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    松弛素對馬兜鈴酸誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞MMP-9/TIMP-1 表達(dá)的影響

    2020-11-24 11:49:12錢盈盈謝祥成錢紅萍
    浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志 2020年11期
    關(guān)鍵詞:馬兜鈴胞外基質(zhì)腎小管

    錢盈盈 楊 秀 謝祥成 錢紅萍 章 煒

    馬兜鈴酸腎病(aristolochic acid nephropathy,AAN)是攝入含有馬兜鈴酸類成分中草藥(如關(guān)木通、廣防己、青木香等)導(dǎo)致的腎小管間質(zhì)疾病,曾被稱為中草藥腎病[1]。馬兜鈴酸(AA-I)是中草藥腎病和巴爾干地區(qū)特有腎病的主要致病原因[2-3],迄今為止,其治療策略仍然有限[4]。松弛素(relaxin,RLX)是松弛素/胰島素肽激素家族成員,具有較強(qiáng)的抗纖維化作用[5],本實(shí)驗(yàn)擬通過觀察RLX 對AA-I 刺激的腎小管上皮細(xì)胞(HK-2 細(xì)胞)表達(dá)細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinases-9,MMP-9)和金屬蛋白酶組織抑制因子1 (tissue inhibitor metallopro-teinase-1,TIMP-1)的影響,探討RLX 在AAN 中抗纖維化的作用機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 材 料 人腎小管近端上皮細(xì)胞系購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。重組人松弛素購自美國Peprotech(批號(hào)130-15);人纖連蛋白(fibronection,F(xiàn)N)ELISA 試劑盒購自武漢博士德(批號(hào)EK0349)、人Ⅳ型膠原(human collagen type Ⅳ,Col-Ⅳ)ELISA 試劑盒購自武漢Cusabio(批號(hào)CSB-E17116h);PVDF 膜購自美國Millipore 公司(批號(hào)ISEQ00010);抗體MMP-9/TIMP-1/ACTIN 購自中國Proteintech(批號(hào)分別為27306-1-AP,16644-1-AP,60008-1-Ig);AA-I 購自美國sigma(批號(hào)313-67-7)。

    1.2 方 法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、刺激、分組 HK-2 細(xì)胞于DMEM/F12(Gibco,美國,批號(hào)11320033)培養(yǎng)基中培養(yǎng),添加10%胎牛血清,37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。根據(jù)刺激方法不同隨機(jī)分為:對照組(無干預(yù))、AA-I 組(10μg/mL AA-I 刺激48h)、RLX 組(RLX 10ng/mL 干預(yù)48h)、RLX+AA-I 組(RLX 10ng/mL 干預(yù)48h 后再加AA-I 10μg/mL 刺激48h)。刺激條件參考文獻(xiàn)[6-7]。

    1.2.2 ELISA 法檢測HK-2 細(xì)胞外基質(zhì)分泌情況取對照組、AA-I 組、RLX+AA-I 組HK-2 細(xì)胞上清液,依照試劑盒說明測定Col-Ⅳ、FN 濃度。每份標(biāo)本均設(shè)3 個(gè)復(fù)孔,酶標(biāo)儀在450nm 處測吸光值,以其均值代表實(shí)驗(yàn)數(shù)值。

    1.2.3 蛋白質(zhì)印跡分析 對照組、AA-I 組、RLX 組、RLX+AA-I 組HK-2 細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化并離心后,以RIPA 裂解緩沖液裂解細(xì)胞。經(jīng)煮沸變性、8% w/v SDS-PAGE 凝膠中電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜,在室溫下用5%脫脂牛奶封閉1h。膜在TBS-T 中洗滌三次,然后與抗MMP-9、TIMP-1、ACTIN 抗體在4℃下孵育過夜。洗滌3 次,與辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗常溫下孵育2h。再次以TBST 清洗膜后用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測試劑盒檢測。灰度值強(qiáng)度由TINA 圖像軟件(Raytest,德國)測定。

    1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差() 表示,兩組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn),P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 各組細(xì)胞外基質(zhì)FN、Col-Ⅳ水平比較 與對照組比較,AA-I 組FN、Col-Ⅳ水平顯著升高(P<0.05),RLX+AA-I 組FN、Col-Ⅳ水平明顯低于AA-I 組(P<0.05),見表1。

    表1 各組細(xì)胞外基質(zhì)FN、Col-Ⅳ水平比較(ng/mL,)

    表1 各組細(xì)胞外基質(zhì)FN、Col-Ⅳ水平比較(ng/mL,)

    注:對照組無任何刺激;AA-I 組予10μg/mL AA-I 刺激48h;RLX+AA-I 組:RLX 10ng/mL 干預(yù)48h 后再加AA-I 10μg/mL 刺激48h;FN為纖連蛋白;Col-Ⅳ為Ⅳ型膠原蛋白;AA-I 為馬兜鈴酸;RLX 為松弛素;與對照組比較,aP<0.05;與AA-I 組比較,bP<0.05

    2.2 各組MMP-9、TIMP-1 蛋白表達(dá)比較 與對照組比較,AA-I 組MMP-9 表達(dá)降低,TIMP-1 表達(dá)顯著升高(P<0.05);與AA-I 組比較,RLX+AA-I 組MMP-9 蛋白表達(dá)顯著升高,TIMP-1 蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05)。見圖1、表2。

    3 討論

    圖1 蛋白質(zhì)印跡分析HK-2 細(xì)胞MMP-9、TIMP-1 蛋白表達(dá)

    表2 各組MMP-9、TIMP-1 蛋白表達(dá)比較()

    表2 各組MMP-9、TIMP-1 蛋白表達(dá)比較()

    注:對照組無任何刺激;AA-I 組予10μg/mL AA-I 刺激48h;RLX+AA-I 組予RLX 10ng/mL 干預(yù)48h 后再加AA-I 10μg/mL 刺激48h;MMP-9 為細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶9;TIMP-1 為金屬蛋白酶組織抑制因子1;AA-I 為馬兜鈴酸;RLX 為松弛素;與對照組比較,aP<0.05;與AA-I 組比較,bP<0.05

    AAN 的主要病理特征是廣泛的小管間質(zhì)纖維化,伴有近端小管萎縮和喪失,偶有少量散在或小灶狀淋巴及單核細(xì)胞浸潤,腎小球無明顯病變或呈缺血性基底膜皺縮及硬化[8]。HK-2 細(xì)胞有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體選擇性攝取AA-I,因此,近端管狀上皮細(xì)胞是AA-I 的易損傷部位[9]。AA-I 反復(fù)作用于腎小管上皮細(xì)胞,可誘導(dǎo)釋放轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor beta,TGF-β)等促纖維因子表達(dá)上調(diào),導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化[10]。此外,AA-I 可誘導(dǎo)HK-2 細(xì)胞轉(zhuǎn)分化,轉(zhuǎn)分化后的HK-2 細(xì)胞直接分泌細(xì)胞外基質(zhì),促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化,細(xì)胞外基質(zhì)的增加在AA-I 的進(jìn)程中起到非常重要的作用[11]。本研究顯示,AA-I 可顯著增加HK-2 細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)FN 和Col-Ⅳ水平(P<0.05)。

    細(xì)胞外基質(zhì)的過度蓄積是腎間質(zhì)纖維化的主要病理基礎(chǔ),MMP-9 及TIMP-1 在細(xì)胞外基質(zhì)的降解與重塑過程中發(fā)揮了重要作用[12]。細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是一類鋅依賴肽鏈內(nèi)切酶系,幾乎能降解全部細(xì)胞外基質(zhì)成分[12]。TIMP-1 能特異性地抑制MMPs 的活性,通過不可逆結(jié)合抑制MMP-9 活性,從而抑制其對細(xì)胞外基質(zhì)的降解,兩者的平衡共同維持著細(xì)胞外基質(zhì)和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[13]。MMP-9 酶活性受到抑制可導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積,從而導(dǎo)致腎纖維化[12]。本研究顯示,HK-2 細(xì)胞經(jīng)AA-I 處理后伴隨著細(xì)胞外基質(zhì)水平的升高,細(xì)胞表達(dá)MMP-9 蛋白減少(P<0.05),表達(dá)TIMP-1 蛋白增多(P<0.05),提示MMP-9/TIMP-1 蛋白的失衡可能參與HK-2 細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)。

    RLX 與胰島素結(jié)構(gòu)相似,通過與RLX 家族肽受體(RXFP1、RXFP2、RXFP3、RXFP4)受體結(jié)合,可以發(fā)揮多種生物效應(yīng);RLX 因其在妊娠期間發(fā)揮多種生理效應(yīng)包括子宮收縮、誘導(dǎo)宮頸生長和變軟、結(jié)締組織重構(gòu)等為分娩做準(zhǔn)備而被廣泛認(rèn)識(shí)[14]。近年來,隨著對RLX 的廣泛深入研究,其在非生殖領(lǐng)域中的作用引起研究者們的極大興趣。RLX 的主要代謝作用在于其可以通過抑制膠原合成、激活MMPs、抑制TIMPs 導(dǎo)致結(jié)締組織重塑,并被證明是有效的抗纖維化藥物[15-18]。本研究發(fā)現(xiàn),RLX 可以誘導(dǎo)HK-2 細(xì)胞MMP-9 表達(dá)升高,抑制TIMP-1 的表達(dá),并逆轉(zhuǎn)AA-I 誘導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)異常積累(P<0.05),認(rèn)為RLX 可能通過調(diào)節(jié)MMP-9/TIMP-1 的平衡狀態(tài)改善AA-I 所致腎臟纖維化。

    綜上所述,本實(shí)驗(yàn)研究顯示,RLX 可上調(diào)MMP-9 蛋白表達(dá)和下調(diào)TIMP-1 蛋白表達(dá),減少細(xì)胞外基質(zhì)的沉積,從而抑制腎小管間質(zhì)纖維化,可能對AAN起到保護(hù)作用。

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