溫陽消癥方對單側輸尿管梗阻小鼠腎組織Ⅰ型與Ⅲ型膠原表達的影響

林曉蒙 余柯娜 蔡旭東

慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）是威脅全人類健康的慢性疾病之一，最新調查顯示：2017年全球CKD 患病率估計為9.1%，近五分之一的患者生活在中國（約1.32 億例）[1]。腎間質纖維化是CKD進展的病理基礎及最終結局，早期預防，即在腎臟纖維化開始形成的初期加以干預，可延緩CKD 進程，甚至避免患者進入終末期腎臟病。腎間質纖維化是多因素參與的復雜過程，其直接原因即是細胞外基質（extracellular matrix，ECM）合成與降解失衡，過度堆積的ECM 破壞了腎臟正常的功能結構，最終導致腎功能失代償[2]。Ⅰ型及Ⅲ型膠原（Col-Ⅰ、Col-Ⅲ）是ECM 的主要成分，可作為觀察RIF 程度和治療情況的指標[3]。腎間質纖維化目前治療手段有限，應用于臨床的主要是血管緊張素轉換酶抑制劑（ACEI）/血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑（ARB），作用有限，且存在一定的副作用，如高血鉀、影響腎小球濾過率等，中醫(yī)藥在腎纖維化治療方面有良好療效。溫陽消癥方是國家級名老中醫(yī)張沛虬老先生治療CKD 的經驗方，前期已證明在CKD 患者中辨證使用溫陽消癥方（文獻中溫陽化瘀方即溫陽消癥方），可改善血肌酐、腎小球濾過率、尿蛋白等指標及患者臨床癥狀[4]，同時我們發(fā)現(xiàn)該方可改善腎纖維化模型小鼠的腎功能及腎臟病理[5-6]，本研究擬通過觀察溫陽消癥方對單側輸尿管梗阻（UUO）模型小鼠Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白和mRNA 表達的影響，來探討該方能否減輕腎間質ECM 堆積，減輕腎間質纖維化。

1 實驗材料

1.1 動 物 SPF 級C57 小鼠32 只，6～8 周齡，雄性，體質量（18±2）g，由上海中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，實驗動物質量合格證號2008001658582，許可證號SCXK（滬）2013-0016。實驗期間分籠飼養(yǎng)，自由飲水，進食標準普通飼料，恒溫25℃，12h 照明，適應性飼養(yǎng)1 周后造模。動物相關處置均符合《中華人民共和國實驗動物管理條例》要求。本研究經所屬單位倫理委員會審核通過，審批號：SZY2017020041。

1.2 藥 物 溫陽消癥組（溫陽消癥方）：黃芪、黨參各30g，仙靈脾、肉蓯蓉各15g，桃仁12g，川芎15g，莪術30g，由上海曙光醫(yī)院中藥房提供。藥材加10 倍量水，浸泡2h，煎煮3 次，每次1h，合并水煎液，濃縮成含生藥4.9g/mL 水煎液備用。纈沙坦組（纈沙坦膠囊，商品名：代文），由北京諾華制藥有限公司提供，批號X2743，規(guī)格：80mg。

1.3 主要試劑及儀器 實時熒光定量多聚核苷酸鏈式反應（Rt-qPCR）：Universal Reverse Transcription Kit 逆轉錄試劑盒（LR-0103B，上海諾倫生物醫(yī)藥技術有限公司），ComSYBR qPCR Mix（with ROX）熒光定量試劑盒（LK-0107BB，上海諾倫生物醫(yī)藥技術有限公司），新鮮動物組織和細胞總RNA 抽提試劑盒（LN-0108B，上海諾倫生物醫(yī)藥技術有限公司），MX3000P 實時熒光定量PCR 儀（德國Agilent 公司）。蛋白免疫印跡法（Western blot）：SuPer-GL ECL超敏發(fā)光液、裂解液（上海諾倫生物醫(yī)藥技術有限公司），PVDF 轉移膜（美國MilliPore 公司），HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG 及HRP-conjugated goat anti-mouse IgG（美國Jakeson 公司），PowerPacTMHC電泳儀、Semi-Dry Transfer Cell、轉膜濾紙（美國biorad 公司），VE-180 垂直電泳槽（浙江天能公司），DY-B1 脫色搖床（上海青浦滬西儀器），KODAK XOmat BT Film 及X 光片顯影液、X 光片定影液（美國Kodak 公司）。

2 實驗方法

2.1 動物造模及分組 32 只小鼠按隨機數(shù)字表法分為假手術組、模型組、溫陽消癥組、纈沙坦組，每組8 只，建立UUO 模型[7]，方法如下：小鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉，在左側肋骨下方約1cm 處行縱向切口，長約0.8～1.0cm，逐層分離皮膚、皮下組織及肌層，暴露左腎及左側輸尿管，將左側輸尿管分離，予手術線進行雙重結扎，不剪斷，最后逐層縫合。假手術組開腹后不予結扎輸尿管，單純分離左側輸尿管后直接縫合。

2.2 給藥方法及取材 造模后溫陽消癥組以人鼠藥物劑量20 倍[8]換算后制成4.9g/mL 溫陽消癥方水煎劑，小鼠給藥劑量49g/kg；纈沙坦組以人鼠藥物劑量12.33 倍[9]換算后制成1.65mg/mL 水懸液，小鼠給藥劑量16.5mg/kg；假手術組及模型組予等容量生理鹽水每天0.2mL 灌胃，療程共2 周。治療2 周后處死各組小鼠，留取各組小鼠左側腎組織標本于液氮中速凍，后保存于-80℃冰箱，以待檢測。

2.3 指標檢測方法

2.3.1 Rt-qPCR 檢測小鼠腎組織Col-Ⅰ、Col-ⅢmRNA 表達 取出腎組織標本，用Trizol 法提取總RNA，后進行逆轉錄反應：PCR 試管加入總RNA 5μL、2×逆轉錄緩沖液10μL、逆轉錄引物（1μM）1.2μL、MMLV 逆轉錄酶（200U/μL）0.2μL，用DEPC水加至20μL，30℃30min；42℃30min；85℃10min。實時熒光定量PCR 反應：試管中加入2×定量PCR Master Mix 10μL、上游引物（20μM）0.08μL、下游引物（20μM）0.08μL、cDNA 模板2μL、Taq DNA 聚合酶（5U/μL）0.2μL，用dd H2O 加至20μL，95℃，3min 變性；95℃，12s；62℃，40s，40 個循環(huán)。讀取CT（cycle threshold）值，計算2-△△CT值對目的mRNA 相對定量分析。查詢Genbank 數(shù)據庫中公開發(fā)表的基因序列，并采用primer express 進行引物設計，由上海諾倫生物醫(yī)藥技術有限公司合成引物。Col-Ⅰ上游引物序列：5'-GCTCCTCTTAGGGGCCACT-3'，下 游：5'-CCACGTCTCACCATTGGGG-3'；Col-Ⅲ上游引物序列：5'-CCTGGCTCAAATGGCTCAC-3'，下 游：5'-CAGGACTGCCGTTATTCCCG-3'；Mus Actb 為內參，上游引物序列：5'-AAGATCAAGATCATTGCTCCTCC-3'，下游：5'-GACTCATCGTACTCCTGCTTGC-3'。

2.3.2 Western blot 檢測小鼠腎組織Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表達 每個腎組織樣本加入300μL 組織細胞裂解液，用槍混勻使其完全裂解，將裂解物移至新的離心管中。直接取10μL 樣本加入10μL 2×SDS-PAGE loading buffer，混勻，100℃加熱處理5min，冰上冷卻，12000g，14000r/min，離心15min 去除不溶性沉淀。樣品使用10% SDS-PAGE 分離，每孔上樣量為20μL。電泳結束后，將PVDF 膜在甲醇中浸泡1min，再使用Transfer Buffer 浸泡凝膠、濾紙和在甲醇中浸泡過的PVDF 膜一起4℃放置10min，然后制備轉移三明治。注：本實驗使用Semi-Dry Cell 進行半干電泳轉移，轉移條件為30mA 90min。使用Blocking Buffer 封閉轉印膜4℃封閉過夜，第二天用1×TBST洗滌3 次，每次15min。加入稀釋好的一抗，37℃溫育2h。用1×TBST 洗滌4 次，每次10min。加入稀釋好的二抗，37℃溫育2h。用1×TBST 洗滌4 次，每次10min。用SuPer-GL ECL 超敏發(fā)光液進行化學發(fā)光檢測，并對X 光片曝光。經顯影定影處理后，晾干的膠片最后用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照，本實驗采用Gel-Pro Analyzer 軟件進行分析處理。

2.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 22.0 軟件包進行統(tǒng)計分析，數(shù)據以均數(shù)±標準差（） 表示，兩組間比較采用獨立樣本t 檢驗，多組間差異性比較采用One-way ANOVA，組間兩兩比較采用LSD 法。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結果

3.1 Rt-qPCR 檢測腎組織Col-Ⅰ，Col-ⅢmRNA 表達 模型組Col-Ⅰ及Col-ⅢmRNA 表達均較假手術組顯著增強（P＜0.01），證明造模成功；比較模型組，纈沙坦組、溫陽消癥組Col-Ⅰ，Col-ⅢmRNA 表達均顯著下降（P＜0.01），溫陽消癥組Col-Ⅰ，Col-ⅢmRNA 表達下降程度較纈沙坦組更明顯（P＜0.01）。見表1。

表1 各組小鼠腎組織Col-Ⅰ、Col-ⅢmRNA 表達水平比較（2-△△CT，）

表1 各組小鼠腎組織Col-Ⅰ、Col-ⅢmRNA 表達水平比較（2-△△CT，）

注：假手術組和模型組給予0.2mL 生理鹽水灌胃；纈沙坦組給予纈沙坦水懸液灌胃（濃度4.9g/mL，給藥劑量16.5mg/kg）；溫陽消癥組給予溫陽消癥方水煎劑灌胃（濃度4.9g/mL，給藥劑量49g/kg）；與假手術組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01；與纈沙坦組比較，cP＜0.01

3.2 Western blot 檢測腎組織Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表達 與假手術組比較，模型組Col-Ⅰ及Col-Ⅲ蛋白表達均顯著增強（P＜0.01），證明造模成功；纈沙坦組、溫陽消癥組小鼠腎組織Col-Ⅰ，Col-Ⅲ蛋白表達較模型組顯著降低（P＜0.01），溫陽消癥組下降程度比纈沙坦組更明顯（P＜0.01）。見表2，圖1。

表2 各組小鼠腎組織Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表達水平比較（）

表2 各組小鼠腎組織Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表達水平比較（）

注：假手術組和模型組給予0.2mL 生理鹽水灌胃；纈沙坦組給予纈沙坦水懸液灌胃（濃度4.9g/mL，給藥劑量16.5mg/kg）；溫陽消癥組給予溫陽消癥方水煎劑灌胃（濃度4.9g/mL，給藥劑量49g/kg）；與假手術組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01；與纈沙坦組比較，cP＜0.01

圖1 Western bolt 檢測小鼠腎組織Col-Ⅰ及Col-Ⅲ蛋白表達

4 討論

細胞外基質在腎間質的過度沉積是引起腎間質纖維化的直接原因，Col-Ⅰ、Col-Ⅲ是最主要的細胞外基質成分，不但能將各種ECM 成分聯(lián)結起來，還可誘導腎臟固有細胞合成其他ECM 成分。生理情況下，膠原對修復各種致病因素引起的腎臟損傷有重要的作用，當致病因素持續(xù)存在時，修復過程則會出現(xiàn)失控、紊亂，膠原纖維大量聚集，替代正常的腎組織，引起腎單位失功，進展至終末期腎臟病。

目前尚無治療腎間質纖維化的特效藥，臨床已證實有確切療效的藥物首選血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）的藥物。AngⅡ不僅是血管收縮劑，也是重要的腎臟促纖維化因子，可通過一系列細胞內信號傳導，調控轉化生長因子-β 等因子的表達以及細胞外基質的堆積。本研究的陽性對照藥物纈沙坦膠囊即是AngⅡ受體拮抗劑。研究結果提示，纈沙坦組與溫陽消癥組Col-I、Col-Ⅲ蛋白與mRNA 的表達均顯著下調（P＜0.01），證明兩種藥物均可減輕膠原的堆積，延緩腎間質纖維化的進程，而溫陽消癥組膠原表達的下降程度較纈沙坦組更甚（P＜0.01），提示溫陽消癥方可能在減輕腎纖維化方面療效更優(yōu)。

中醫(yī)認為，“陽氣”是人體物質構成和能量發(fā)生的本源，人體的功能發(fā)揮以陽氣充沛為基礎，亦因陽氣虛衰而致病，因此我們認為，陽虛是腎間質纖維化發(fā)生的本因?！梆鲅笔悄I間質纖維化進程中不可或缺的環(huán)節(jié)，中醫(yī)理論認為“久病入絡，久病多瘀”，結合現(xiàn)代醫(yī)學理論，腎臟毛細血管袢閉塞、微血栓形成、細胞外基質沉積等都是瘀血的表現(xiàn)。張沛虬醫(yī)師根據腎間質纖維化“陽虛血瘀”的病機，擬以溫陽消癥方溫補脾腎，消癥化瘀。方中以黃芪、黨參益氣健脾，仙靈脾、肉蓯蓉溫補腎陽；桃仁、莪術、川芎行氣活血，化瘀消癥。研究表明，本方中多種成分在體內外實驗中證實有抗腎纖維化的作用，如黃芪是目前抗腎纖維化中藥中研究最廣泛的藥物之一，黃芪甲苷可使UUO 大鼠血肌酐、尿素氮下降，下調α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）及纖維連接蛋白（FN）的表達，抑制轉化生長因子-β/Smad 蛋白（TGF-β/smad）信號通路，延緩糖尿病模型小鼠腎纖維化進展[10]。研究還表明，黃芪甲苷通過抑制miR-21 過度表達誘導的足細胞去分化和糖尿病腎病單核細胞活化來改善腎纖維化[11]。淫羊藿總黃酮可下調鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠TGF-β1 蛋白表達，對腎臟損傷有改善作用[12]。

綜上，溫陽消癥方可下調Col-Ⅰ、Col-ⅢmRNA和蛋白的表達，減少細胞外基質在腎間質的堆積，從而減輕UUO 小鼠腎間質纖維化程度。不足之處在于本研究尚不能明確解釋發(fā)生作用的分子靶點，因此，研究溫陽消癥方發(fā)生作用的環(huán)節(jié)，調控何種因子、通路，是我們未來研究的方向。