.2 Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗(yàn) 結(jié)果顯示，SH2B3 在rs3184504 的多態(tài)位點(diǎn)上有三種基因型，分別為CC 型、CT 型、TT 型。對照組基因型中CC 型最多，其次為CT 型，TT 型最少；PBC 組基因型中CT 型最多，其次為CC 型，TT 型最少；AIH 組基因型中CC型最多，其次為CT 型，TT 型最少；PBC 組、AIH 組中CT、TT 兩種基因型占比明顯較對照組升高（P＜0.05）。根據(jù)Hardy-Weinberg 平衡定律，對照組、PBC組及AIH 組各基因型的期望值和觀測值符合Hardy-Weinberg 平衡定律（P 均＞0.05），提示群體來自同一孟德爾群體，所選樣本進(jìn)行群體遺傳學(xué)研究具有代表性。見表3。

2.3 PBC、AIH 患者各基因型血清學(xué)指標(biāo)比較 PBC、AIH 患者各基因型ALT、GGT、IL-12、IL-17 水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

2.4 影響PBC、AIH 發(fā)生的多因素分析 將PBC、AIH 是否發(fā)生作為因變量，校正年齡、性別、BMI、吸煙比例、飲酒比例、ALT、GGT、IL-12、IL-17 等混雜因素后，以SH2B3 三種基因型（CC 型、CT 型、TT 型）為自變量進(jìn)行Logistic 回歸分析，結(jié)果顯示CT 型、TT型基因型是影響PBC 發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05），TT 型基因型是影響AIH 發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。見表5-6。

3 討論

目前較為常見的自身免疫性肝病為PBC 和AIH[8]，PBC 是一種非化膿性、慢性膽管炎，血清生化異常以ALT 和GGT 升高最為常見[9-10]。AIH 無特異性臨床癥狀和體征，AIH 常見的生化異常是血清ALT 和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶水平升高[11-12]。研究表明，基因多態(tài)性與自身免疫性肝病易感性相關(guān)[13]。

SH2B3 基因是銜接蛋白SH2B 家族的一個(gè)成員，參與多種信號事件的整合和調(diào)控[14]。SH2B3 參與細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)途徑，是T 細(xì)胞受體信號傳導(dǎo)的負(fù)性介質(zhì)[15]。SH2B3 在內(nèi)皮細(xì)胞中作為負(fù)調(diào)節(jié)因子抑制腫瘤壞死因子信號，進(jìn)而降低促炎性反應(yīng)，SH2B3 在動(dòng)脈粥樣硬化和血壓調(diào)節(jié)等過程中也發(fā)揮重要作用[16-17]。Umemura 等[18]對158 例AIH 患者的SH2B3 基因型進(jìn)行分析探究，證明SH2B3 中的rs3184504 的錯(cuò)義突變與AIH 有關(guān)。本研究中對照組基因型中CC 型（占84.72%）最多，其次為CT 型（占13.89%），TT 型（占1.39%）最少；PBC 組基因型中CT型（占46.43%）最多，其次為CC 型（占41.67%），TT型（占11.90%）最少；AIH 組基因型中CC 型（占50.00%）最多，其次為CT 型（占35.90%），TT 型（占14.10%）最少，PBC 組、AIH 組中CT、TT 兩種基因型占比明顯較對照組升高（P＜0.05）。提示CT、TT 基因型攜帶者比CC 基因型攜帶者的患病風(fēng)險(xiǎn)可能更高，分析Rs3184504 位點(diǎn)T 等位基因可能是自身免疫性肝病易感基因。唐瑩瑩[19]研究表明，除血清ALT 和GGT 外，IL-17 也參與了自身免疫性肝病的發(fā)生、發(fā)展，可引起肝臟免疫炎癥反應(yīng)。本研究中各基因型患者ALT、GGT、IL-12、IL-17 表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。認(rèn)為PBC 組、AIH 組患者體內(nèi)SH2B3 基因型表達(dá)異?？赡苡绊懟颊唧w內(nèi)免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，即T 細(xì)胞與Th17 細(xì)胞之間的平衡，而由Th17細(xì)胞分泌產(chǎn)生的IL-17 等炎癥因子表達(dá)水平的異常，可能成為自身免疫性肝病發(fā)生的主要免疫因素。Logistic 回歸分析結(jié)果顯示，CT 型、TT 型基因型是影響PBC 發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05），TT 型基因型是影響AIH 發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。提示攜帶CT 型發(fā)生PBC 可能性較高，攜帶TT 型發(fā)生PBC、AIH 可能性均較高，攜帶SH2B3 基因rs3184504 T 等位基因者更容易罹患自身免疫性肝病。

表1 qRT-PCR 引物序列

表2 三組研究對象一般資料比較

表3 Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗(yàn)結(jié)果[例（%）]

表4 PBC、AIH 患者各基因型血清學(xué)指標(biāo)比較（）

表4 PBC、AIH 患者各基因型血清學(xué)指標(biāo)比較（）

注：PBC 組為原發(fā)性膽汁性肝硬化患者；AIH 組為自身免疫性肝炎患者；ALT 為丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；GGT 為γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶；IL-12 為白細(xì)胞介素-12；IL-17 為白細(xì)胞介素-17；與CC 組比較，aP＜0.05；與CT 組比較，bP＜0.05

表5 影響PBC 發(fā)生的多因素分析

表6 影響AIH 發(fā)生的多因素分析

綜上所述，SH2B3 單核苷酸多態(tài)性與自身免疫性肝病有一定相關(guān)性，其中CT 型、TT 型基因型可能與PBC 發(fā)生有關(guān)，TT 型基因型可能與AIH 發(fā)生有關(guān)，臨床上可通過檢測SH2B3 基因型，對自身免疫性肝病做出初步預(yù)測，以便盡早干預(yù)和控制，對預(yù)防自身免疫性肝病的發(fā)生可能具有重要價(jià)值，同時(shí)為臨床治療PBC、AIH 開辟新思路和視野，但具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。