以橄欖為例研究單寧提取方法的改進(jìn)及優(yōu)化

（韓山師范學(xué)院，廣東潮州521041）

橄欖[Canarium album（Lour.）Raeusch.]為橄欖科橄欖屬喬木植物，廣泛種植于我國(guó)福建、廣東、廣西、海南[1-5]。其果味甘酸，性平，具有清熱解毒，化痰止咳，生津止渴的作用。且橄欖營(yíng)養(yǎng)豐富，果肉內(nèi)含蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪、維生素C[6-7]等物質(zhì)，含鈣量也很高。此外，橄欖中單寧含量極高，單寧又稱鞣質(zhì)、單寧酸，是多元苯酚類衍生物，有多重功效，如抗病毒活性、收斂、抗腫瘤活性[8]，并能與自由基發(fā)生反應(yīng)[9-15]，具有很強(qiáng)的抗氧化能力等[15-19]。但是，橄欖澀味重，其澀味主要來自細(xì)胞中的單寧，果實(shí)中單寧含量越高，澀味越濃。因此，果實(shí)加工過程需要進(jìn)行脫澀處理，盡量把果實(shí)中單寧去除。目前，植物單寧的提取一般選擇以甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑為主，但是提取時(shí)間長(zhǎng)，易造成單寧氧化量及副提取物量的增加，導(dǎo)致提取效率偏低。超聲波輔助提取技術(shù)則可利用超聲波增大介質(zhì)分子的運(yùn)動(dòng)速度、增大介質(zhì)的穿透力等效應(yīng)以提取生物有效成分[20-22]。本研究比較了不同提取溶劑的提取效率，結(jié)合超聲波輔助提取技術(shù)，以橄欖為例從多方面優(yōu)化單寧的提取工藝，目的在于提高單寧的提取效率，并將之應(yīng)用于食品脫澀工藝中。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮橄欖果：于2019年4月采購于福建莆田，置于-20℃冰箱中冷藏備用[14]。

單寧酸：天津市大茂化學(xué)試劑廠；甲醇、乙醇、鄰二氮菲：廣州試劑廠；甘油、冰醋酸、乙二胺四乙酸二鈉、六合水三氯化鐵：西隴化工股份有限公司；無水乙酸鈉：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器

S22H超聲波清洗儀：致微廈門有限公司；BSA224S電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；XMTD203恒溫水浴鍋：金壇市科析儀器有限公司；H1850R臺(tái)式高效冷凍離心機(jī)：湖南湘怡實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司；CS-700高速多功能打粉機(jī)：永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 單寧標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

精密稱取單寧酸5 mg，用蒸餾水定容于50 mL容量瓶中，作為0.1 mg/mL單寧標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取0、200、400、600、800、1 000 μL 標(biāo)準(zhǔn)溶液于 25 mL 棕色容量瓶中，加入5mL蒸餾水和125 μL的0.1 mol/L FeCl3溶液，靜置20min，再加入5mL鄰二氮菲緩沖溶液[0.015mol/L鄰二氮菲∶NaAc緩沖溶液∶0.05 mol/L乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）=10∶5∶1（體積比）]定容，靜置 10 min，在510 nm處測(cè)定各濃度的吸光度[23-25]。以吸光度為縱坐標(biāo)，單寧濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得Y=0.276X-0.001 8，R2=0.995 4。

1.3.2 單寧含量的測(cè)定

單寧含量測(cè)定采用鄰二氮菲分光光度法。用0.1 mol/L的FeCl3溶液與樣品液反應(yīng)，加入鄰二氮菲溶液反應(yīng)，在510 nm處檢測(cè)其吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算橄欖單寧提取量。

1.3.3 溶劑提取效率的比較

將烘干至恒重的橄欖粉碎成80目的粉末。取0.50 g橄欖粉末，在提取溫度40℃、提取時(shí)間40 min、料液比1∶40（g/mL）、超聲波功率100 W下采用固定功率超聲波輔助提取單寧，比較水、甘油、甲醇、乙醇、甲醇-甘油、乙醇-甘油等不同提取溶劑對(duì)單寧提取率的影響。

1.3.4 正交試驗(yàn)

在相關(guān)文獻(xiàn)檢索和初步試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定對(duì)提取率有較大影響的3個(gè)因素：提取溫度（A+）、提取時(shí)間（B+）、料液比（C+）為三因素。選用混合正交表L9（33），按正交設(shè)計(jì)法尋找最佳工藝條件[26]，正交因素水平表見表1。

表1 正交因素水平表Table 1 Orthogonal experimental design

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)

以正交試驗(yàn)的最佳提取條件作為參考，考慮成本過高，調(diào)整料液比為 1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25（g/mL）。把單寧提取率作為響應(yīng)值，選取提取溫度、提取時(shí)間、料液比3個(gè)影響因素為自變量，采用三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化以上因素，水平及因素編碼如表2響應(yīng)面水平及因素編碼所示。

表2 響應(yīng)面水平及因素編碼Table 2 Response surface level and factor coding

1.4 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，應(yīng)用Design Expert 8.06軟件對(duì)試驗(yàn)所得結(jié)果進(jìn)行回歸擬合分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溶劑提取效率的比較

在提取溫度40℃、提取時(shí)間40 min、料液比1 ∶40（g/mL）、超聲波功率 100 W 的基礎(chǔ)上[18-21]，考察了水、甘油、甲醇、乙醇、甲醇∶甘油=7∶3（體積比）、乙醇∶甘油=7∶3（體積比）作為提取溶劑的提取效率。提取溶劑對(duì)單寧提取率的影響見圖1。

圖1 提取溶劑對(duì)單寧提取率的影響Fig.1 Effect of extraction solvent on tannin extraction rate

由圖1可知，各溶劑的效率大小為：甲醇+甘油＞甘油＞乙醇+甘油＞甲醇＞水＞乙醇。甘油的添加有效提高有機(jī)溶劑對(duì)單寧的提取率；添加甘油后，甲醇的提取率從24.93%提升至70.31%，乙醇的從5.8%提升至28.66%。

甘油作為有機(jī)溶劑，具有價(jià)格低廉、安全無毒和對(duì)單寧具有較大溶解度的特點(diǎn)，理論上是一種有潛質(zhì)的溶劑。但試驗(yàn)結(jié)果表明，單獨(dú)使用甘油的效果并不佳，可能是由于甘油的黏稠性質(zhì)導(dǎo)致其無法較好地提取樣品中的單寧。而甲醇與甘油的混合溶劑，顯著提高單寧的提取率。原因可能是甲醇成液體狀穿透性強(qiáng)，能將單寧帶出樣品，溶解于甘油中。

2.2 甘油添加比例的提取效率比較

為進(jìn)一步明確甘油添加量對(duì)提取率的影響，提取溶劑分別為：甲醇與甘油體積比分別為 8∶2、7∶3、6∶4、5 ∶5、4 ∶6、3 ∶7、2 ∶8（體積比），其它條件與 2.1 一致。甲醇與甘油不同比例對(duì)單寧提取率的影響見圖2。

圖2 甲醇與甘油不同比例對(duì)單寧提取率的影響Fig.2 Effect of different ratios of methanol and glycerol on tannin extraction rate

由圖2可知，增加甘油含量會(huì)提升提取率，直到60%甘油具有最高的提取率，為87.89%；隨后，甘油比例繼續(xù)增大時(shí)，提取率會(huì)逐漸降低。因此，優(yōu)化結(jié)果為甲醇∶甘油=4∶6（體積比）時(shí)提取率最高，適合選為橄欖單寧的提取劑。

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)選最優(yōu)條件

以2.2為基礎(chǔ)，溶劑選用甲醇∶甘油=4∶6（體積比），超聲波功率100 W，探究溫度、時(shí)間、料液比等因素對(duì)單寧提取效率的影響。其中，基于單寧受熱易分解的特點(diǎn)，提取溫度選擇20、40、60℃；考慮成本因素，提取時(shí)間選擇40、60、80 min，提取料液比選擇1∶20、1 ∶40、1 ∶80（g/mL）。

2.3.1 正交試驗(yàn)結(jié)果

以正交試驗(yàn)（表1）的條件設(shè)計(jì)試驗(yàn)，每組重復(fù)3次，計(jì)算出各條件下的單寧提取率，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，正交試驗(yàn)的結(jié)果見表3。結(jié)果表明，在甲醇∶甘油=4∶6（體積比）、功率為100 W、溫度為20℃、時(shí)間為80 min、料液比為 1 ∶80（g/mL）的提取條件下，橄欖單寧的提取率最高約為93.26%。

表3 正交試驗(yàn)的結(jié)果Table 3 The results of the orthogonal experimental

續(xù)表3 正交試驗(yàn)的結(jié)果Continue table 3 The results of the orthogonal experimental

由表3可知，各因素對(duì)橄欖單寧提取率影響程度的主次順序?yàn)锽+（時(shí)間）＞A+（溫度）＞C+（料液比），最佳方案為A+1B+3C+2。方差分析結(jié)果如表4。

表4 方差分析結(jié)果Table 4 Variance analysis results

2.3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果的驗(yàn)證

為驗(yàn)證上述正交試驗(yàn)的結(jié)果，選取正交結(jié)果最優(yōu)條件A+1B+3C+3，k值最優(yōu)結(jié)果A+1B+3C+2進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，通過3次重復(fù)試驗(yàn)，正交最優(yōu)條件得出平均單寧提取率為94.08%，高于k值結(jié)果，故在后續(xù)試驗(yàn)中選A+1B+3C+3做進(jìn)一步優(yōu)化。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果與正交試驗(yàn)結(jié)果相差0.82%。誤差在可允許范圍內(nèi)，正交試驗(yàn)重復(fù)率高，數(shù)據(jù)真實(shí)可信。

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)選最優(yōu)條件

2.4.1 響應(yīng)面結(jié)果分析

以響應(yīng)面（表2）的條件設(shè)計(jì)試驗(yàn)，每組重復(fù)3次，計(jì)算出各條件下的單寧提取率，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，橄欖單寧提取中心組合試驗(yàn)方案及結(jié)果見表5。

表5 橄欖單寧提取中心組合試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 5 Combination test scheme and results of tannin extraction center of acanthopanax dfficinalis

續(xù)表5 橄欖單寧提取中心組合試驗(yàn)方案及結(jié)果Continue table 5 Combination test scheme and results of tannin extraction center of acanthopanax dfficinalis

2.4.2 回歸模型方差結(jié)果及分析

回歸方程分析表見表6。

表6 回歸方程分析表Table 6 Regression equation analysis table

由表6可知，該模型方程P=0.003 4＜0.05，遠(yuǎn)小于0.01，表現(xiàn)為“差異極顯著”，表明回歸模型達(dá)到極顯著水平。模型的相關(guān)系數(shù)R2=92.54%，大于0.8，說明模型擬合度良好，體現(xiàn)了響應(yīng)值得率實(shí)際值與預(yù)測(cè)值之間的擬合度較大，反應(yīng)真實(shí)試驗(yàn)值。失擬項(xiàng)P=0.089 6＞0.05，表現(xiàn)為“不顯著”，可得出該模型合適，失擬項(xiàng)對(duì)于存在的純誤差不顯著，可忽略。變異系數(shù)C.V.=2.68%，遠(yuǎn)小于10，說明試驗(yàn)具有較高的重復(fù)性。綜上所訴，試驗(yàn)誤差小，重復(fù)性強(qiáng)，方法可靠，因此該模型可進(jìn)一步分析單寧最佳提取工藝條件。

2.4.3 響應(yīng)面交互因素分析

各因素交互作用的響應(yīng)面曲面圖見圖3～圖5。

圖3 提取時(shí)間與提取溫度的交互作用Fig.3 Interaction between extraction time and extraction temperature

圖4 提取溫度與料液比的交互作用Fig.4 Interaction between extraction temperature and the ratio of material to liquid

圖5 提取時(shí)間與料液比的交互作用Fig.5 Interaction between extraction time and feed ratio

觀察交互作用的響應(yīng)面曲面坡度陡峭程度，若坡度陡峭，表明響應(yīng)值受變量交互作用的影響大；分別將提取時(shí)間、提取溫度、料液比其中兩個(gè)影響因素固定為零水平，組合得出另外兩個(gè)影響因素的交互作用。并結(jié)合表6可知，AB交互作用P=0.004 1，表示為“影響極顯著”，表明提取溫度與提取時(shí)間兩因素之間的交互作用對(duì)橄欖單寧提取率影響極大。AC交互作用P=0.294 2。BC交互作用P=0.979 4，表明提取時(shí)間與料液比之間的交互作用對(duì)橄欖單寧提取率影響較小。由F值可得出，各影響因素的主次順序?yàn)椋禾崛r(shí)間（B）＞提取溫度（A）＞料液比（C），與正交試驗(yàn)所得結(jié)果吻合。

2.4.4 最佳提取工藝的優(yōu)化及驗(yàn)證分析

在正交試驗(yàn)最優(yōu)結(jié)果（A+1B+3C+3）的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面軟件優(yōu)化得到的最佳提取工藝條件為：在超聲波功率為100 W的條件下，提取溫度為15.08℃，提取時(shí)間為98.65 min，料液比為 1 ∶22.49（g/mL），單寧提取率的理論值為97.52%。為了驗(yàn)證結(jié)果的真實(shí)性、可靠性與實(shí)際操作的方便性，將實(shí)際提取工藝參數(shù)調(diào)整為提取溫度為 15℃，提取時(shí)間為 99 min，料液比為 1∶22.5（g/mL）。以此為提取條件，進(jìn)行3次平行重復(fù)試驗(yàn)，得出實(shí)際單寧的平均提取率為95.99%與理論值97.52%相差1.53%，誤差在5%以內(nèi)，說明此模型可靠性較高。

3 結(jié)論

以甲醇和甘油作為提取溶劑，采用超聲波輔助法提取橄欖粉末中單寧，經(jīng)正交試驗(yàn)結(jié)果顯示提取時(shí)間＞提取溫度＞料液比。因此，最優(yōu)條件為：甲醇∶甘油=4∶6（體積比）、提取功率100 W、提取溫度20℃、提取時(shí)間80 min、料液比1∶80（g/mL），在此條件下提取率可以達(dá)到（93.26±0.45）%。同時(shí)，考慮環(huán)保及成本問題，建議以提取溫度為40℃、提取時(shí)間為80 min、提取料液比為1∶20作為最優(yōu)條件。

進(jìn)一步運(yùn)用響應(yīng)面軟件Design Expert 8.06優(yōu)化工藝條件，得出橄欖粉末中單寧提取的最佳工藝條件為：超聲波功率為100 W，提取溫度為15℃，提取時(shí)間為99 min，料液比為1∶22.5（g/mL），單寧提取率為95.99%。本試驗(yàn)研究表明使用甲醇和甘油作為提取溶劑，對(duì)單寧的提取率及重復(fù)率效果顯著，可為橄欖的產(chǎn)品開發(fā)提供一定的依據(jù)。