絲狀真菌全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子研究現(xiàn)狀及發(fā)展

薛鮮麗，劉博雅，高紫君，王德培，*

（1.工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457；2.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457）

絲狀真菌的次級(jí)代謝是一個(gè)復(fù)雜且多層次的調(diào)控過程，其中涉及到真菌細(xì)胞感受外界環(huán)境（溫度、pH值、滲透壓、光照等）變化的適應(yīng)、調(diào)控基因的表達(dá)、基因簇的轉(zhuǎn)錄激活和翻譯修飾等過程。以上過程不僅受到途徑特異性調(diào)控因子（如碳代謝調(diào)控因子CreA）調(diào)控，同時(shí)也被全局轉(zhuǎn)錄因子（如LaeA、VeA、McrA等）進(jìn)行多重調(diào)控[1]。這些全局性轉(zhuǎn)錄因子的基因不以基因簇的形式存在，卻可以調(diào)控一系列基因的表達(dá)[2]。絲狀真菌在生長過程中很大程度上受外界環(huán)境條件的影響，當(dāng)受到外界環(huán)境（如：強(qiáng)光照、高溫、高滲透壓、氧化脅迫等）刺激時(shí)，菌體通過基因調(diào)控表達(dá)相關(guān)基因來改變自身代謝方式，從而減少環(huán)境對(duì)微生物生長的不利影響，最終適應(yīng)環(huán)境變化。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)菌株處于不利生長環(huán)境時(shí)，由全局轉(zhuǎn)錄因子參與的基因調(diào)控途徑發(fā)揮著不可或缺的作用，這為提高菌株耐受性以應(yīng)對(duì)不良環(huán)境提供了新的研究方向。針對(duì)絲狀真菌而言，全局性調(diào)控因子通過調(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄激活影響多種次級(jí)代謝物的產(chǎn)生，包括有益次級(jí)代謝產(chǎn)物（如：某些抗生素、降血脂藥物洛伐他汀等）和有害次級(jí)代謝產(chǎn)物（如：黃曲霉毒、赭曲霉毒素等）[3-4]。目前，全局轉(zhuǎn)錄因子功能研究已經(jīng)被應(yīng)用于提高菌株耐受性、定向改造次級(jí)代謝物的產(chǎn)生、提高有益代謝物以及去除有害次級(jí)代謝物產(chǎn)生等。本文就全局性調(diào)控因子LaeA、VeA、McrA和LaeB對(duì)菌株耐受性提高、菌株生長形態(tài)改變及對(duì)次級(jí)代謝物產(chǎn)生影響等方面展開論述。

1 全局調(diào)控因子LaeA

1.1 laeA基因結(jié)構(gòu)特征及作用機(jī)理

Bok等從構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）中分離鑒定到了laeA基因[5]，隨后的研究中發(fā)現(xiàn)laeA基因還廣泛存在于其他絲狀真菌中，如煙曲霉（Aspergillus fumigatus）、黃曲霉（Aspergillus flavus）、產(chǎn)黃青霉（Penicillium chrysogenum）、橘青霉（Penicillium citrinum）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、黑曲霉（Aspergillus niger）等。由構(gòu)巢曲霉laeA基因序列分析發(fā)現(xiàn)，該基因的啟動(dòng)子和編碼區(qū)域分別有一個(gè)真菌毒素合成途徑中的特異性調(diào)控蛋白AflR（黃曲霉毒素調(diào)控基因aflR）的結(jié)合基序，另外編碼區(qū)的中游含有一個(gè)S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）結(jié)合的保守的結(jié)構(gòu)域，這個(gè)保守區(qū)域與其他曲霉中的laeA基因有較高同源性，如圖1[1]。

圖1 laeA基因結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Structure diagram of laeA gene

研究發(fā)現(xiàn)，缺失SAM結(jié)合區(qū)域和缺失laeA全基因的菌株表型相同，由此推測laeA主要功能為一種甲基轉(zhuǎn)移酶，其可以改變組蛋白甲基化水平。利用染色質(zhì)免疫共沉淀方法鑒定出構(gòu)巢曲霉中l(wèi)aeA會(huì)甲基化修飾組蛋白H3K9，進(jìn)而使次級(jí)代謝產(chǎn)物柄曲霉素（sterigmatocystin，ST）的合成受到影響[6-8]。另外通過對(duì)序列的分析得出，laeA基因中AflR結(jié)合區(qū)域會(huì)影響次級(jí)代謝物的生成，基本機(jī)制是由于AflR對(duì)laeA具有負(fù)調(diào)控作用，并從轉(zhuǎn)錄水平得到驗(yàn)證，即通過轉(zhuǎn)錄水平分析發(fā)現(xiàn)AflR的過表達(dá)反而會(huì)下調(diào)laeA表達(dá)水平。眾所周知，參與次級(jí)代謝和營養(yǎng)利用途徑的基因均以基因簇的形式存在于真菌中。laeA則是黑曲霉次級(jí)代謝產(chǎn)物基因簇基因轉(zhuǎn)錄所必需的調(diào)控因子，但并不調(diào)控營養(yǎng)利用途徑和spoC1孢子形成基因簇[8]。研究發(fā)現(xiàn)，△laeA突變株中，次級(jí)代謝產(chǎn)物柄曲霉素（ST）合成受阻，但在ST基因簇的外部額外拷貝一個(gè)aflR基因可以回補(bǔ)laeA缺失，使其調(diào)控的柄曲霉素（ST）的表達(dá)恢復(fù)。此外，將不受到laeA調(diào)控的argB基因（編碼尿素合成過程中關(guān)鍵酶鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶）整合到ST基因簇中，則會(huì)受到laeA的調(diào)控，進(jìn)一步說明laeA調(diào)控下游基因簇與基因所在位置相關(guān)，而與具體基因功能關(guān)系不大[8]。近期研究表明，laeA對(duì)次級(jí)代謝物的調(diào)控具有位置偏好性，被其調(diào)控的基因簇多發(fā)生在染色體亞端粒區(qū)域[9]。除此之外，研究發(fā)現(xiàn)敲除LaeA導(dǎo)致曲酸的合成顯著下降[10]，其中kojR基因是曲酸合成基因簇中的關(guān)鍵基因[11]，因此推測LaeA可能調(diào)控kojR基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)而影響曲酸的產(chǎn)生，但這還需要進(jìn)一步的研究確定。目前對(duì)LaeA調(diào)控機(jī)制已有大量研究，但是其調(diào)節(jié)機(jī)制細(xì)節(jié)還不是很透徹清楚。

1.2 LaeA對(duì)絲狀真菌生長形態(tài)的影響

LaeA作為全局性調(diào)控因子，對(duì)多種絲狀真菌生長進(jìn)程和菌落形態(tài)有明顯影響。Kale等的研究證明，LaeA影響菌核的形成，在A.flavus菌株中敲除或過表達(dá)laeA基因會(huì)相應(yīng)導(dǎo)致無法產(chǎn)生菌核或者菌核的數(shù)量增加[12]。同樣，Katarina等研究產(chǎn)黃青霉菌，敲除laeA會(huì)減少其孢子的形成[13]；在A.fumigatus菌株中Bok等研究敲除或回補(bǔ)laeA基因?qū)︽咦佑绊懪c產(chǎn)黃青霉菌一致[14]。上述結(jié)果充分證明LaeA對(duì)絲狀真菌生長和孢子形成存在不同影響。laeA缺失對(duì)絲狀真菌生長形態(tài)及分生孢子的影響見圖2。

如圖2A和圖2C所示，LaeA可影響紅曲霉和橘青霉的菌落直徑、孢子萌發(fā)和分生孢子形成，紅曲霉△laeA的突變株（編號(hào)2）出現(xiàn)菌落異常（如圖2A），比野生菌相同時(shí)間菌絲生長快、菌落直徑大，而且未發(fā)現(xiàn)子囊孢子，分生孢子數(shù)量則是野生型的3倍（如圖2B）。另外laeA基因缺失突變株分生孢子萌發(fā)率高于野生型[15]，說明失去LaeA調(diào)控后，促進(jìn)了紅曲霉無性分生孢子的生成，同時(shí)失去有性繁殖子囊孢子的產(chǎn)生。周峰研究發(fā)現(xiàn)在橘青霉中過表達(dá)laeA基因，導(dǎo)致橘青霉在黑暗條件下的分生孢子產(chǎn)量較野生型降低9.9%（如圖2D）[16]。但在構(gòu)巢曲霉中缺失laeA基因不影響分生孢子的形成，可能機(jī)理是LaeA會(huì)調(diào)控Hülle細(xì)胞形成，該細(xì)胞功能為輔助分生孢子發(fā)育，laeA缺失突變株由于缺失該細(xì)胞會(huì)使得閉囊殼發(fā)育異常，與野生型相比較其所含的子囊孢子形狀小且數(shù)量少僅為野生型的五分之一，但是其生育能力不受影響[17]。綜上說明，LaeA對(duì)于不同絲狀真菌中有性/無性繁殖孢子形成存在一定差異的影響，基于現(xiàn)有文獻(xiàn)得到初步結(jié)論，LaeA對(duì)絲狀真菌抑制無性分生孢子的產(chǎn)生，有助于有性生殖或子囊孢子的形成，但推測LaeA在參與調(diào)控有性/無性孢子形成時(shí)可能會(huì)存在不同調(diào)控機(jī)制，其相關(guān)參與的蛋白還有待于深入挖掘。

圖2 laeA缺失對(duì)絲狀真菌生長形態(tài)及分生孢子的影響Fig.2 Effection of ΔlaeA in filamentous fungi on morphology and conidiospores

1.3 LaeA對(duì)絲狀真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的影響

LaeA的全局性調(diào)控功能對(duì)次級(jí)代謝產(chǎn)物的影響在很多絲狀真菌中得到證實(shí)。目前由絲狀真菌產(chǎn)生的具有生物活性的次級(jí)代謝物，被廣泛研究，既包括對(duì)人類有益的如各種抗生素、降脂藥物前體洛伐他汀等，也包括對(duì)人類有害的毒性或致癌性的次級(jí)代謝物，如：黃曲霉毒素、赭曲霉毒素等。研究人員發(fā)現(xiàn)增加laeA基因拷貝數(shù)可以激活沉默的次級(jí)代謝產(chǎn)物相關(guān)基因簇，進(jìn)而使有益于人類的次級(jí)代謝物得到高產(chǎn)，例如在橘青霉中過表達(dá)laeA基因可使其次級(jí)代謝物美伐他汀的產(chǎn)量較對(duì)照提高5.42倍[16]；在煙束曲霉（Aspergillus fumisynnematus）中l(wèi)aeA基因拷貝數(shù)的增加會(huì)提高環(huán)匹阿尼酸（cyclopiazonic acid，CPA）積累[18]。此外，運(yùn)用敲除技術(shù)也可調(diào)控相關(guān)基因簇的表達(dá)進(jìn)而抑制次級(jí)代謝物生成，在不同的絲狀真菌中都有相關(guān)報(bào)道：Bok等研究發(fā)現(xiàn)在構(gòu)巢曲霉中l(wèi)aeA基因的缺失，導(dǎo)致其不產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物柄曲霉素ST，如圖3所示。

圖3 LaeA參與次級(jí)代謝的調(diào)控Fig.3 Depicts of LaeA involvement in secondary metabolite regulation

黃曲霉毒素（aflatoxin，AF）是由黃曲霉或寄生曲霉產(chǎn)生的一類具有毒性和致癌性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，在黃曲霉中敲除或過表達(dá)laeA基因會(huì)相應(yīng)地抑制或促進(jìn)真菌毒素AF的合成。其調(diào)控機(jī)制是，AF的合成是通過受控于G蛋白的信號(hào)通路，細(xì)胞外的刺激信號(hào)（如：氮源、碳源等）反饋于細(xì)胞核內(nèi)，在核內(nèi)受到全局性轉(zhuǎn)錄因子LaeA調(diào)控，經(jīng)過AflR專一途徑使其特異結(jié)合到AF基因簇的啟動(dòng)子區(qū)域，從而激活A(yù)F基因簇的表達(dá)和合成（如圖3）[19]。同時(shí)相關(guān)研究表示，敲除laeA會(huì)影響細(xì)胞壁的疏水性，破壞了AF合成時(shí)所需要的細(xì)胞穩(wěn)定性。綜上所述，LaeA是通過影響了AflR蛋白表達(dá)進(jìn)而影響AF合成啟動(dòng)，最終影響到AF的合成。研究表明在煙曲霉中l(wèi)aeA基因的缺失會(huì)減少其毒性次級(jí)代謝物膠囊毒素的產(chǎn)量[20]；在產(chǎn)赭曲霉毒素的黑曲霉中敲除laeA也會(huì)減少赭曲霉毒素A（ochratoxinA，OTA）生產(chǎn)，尤其是在生長7 d后發(fā)生大幅度降低，在光照和黑暗條件下分別減少92%和99%左右，說明LaeA在OTA生產(chǎn)中起到了關(guān)鍵作用[21]。綜合研究現(xiàn)狀說明，在不同絲狀真菌中敲除或過表達(dá)laeA能夠顯著影響不同的次級(jí)代謝產(chǎn)物（洛伐他汀等）的合成，而且都與AflR蛋白表達(dá)調(diào)節(jié)有關(guān)，但在不同的絲狀真菌中可能存在的作用機(jī)制不盡相同，這還需要進(jìn)一步地去挖掘影響次級(jí)代謝物的基因和條件。1

圖4 H2O2對(duì)野生型和ΔlaeA突變菌株生長影響Fig.4 The effect of the H2O2on the growth of wild strain and ΔlaeA mutant strain

.4 LaeA對(duì)絲狀真菌耐受性的作用

菌體在生長過程中往往會(huì)受到外界環(huán)境改變而帶來的不利影響，如：溫度、pH值、滲透壓、光照及氧化脅迫等，環(huán)境改變會(huì)影響菌株的自身代謝過程進(jìn)而導(dǎo)致其活性降低以及次級(jí)代謝物的生產(chǎn)力。目前，研究表明當(dāng)菌體受到環(huán)境因素刺激，LaeA會(huì)參與環(huán)境脅迫時(shí)產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)，從而提高菌體的耐受性。例如，在黑曲霉的laeA敲除突變株，添加H2O2以構(gòu)成氧化脅迫環(huán)境，其濃度依次為0、5、10 mmol/L，隨著濃度的增加發(fā)現(xiàn)對(duì)環(huán)境的敏感性增加，如圖4所示。

在0 mmol/L和5 mmol/L的濃度下，敲除株和野生型（WT）的生長狀態(tài)較為相似，但是相同濃度條件下敲除株較對(duì)照生長明顯受到抑制，且相比之下菌落直徑也變小，而在10 mmol/L的濃度下敲除株的生長則完全受到抑制，而野生型僅表現(xiàn)為生長延遲；由于10 mmol/L的H2O2濃度下完全抑制敲除株，所以通過對(duì)5 mmol/L濃度下的缺失突變株和野生型的胞內(nèi)活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）和抗氧化酶含量變化測定，進(jìn)一步分析面對(duì)脅迫環(huán)境時(shí)胞內(nèi)發(fā)生的防御機(jī)制，試驗(yàn)人員發(fā)現(xiàn)H2O2的添加使得野生株胞內(nèi)ROS增加，抗氧化酶含量也相應(yīng)增加，而相同條件下laeA缺失株的抗氧化酶含量較對(duì)照降低，說明laeA的缺失可能會(huì)影響抗氧化酶的活性使其在受到氧化脅迫時(shí)無法平衡過多活性氧帶來的毒害，造成對(duì)脅迫環(huán)境敏感性的增加[21]。

2 全局調(diào)控因子VeA

2.1 VeA蛋白結(jié)構(gòu)特征

K?fer等在構(gòu)巢曲霉中首次發(fā)現(xiàn)全局性調(diào)控因子VeA[22]。構(gòu)巢曲霉中的VeA蛋白由573個(gè)氨基酸組成，VeA蛋白N端包括一個(gè)核定位信號(hào)和核輸出信號(hào)。研究表明，不同來源VeA同源蛋白的N端相對(duì)保守，C端具有種屬特異性變化。經(jīng)研究證實(shí)，VeA蛋白是一種光敏蛋白，它是Velvet蛋白家族的核心成員，其具有真菌特異性的高度保守的velvet結(jié)構(gòu)域[23-25]。

2.2 VeA對(duì)絲狀真菌生長形態(tài)的影響

HeeSeo Kim等對(duì)構(gòu)巢曲霉的veA基因研究發(fā)現(xiàn)，其對(duì)有性繁殖正向調(diào)控，對(duì)無性繁殖進(jìn)行反向調(diào)控[23]。這一發(fā)現(xiàn)為之后VeA對(duì)菌種生長發(fā)育和形態(tài)變化方面提供了不同研究方向。研究發(fā)現(xiàn)，不同來源veA基因?qū)ζ渖L形態(tài)的影響不盡相同，例如，Ana M.Calvo等試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）中菌核的形成僅發(fā)生在黑暗條件下，并且veA基因的缺失會(huì)導(dǎo)致無法形成菌核[26]。除此之外，還有對(duì)菌落形態(tài)、分生孢子產(chǎn)生及數(shù)量的影響，如在Aspergillus cristatus中敲除veA基因，較野生型僅進(jìn)行有性繁殖相比，ΔveA突變株只生成灰綠色無性孢子，且無性孢子的數(shù)量是野生型的6倍多，如圖5所示[27]。

圖5 野生型和ΔveA突變菌株在MYA（+1 mol/L NaCl）的平板上生長48 h生長形態(tài)及孢子的區(qū)別Fig.5 The differece of phenotypes and conidiation or cleistothecium production of wild strain and ΔveA mutant strain grown in MYA（+1 mol/L NaCl）for up to 48 h

橘青霉過表達(dá)veA基因會(huì)影響菌落形態(tài)，較野生型菌落褶皺增多且顏色變淡，在相同時(shí)間菌落直徑與野生株沒有區(qū)別，分生孢子數(shù)比野生株減少60%左右[28]，表明veA基因的過表達(dá)抑制分生孢子形成，這與在構(gòu)巢曲霉中過表達(dá)veA基因的試驗(yàn)結(jié)果相似。另外，在黃曲霉的研究中利用DNA微陣列分析以及實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）等技術(shù)分析，得到缺失突變株和野生型之間有136個(gè)基因存在表達(dá)差異，并且有27個(gè)基因簇隨時(shí)間變化表達(dá)差異顯著，通過對(duì)基因簇的同源性和功能性分析，以及對(duì)可能依賴VeA的基因簇進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)VeA參與黃曲霉多個(gè)生長代謝的調(diào)控（如鞘脂類代謝），且敲除veA會(huì)提高無性產(chǎn)孢能力[29]。綜上研究說明，VeA對(duì)不同絲狀真菌的有性或無性繁殖的調(diào)控有一定的相似性，即抑制無性分生孢子的產(chǎn)生，有助于有性生殖或子囊孢子的形成，這一調(diào)控功能與LaeA功能正好一致。

2.3 VeA對(duì)絲狀真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的影響

VeA作為全局性轉(zhuǎn)錄因子，在有益/有害次級(jí)代謝產(chǎn)物合成過程都有一定的影響。比如在橘青霉菌中，過表達(dá)可激活洛伐他汀合成基因簇中調(diào)控的基因mlcR和途徑特異性調(diào)控基因mlcB，促進(jìn)次級(jí)代謝物洛伐他汀的生成，通過轉(zhuǎn)錄組分析，mlcR和mlcB的表達(dá)量都明顯高于對(duì)照；同時(shí)發(fā)現(xiàn)veA基因敲除會(huì)降低洛伐他汀的產(chǎn)量[28]。VeA可以抑制絲狀真菌生長過程中有毒次級(jí)代謝物的產(chǎn)生，如在合成黃曲霉毒素的過程中aflR基因和aflJ基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)是必不可少的，Ana M.Calvo等研究veA缺失黃曲霉突變株發(fā)現(xiàn)，aflR基因和aflJ基因都無法轉(zhuǎn)錄，推測VeA可能對(duì)aflR基因和aflJ基因轉(zhuǎn)錄有開關(guān)作用，進(jìn)而影響AF的合成[29]；此外，通過RT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)黑曲霉veA敲除株赭曲霉素OTA合成關(guān)鍵基因pks表達(dá)水平降低，導(dǎo)致該突變株無法合成OTA[21]。

2.4 VeA對(duì)絲狀真菌耐受性的作用

VeA在調(diào)控絲狀真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物合成的同時(shí)，也參與菌株對(duì)環(huán)境脅迫的適應(yīng)性響應(yīng)，主要是通過改變相應(yīng)基因表達(dá)和改變代謝途徑提高菌株對(duì)環(huán)境脅迫的耐受性。例如在黑曲霉中敲除veA基因會(huì)增加對(duì)氧化脅迫的敏感性，在添加過氧化氫構(gòu)成氧化脅迫環(huán)境條件下，△veA黑曲霉突變株隨著過氧化氫濃度的增加生長逐漸受到抑制，在10 mmol/L過氧化氫濃度下菌株生長被完全抑制，而對(duì)照組僅表現(xiàn)出隨著過氧化氫濃度的增加生長遲緩，在相同條件下可以生長形成菌落[21]。另外，與構(gòu)巢曲霉親緣性很近的海洋灰綠曲霉（A.glaucus）中也存在全局轉(zhuǎn)錄因子VeA。海洋生物往往易受到鹽濃度滲透壓脅迫，相關(guān)研究表明，VeA在海洋灰綠曲霉中可響應(yīng)鹽度信號(hào)調(diào)控菌體生長和發(fā)育，無論是敲除突變株還是野生型，其菌落大小都會(huì)隨著鹽度的降低而變小，但是在相同的鹽度條件下缺失株和野生型的菌落大小也存在差異。在發(fā)育過程中，處于人工海水和等滲溶液條件下，敲除株與對(duì)照株的菌落和生長速率較為相似，分生孢子的數(shù)量隨鹽度變化趨勢也相似；但在去離子水的脅迫條件下，敲除突變株在生長發(fā)育的后期較野生型菌落邊緣出現(xiàn)更多不規(guī)則的細(xì)小菌絲，且分生孢子數(shù)量較野生型增加。分生孢子的增加說明菌株傾向于無性繁殖。還有研究發(fā)現(xiàn)灰綠曲霉的無性繁殖可以促進(jìn)次級(jí)代謝物抗腫瘤灰綠曲霉A的產(chǎn)生，這也為利用VeA全局調(diào)控A.glaucus在鹽度變化的條件下高產(chǎn)灰綠曲霉A提供參考[30-31]。綜上研究說明，利用全局轉(zhuǎn)錄因子VeA提高菌株在發(fā)酵過程中對(duì)不良生長環(huán)境的耐受性，對(duì)今后的生產(chǎn)實(shí)踐具有重要意義和應(yīng)用前景。

3 Velvet復(fù)合體中全局轉(zhuǎn)錄因子之間的協(xié)同作用

Bayram等在構(gòu)巢曲霉中發(fā)現(xiàn)VeA作為橋梁連接LaeA和VelB（the velvet like B，屬于Velvet蛋白家族），使其成為異源三聚體，命名為Velvet復(fù)合物，調(diào)控絲狀真菌的形態(tài)發(fā)育和次級(jí)代謝，其調(diào)控機(jī)制如圖6所示。

在光照條件下，VeA多保留在細(xì)胞質(zhì)中，導(dǎo)致VeA無法作為橋梁連接LaeA和VelB形成Velvet復(fù)合物，游離VelB可促進(jìn)無性孢子形成，此時(shí)LaeA表現(xiàn)出低活性且無法形成異源三聚體，從而抑制有性繁殖；當(dāng)處于黑暗環(huán)境時(shí)，在α輸入蛋白KapA和VeA的核定位信號(hào)相互作用下，使進(jìn)入細(xì)胞核的VeA量增加，此外，VelB也隨著VeA進(jìn)入核內(nèi)并增多，從而形成影響次級(jí)代謝物基因簇表達(dá)的Velvet復(fù)合物，進(jìn)而促進(jìn)有性繁殖和次級(jí)代謝產(chǎn)物的生成[32-33]。Velvet復(fù)合物在不同真菌中既有保守性又有一定的特異性，而復(fù)合物形成在調(diào)控代謝過程和生長發(fā)育方面的相互調(diào)節(jié)和協(xié)同作用還需要進(jìn)一步的深入研究。

圖6 Velvet復(fù)合體中全局轉(zhuǎn)錄因子之間的協(xié)同作用Fig.6 Synergy between global transcription factors in the velvet complex

4 全局調(diào)控因子McrA

4.1 McrA結(jié)構(gòu)特征及對(duì)絲狀真菌生長形態(tài)的影響

McrA是近期在構(gòu)巢曲霉中發(fā)現(xiàn)的一類可能屬于鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子的全局調(diào)控因子[34]。對(duì)于全局性調(diào)控mcrA基因的結(jié)構(gòu)特征不如laeA基因的研究深入全面，目前只在構(gòu)巢曲霉、黃曲霉[33]、青曲霉（Penicillium）和土曲霉（Aspergillus terreus）中有相關(guān)報(bào)道。在近期的研究中發(fā)現(xiàn)，黑曲霉中存在與構(gòu)巢曲霉中McrA同源性極高的基因，在黑曲霉CBS513.88中，mcrA的缺失會(huì)對(duì)菌株的生長形態(tài)產(chǎn)生一定影響，例如敲除mcrA菌株在MEPA培養(yǎng)基中的表型由野生株所呈現(xiàn)的黑色菌落變?yōu)辄S色菌落，并且菌落直徑較野生型變小，在其他培養(yǎng)條件下（4種真菌培養(yǎng)基PDA、YG、CYA、YMEG），敲除株比野生株的菌落直徑都有不同程度的減小，孢子顏色都發(fā)生改變而且顏色變化差異較大，證明敲除突變株的生長速率要低于野生型[35]。同時(shí)推測外界不同的環(huán)境刺激信號(hào)可能使McrA在調(diào)控同一個(gè)真菌時(shí)能產(chǎn)生不同的調(diào)控機(jī)制，作用于不同的基因?qū)е骆咦宇伾痛笮〉牟町悺?/p>

4.2 McrA對(duì)絲狀真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物及耐受性的作用

mcrA基因不僅對(duì)菌株形態(tài)變化有影響，還具有調(diào)節(jié)次級(jí)代謝產(chǎn)物的功能。全局性調(diào)控因子McrA在構(gòu)巢曲霉中被鑒定為是一種負(fù)調(diào)控因子，由轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果得到敲除mcrA顯著改變了1 352個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄，其中623個(gè)基因上調(diào)了5倍，且試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)mcrA基因缺失突變株至少上調(diào)了6個(gè)與次級(jí)代謝產(chǎn)物相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，如上調(diào)AN7819轉(zhuǎn)錄因子，推測其為ST基因簇的一個(gè)調(diào)控基因，過表達(dá)則會(huì)抑制次級(jí)代謝物的產(chǎn)生，在青霉菌和土曲霉的相應(yīng)研究中也得到一致的結(jié)果[33，35]。在對(duì)黑曲霉mcrA基因研究發(fā)現(xiàn)，敲除mcrA突變株產(chǎn)生的次級(jí)代謝物通過與對(duì)照組差異分析，比對(duì)得到衣康酸（hexylitaconic acid）的衍生物（3S，8R）-8-hydroxy-3-carboxy-2-methylenenonanoic acid和（3S）-9-hydroxy-3-carboxy-2-methylenenonanoate，以及具有抗菌活性的衣康酸衍生物曲衣康酸A-C（asperitaconic acid A-C），并且通過定量分析發(fā)現(xiàn)，McrA正調(diào)控前兩種化合物，負(fù)調(diào)控后者，但是具體的調(diào)控機(jī)制還有待研究。在對(duì)抗環(huán)境脅迫方面，mcrA基因也起到一定的調(diào)控作用。黑曲霉mcrA基因缺失突變株的研究中發(fā)現(xiàn)，在高鹽高滲的脅迫條件下，敲除突變株對(duì)Zn2+、Li+離子環(huán)境與野生對(duì)照組相比敏感性降低，對(duì)Na+環(huán)境敏感性升高。說明不同的脅迫環(huán)境可能在影響McrA調(diào)控黑曲霉時(shí)存在差異，其具體作用機(jī)理還有待于進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)[36]。

5 全局調(diào)控因子LaeB

前期的研究報(bào)道中發(fā)現(xiàn)，在植物內(nèi)生菌無花果擬盤多毛孢存在一類全新的全局調(diào)控性因子RsdA[37]，且在模式菌株構(gòu)巢曲霉中也發(fā)現(xiàn)其同源基因laeB。該基因是由其表型（loss of aflR express）而命名，預(yù)測其包含同源性較低的兩個(gè)區(qū)域：G-蛋白通路抑制因子和轉(zhuǎn)錄起始因子ⅡA結(jié)構(gòu)域[38]。經(jīng)過試驗(yàn)證明，LaeB調(diào)控構(gòu)巢曲霉的次級(jí)代謝，缺失laeB基因會(huì)間接影響雜色曲霉素的合成。laeB對(duì)黃曲霉在不同培養(yǎng)基上菌體生長及分生孢子的影響見圖7。

圖7 laeB對(duì)黃曲霉在不同培養(yǎng)基上菌體生長及分生孢子的影響Fig.7 The effect of phenotypes and conidiation production of wild strain and ΔlaeB mutant strain grown in different culture

在黃曲霉中，laeB基因缺失突變株較野生型發(fā)生明顯變化（如圖7A），如在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)的兩個(gè)菌株的對(duì)比，△laeB突變株的分生孢子產(chǎn)量要明顯多于對(duì)照（如圖7B）。通過熒光定量PCR分析分生孢子發(fā)現(xiàn)突變株brlA基因的表達(dá)量上調(diào)，brlA則是分生孢子形成的關(guān)鍵基因，推測LaeB通過brlA調(diào)控基因進(jìn)而影響菌落形態(tài)；而在GMM培養(yǎng)基的條件下，△laeB突變株的菌落顯著變小，生長受到抑制。同時(shí)代謝產(chǎn)物中無法檢測到黃曲霉毒素B1。熒光定量PCR分析表明，laeB基因缺失菌株影響黃曲霉毒素B1相關(guān)合成aflQ基因以及調(diào)控aflR基因等表達(dá)，這些基因的表達(dá)下調(diào)可能導(dǎo)致減少合成黃曲霉毒素B1[39-40]。目前l(fā)aeB基因只在構(gòu)巢曲霉和黃曲霉中有相關(guān)研究，在其它絲狀真菌菌株中未見報(bào)道，因此對(duì)其具體調(diào)控機(jī)制以及對(duì)菌株形態(tài)變化的影響還需要進(jìn)一步的研究。

6 總結(jié)與展望

絲狀真菌是一類重要的微生物，其代謝產(chǎn)生的物質(zhì)眾多，目前已知微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物占總數(shù)的一半左右，并應(yīng)用于生物醫(yī)藥和食品發(fā)酵等領(lǐng)域，產(chǎn)生著巨大的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，因此近年來絲狀真菌及其代謝工程研究成為熱點(diǎn)。目前，通過對(duì)絲狀真菌大量的基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，其次級(jí)代謝途徑是一個(gè)復(fù)雜且多層次的高精度調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，包含轉(zhuǎn)錄、翻譯及表型遺傳水平等多層次調(diào)節(jié)，其中每一層次都有多種蛋白質(zhì)參與。隨之直接或間接地調(diào)控這些蛋白質(zhì)表達(dá)的全局轉(zhuǎn)錄因子被發(fā)現(xiàn)并得以應(yīng)用。通過對(duì)全局轉(zhuǎn)錄因子的基因鑒定、結(jié)構(gòu)分析以及為闡明其調(diào)控機(jī)制的研究，可以定向改造絲狀真菌調(diào)控次級(jí)代謝物產(chǎn)生相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。通常采用敲除或過表達(dá)基因的方法，激活絲狀真菌中調(diào)控對(duì)人類有益的次級(jí)代謝物（如抗生素類藥物、降血脂藥物等）產(chǎn)生相關(guān)基因；抑制調(diào)控對(duì)人類有害的具有毒性和致癌性次級(jí)代謝物（如黃曲霉毒素、赭曲霉毒素等）產(chǎn)生的基因。這些次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究及其在農(nóng)業(yè)、食品工業(yè)以及醫(yī)療衛(wèi)生等方面的應(yīng)用具有重要價(jià)值。此外真菌在生長或發(fā)酵過程中往往會(huì)受到不同程度及條件的環(huán)境脅迫，而其生長發(fā)育的改變又會(huì)影響到次級(jí)代謝物的合成和產(chǎn)量。在工業(yè)生產(chǎn)中為避免不良環(huán)境影響菌株生長，常規(guī)是人為改變外界壞境條件，例如采取冷卻水循環(huán)系統(tǒng)降低由夏季高溫引起的不利影響，但是這同時(shí)也對(duì)生態(tài)壞境資源造成一定的浪費(fèi)，增加了生產(chǎn)成本。因此利用全局轉(zhuǎn)錄因子改善菌株的耐受性以平衡由環(huán)境改變帶來的不利影響以及減少對(duì)生態(tài)環(huán)境的危害也已逐漸成為領(lǐng)域內(nèi)所關(guān)注的焦點(diǎn)。

根據(jù)上述的研究總結(jié)，不難發(fā)現(xiàn)對(duì)于全局轉(zhuǎn)錄因子間的相互調(diào)節(jié)和協(xié)同作用的研究還不夠深入。因此laeA、veA基因和Velvet復(fù)合物等其具體的作用機(jī)制和調(diào)控代謝網(wǎng)絡(luò)需要更加系統(tǒng)深入的研究，同時(shí)尋找和挖掘更多的新型全局轉(zhuǎn)錄因子（如LaeA的相似功能基因等），為絲狀真菌在各領(lǐng)域更廣泛地發(fā)展提供更多的可能。這就需要在今后的研究中采取更加全面、更加精確的技術(shù)來研究和完善全局轉(zhuǎn)錄因子的理論基礎(chǔ)，如采用代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等方法以及結(jié)合生物信息學(xué)，對(duì)目的基因或基因簇進(jìn)行檢測分析和編輯，更加系統(tǒng)地設(shè)計(jì)改造基因，為調(diào)控次級(jí)代謝途徑及次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生提供新方法新思路，也為今后工業(yè)生產(chǎn)發(fā)酵提供新的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。