廣西不同產(chǎn)地粉葛、野葛的多糖和異黃酮含量比較

蒙秋艷，黃靖洲，梁艷玲，滕艷芳，伍彥華

（廣西輕工業(yè)科學技術(shù)研究院有限公司，廣西南寧530001）

粉葛為豆科植物甘葛藤Pueraria thomsonii Benth.的干燥根，野葛即葛根，為豆科植物野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwi的干燥根[1]。在 2005 年之前，野葛和粉葛均視為葛根藥材，自《中國藥典》2005年版起，為了用藥的準確性，將二者按照藥材來源進行區(qū)分，列為葛根和粉葛2個品種[1-2]。目前為止，民間用藥仍習慣將二者都作為葛根藥材進行使用，同時粉葛常作為普通食品食用。粉葛和野葛是我國最主要的葛屬植物，產(chǎn)于我國西南部、中南部至東南部，除新疆、青海及西藏外，幾乎遍布全國[3]。其中粉葛以人工種植為主，主要產(chǎn)地為兩廣、云南一帶[4]。我國的葛根類年資源總量在150萬噸以上，小部分用以制作中藥材、淀粉加工、食品加工，而仍有很多葛根資源沒有被很好地開發(fā)和利用[5]。

近年來，國內(nèi)外研究人員針對葛根的多糖類、異黃酮類成分的研究投入了大量工作。其中，Zhou Dong等[6]從葛根中分離得到一種分子量為12.3 kDa的新型多糖，并分析其結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該多糖的主要連接類型是1，4-α-D-Glcp 和 1，3，6-α-D-Glcp，藥理研究表明此新型多糖具有免疫調(diào)節(jié)活性。Wang Xin等[7]從野葛中分離并鑒定了3種異黃酮葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，分別含有野葛葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因PlUGT4、PlUGT15和PlUGT57，發(fā)現(xiàn)其能在體外將金雀異黃素和大豆苷元的7-羥基糖基化，其中PlUGT15對染料木素和大豆苷元的催化效率高于黃酮醇7-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶。Sun Yingjie等[8]從野葛中分離得到2種新的異黃酮苷類化合物，分別為3'-甲氧基新鳥苷A和3'-甲氧基新鳥苷B，活性評價顯示其對HepG2細胞具有保護作用，表明其具備一定的保肝活性。對于葛根的生物活性研究，也有新發(fā)現(xiàn)。Wang Xiaoke等[9]使用改良的熱解方法合成了一種具有治療痛風的臨床應用前景的新型水溶性碳點，命名為Puerariae lobatae Radix CDs，藥效試驗研究表明其具有良好的生物相容性和抗痛風的生物活性。

傳統(tǒng)中醫(yī)學理論中，粉葛和野葛具有發(fā)表解肌、解熱生津、透疹、升陽止瀉、解酒的功效[10]，現(xiàn)代藥理研究表明葛根具有改善心腦血管[11-12]、降糖[13-14]、降脂[14-15]、降壓[16]、保肝[8，17-18]的作用，以上作用功效在臨床研究中也得到驗證[19-21]。野葛和粉葛被衛(wèi)生部先后加入藥食同源目錄中，我國對于葛根的開發(fā)利用將會越來越深入。廣西地區(qū)的葛根原料產(chǎn)量大，多以新鮮原料或葛粉的形式以批發(fā)或零售的方式進行銷售，處于農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)鏈底端，對葛根的開發(fā)利用仍處在低層次的粗加工階段，大大制約了廣西農(nóng)產(chǎn)品升值，這一現(xiàn)狀亟待改變。本研究通過對廣西不同產(chǎn)地的粉葛、野葛原料的多糖、異黃酮進行含量測定，對其品質(zhì)進行評價，作為廣西所產(chǎn)葛根進一步綜合開發(fā)利用的數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

粉葛、野葛：收集自廣西各地，詳見表1；三氯化鋁、無水乙醇、硫酸（均為分析純）：西隴科學股份有限公司；乙酸鉀、苯酚（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；D-無水葡萄糖對照品（純度≥99.9%）、蘆丁、大豆苷（純度均≥95%）：中國食品藥品檢定研究院；葛根素（純度≥95%）：上海安譜實驗科技股份有限公司；甲醇（色譜純）：德國默克公司；純化水：廣西輕工院有限公司科技中心實驗室自制，符合GB/T 6682-2008《分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法》規(guī)定的一級水。

表1 粉葛、葛根原料來源一覽表Table 1 List of raw materials of Pueraria thomsonii and Pueraria lobata

1.2 儀器與設(shè)備

N4S紫外分光光度儀：上海儀電分析儀器有限公司；202-2電熱恒溫干燥箱：北京科偉永興儀器有限公司；XO-SM300超聲波微波協(xié)同反應工作站：南京先歐儀器制造有限公司；AUW220電子天平：島津（上海）實驗器材有限公司；Genex Beta 移液槍（10 μL～1 000 μL）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；Waters2489高效液相色譜儀：沃特世科技（上海）有限公司；ODS C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）：安捷倫科技（中國）有限公司；針式過濾器有機濾頭（0.22、0.45 μm）：天津市津騰實驗設(shè)備有限公司；LHP-60-H實驗室純水機：重慶力德高端水處理設(shè)備研發(fā)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 水分含量的測定

分別稱取不同產(chǎn)地的粉葛、野葛粉末（過40目篩）約5 g，按照《中國藥典》2015年版四部中“0832水分測定法”第二法（烘干法）規(guī)定的方法，分別測定廣西9個產(chǎn)地粉葛和野葛的水分含量。

1.3.2 多糖含量的測定

粉葛、野葛中多糖的含量使用苯酚-硫酸法[22]進行測定。

1.3.2.1 葡萄糖標準曲線的繪制

稱取葡萄糖對照品，制成含量為107mg/mL標準葡萄糖溶液。準確移取 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 的標準葡萄糖溶液，按照苯酚-硫酸法進行操作，在λ=490 nm下測量吸光度，以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。

葡萄糖標準曲線的回歸方程為y=0.0093x+0.0307，r2=0.999 1，該曲線在葡萄糖質(zhì)量濃度為21.40 mg/mL～107.00 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.3.2.2 粉葛、野葛多糖待測樣品的制備

準確稱取1.0 g各產(chǎn)地粉葛、野葛樣品粉末（40目），在液料比40∶1（mL/g）條件下，以一定溫度水浴條件下熱水浸提一定時間，過濾，濾渣用熱水洗滌3次，再以同等條件進行第二次提取，合并兩次提取液；提取液減壓濃縮后按照體積比1∶3加入體積分數(shù)為95%乙醇溶液，低溫靜置24 h，離心取沉淀，加水復溶后定容至50 mL，再準確移取0.5 mL定容到50 mL，即得多糖待測樣品。

1.3.2.3 粉葛、野葛樣品的多糖含量測定

移取1.3.2.2所制得待測樣品2.0 mL于具塞試管中，加入苯酚1.0 mL和濃硫酸5.0 mL，在λ=490 nm下測量吸光度，根據(jù)回歸方程計算樣品溶液中葡萄糖的質(zhì)量濃度。

樣品中多糖含量以質(zhì)量分數(shù)ω計，單位以g/100 g表示，按公式（1）計算。

式中：m1為從標準曲線上查得樣品測定液中含糖量，μg；V1為樣品定容體積，mL；m2為樣品質(zhì)量，g；V2為比色測定時所移取樣品測定液的體積，mL；0.9為葡萄糖換算成葡聚糖的校正系數(shù)。

1.3.3 總異黃酮含量的測定

1.3.3.1 供試樣品的制備

取9個不同產(chǎn)地供試樣品粉末（40目），準確稱取0.1 g，加入體積分數(shù)為70%的甲醇溶液50 mL，水浴回流提取30 min。冷卻至室溫（25℃）后補足質(zhì)量，搖勻，過濾取續(xù)濾液，即得總黃酮供試品溶液。每個產(chǎn)地的供試品溶液平行制作3份。

1.3.3.2 蘆丁標準曲線的繪制

準確稱取蘆丁標準對照品，用70%甲醇溶解后定容至1 000 mL，配置成0.057 3 mg/mL的蘆丁標準溶液。分別準確移取蘆丁標準溶液0.25、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00 mL于10 mL容量瓶中，加入2 mL三氯化鋁溶液（0.1 mol/L）和 3 mL乙酸鉀溶液（1 mol/L），并用70%甲醇定容至刻度，搖勻后靜置30 min。同時做空白樣。使用紫外可見分光光度儀，在波長為420 nm條件下檢測，記錄吸光度，以蘆丁濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。蘆丁標準曲線的回歸方程為y=4.112 0x-6.590 0，r2=0.999 6，該曲線在蘆丁濃度為0.001 4 mg/mL～0.022 9mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.3.3.3 供試樣品中總異黃酮含量的測定

分別準確移取1.3.3.2所制備的供試樣品溶液1.0 mL，加入2 mL三氯化鋁溶液（0.1 mol/L）和3 mL乙酸鉀溶液（1 mol/L），并用70%甲醇定容至10 mL，搖勻后于室溫（25℃）靜置30 min，用0.45 μm濾膜過濾，于波長420 nm處測定吸光度值，計算總異黃酮的濃度。

樣品中總黃酮含量以蘆丁的質(zhì)量分數(shù)ω總異黃酮計，單位以g/100 g表示，按照公式（2）計算。

式中：C為從蘆丁標準曲線查得供試樣品中總黃酮濃度，mg/mL；V為提取樣品溶液體積，mL；d為供試樣品的總稀釋倍數(shù)；m為取樣量，g；F為原料的水分含量，%。

1.3.4 葛根素和大豆苷的含量測定

1.3.4.1 色譜條件

ODS C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇∶水=26∶74，等度洗脫；檢測波長為250 nm；洗脫流速為1 mL/min；進樣量10 μL。

1.3.4.2 對照品溶液的配置

將20 mg葛根素標準對照品用甲醇完全溶解，定容于25 mL容量瓶中，作為葛根素標準對照儲備液；將20 mg大豆苷標準對照品用甲醇完全溶解，定容于25 mL容量瓶中，作為大豆苷標準對照儲備液。

分別吸取1.00 mL葛根素標準對照儲備液和770.00 μL大豆苷標準對照儲備液，定容到100 mL容量瓶中，配制成含0.008 0 mg/mL葛根素和0.006 2 mg/mL大豆苷混合標準對照液，用0.22 μm濾膜過濾，即得對照品溶液。

1.3.4.3 供試樣品的制備

取9個不同產(chǎn)地供試樣品粉末，準確稱取1 g，各稱3份，加入適量體積分數(shù)為40%的乙醇溶液，使液料比為40∶1（mL/g），在50℃溫度條件下提取60 min。過濾，準確吸取續(xù)濾液50 μL定容至5 mL，然后用0.22 μm濾膜過濾，即得供試品溶液。

1.3.4.4 供試樣品的檢測與計算

將1.3.4.2和1.3.4.3所制備的對照品溶液和供試品溶液使用高效液相色譜法進樣檢測，檢測方法如1.3.4.1所示。以對照品溶液中葛根素、大豆苷的保留時間為參考，確定供試品的葛根素和大豆苷色譜峰，記錄其峰面積并進行計算。

樣品中葛根素、大豆苷含量以質(zhì)量分數(shù)ω葛、ω苷計，單位以 mg/g表示，按公式（3）、（4）計算。

式中：C葛為從標準曲線上查得供試樣品中葛根素濃度，mg/mL；V 為提取樣品溶液體積，mL；m'為取樣量，g；C苷為從標準曲線上查得供試樣品中大豆苷濃度，mg/mL；F為原料的水分含量，%。

1.3.4.5 線性關(guān)系考察

從1.3.4.2所配置的葛根素、大豆苷標準對照儲備液中吸取適量溶液，制成含量分別為0.001 6、0.003 2、0.004 8、0.006 4、0.008 0、0.009 6 mg/mL 的葛根素標準溶液，以及含量分別為 0.001 2、0.002 5、0.003 7、0.005 0、0.006 2、0.007 4 mg/mL的大豆苷標準溶液。對以上不同濃度的標準對照溶液進行檢測，檢測方法如1.3.4.1所述，以峰面積為縱坐標，以進樣濃度為橫坐標，制作標準曲線。

葛根素標準曲線的回歸方程為Y=4.31×10-7X－2.02×10-3，其 r2=0.999 9，說明葛根素標準曲線在葛根素含量為0.001 6 mg/mL～0.009 6 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；大豆苷標準曲線公式為Y=4.46×10-7X+1.51×10-3，其r2=0.999 9，大豆苷標準曲線在大豆苷含量0.001 2 mg/mL～0.007 4 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.3.4.6 精密度考察

取1.3.4.2制得的對照品溶液重復進樣6次，用1.3.4.1方法檢測，測得葛根素、大豆苷的峰面積，計算其相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），考察精密度。

1.3.4.7 重復性考察

選取9號產(chǎn)地（廣西桂林市）粉葛進行試驗，準確稱取1 g粉末，稱6份，按照1.3.4.3的提取方法制備，即制得重復性試驗供試液。用1.3.4.1方法檢測，記錄葛根素、大豆苷的峰面積，計算其RSD值，考察其重復性。

1.3.4.8 穩(wěn)定性考察

取1.3.4.3所制備的供試樣品溶液1份，相隔0、2、4、6、8、10 h 進樣，進行穩(wěn)定性考察，記錄葛根素、大豆苷的峰面積，計算其RSD值。

1.3.4.9 加樣回收試驗

準確稱取9號產(chǎn)地粉葛粉末6份，每份0.5 g，每份加入1 mL混合對照品溶液（含葛根素4.648 5 mg/mL和大豆苷0.675 1 mg/mL），按照1.3.4.3方法制備，即制得加樣回收試驗供試液。測定并計算葛根素、大豆苷的平均回收率和RSD值。

1.3.5 單因素試驗

1.3.5.1 乙醇體積分數(shù)

準確稱取9號產(chǎn)地粉葛粉末1 g，分別加入體積分數(shù)為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%的乙醇溶液，液料比控制為50∶1（mL/g），提取溫度控制在40℃，超聲波輔助提取30min。過濾，準確移取續(xù)濾液50 μL定容至5 mL，用0.22 μm濾膜過濾，按照1.3.4.1所示方法進行檢測，記錄葛根素、大豆苷峰面積，計算其提取率。

1.3.5.2 液料比

準確稱取9號產(chǎn)地粉葛粉末1 g，加入體積分數(shù)為50%的乙醇溶液，提取溫度控制40℃，于液料比分別為 5 ∶1、10 ∶1、15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1、30 ∶1、35 ∶1、40 ∶1、45 ∶1、50 ∶1（mL/g）條件下超聲波輔助提取 30 min。過濾，準確移取續(xù)濾液50 μL定容至5 mL，用0.22 μm濾膜過濾，按照1.3.4.1所示方法進行檢測，記錄葛根素、大豆苷峰面積，計算其提取率。

1.3.5.3 提取時間

準確稱取9號產(chǎn)地粉葛粉末1 g，加入體積分數(shù)為50%的乙醇溶液，液料比為50∶1（mL/g），提取溫度控制 40 ℃，以提取時間分別為 10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 min進行超聲波輔助提取。過濾，準確移取續(xù)濾液50 μL定容至5 mL，用0.22 μm濾膜過濾，檢測并記錄葛根素、大豆苷峰面積，計算其提取率。

1.3.5.4 提取溫度

準確稱取9號產(chǎn)地粉葛粉末1 g，加入體積分數(shù)為50%的乙醇溶液，液料比為50∶1（mL/g），在提取溫度分別為 25、30、35、40、45、50、55、60 ℃，進行超聲波輔助提取30min。過濾，準確移取續(xù)濾液50 μL定容至5 mL，用0.22 μm濾膜過濾，檢測并記錄葛根素、大豆苷峰面積，計算其提取率。

1.3.6 正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，考察乙醇體積分數(shù)、液料比、提取時間、提取溫度對葛根素和大豆苷的提取率的影響，設(shè)計L9（34）正交試驗，正交試驗因素水平表見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 廣西不同產(chǎn)地粉葛、野葛的水分、總多糖和總異黃酮含量

9個不同產(chǎn)地的粉葛、野葛的水分含量、總多糖和總異黃酮含量的測定結(jié)果見表3。

表2 正交試驗因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment

表3 廣西不同產(chǎn)地粉葛和野葛的水分、總多糖和總異黃酮的含量（n=3）Table 3 Contents of moisture，total polysaccharides and total isoflavones of Pueraria thomsonii and Pueraria lobata from different origins of Guangxi（n=3）

各個產(chǎn)地的粉葛、野葛的水分含量均低于14%，符合《中國藥典》對于葛根、粉葛藥材飲片的水分含量規(guī)定，其中廣西桂林市的粉葛的水分含量最低，為7.13%；各產(chǎn)地粉葛、野葛之間的多糖和總異黃酮含量均存在較大差異，產(chǎn)于廣西玉林市的野葛多糖含量和總異黃酮含量最高，為1.106 0 g/100 g和5.163 0 g/100 g。

2.2 方法學考察

精密度考察結(jié)果顯示，葛根素和大豆苷的RSD值分別為0.25%、0.64%，說明精密度良好；穩(wěn)定性考察，葛根素和大豆苷成分的RSD值分別為0.39%、0.65%，表明樣品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好；重復性考察，葛根素和大豆苷兩種成分的RSD值分別為0.50%、0.87%，結(jié)果表明重現(xiàn)性良好。

加樣回收試驗結(jié)果見表4。

表4 加樣回收試驗結(jié)果（n=6）Table 4 Results of adding standard recovery（n=6）

葛根素和大豆苷兩種成分的加樣回收率分別為97.37%、95.57%，其RSD值分別為0.49%、1.84%，結(jié)果表明，所建立的方法適用于粉葛、野葛中葛根素和大豆苷的含量測定。

2.3 單因素試驗

不同乙醇體積分數(shù)對9號產(chǎn)地（廣西桂林）粉葛的異黃酮提取效果見圖1。

圖1 乙醇體積分數(shù)對葛根素和大豆苷提取效果的影響Fig.1 The effect of content of ethanol on extraction effect of puerarin and daidzein

葛根素的提取曲線在乙醇體積分數(shù)為60%時達到峰值，但曲線趨勢較緩，而大豆苷曲線在乙醇體積分數(shù)為50%時為峰值并在高于50%時呈急劇下降趨勢，綜合考慮，認為當乙醇體積分數(shù)為50%時，異黃酮的提取效果最佳。

不同液料比對9號產(chǎn)地粉葛的異黃酮提取效果見圖2。

圖2 液料比對葛根素和大豆苷提取效果的影響Fig.2 The effect of liquid material ratio on extraction effect of puerarin and daidzein

葛根素和大豆苷的提取曲線變化趨勢一致，在液料比為45∶1（mL/g）時達到峰值，表明在該條件下異黃酮的提取效果最佳。

圖3為不同提取時間的異黃酮提取曲線。

圖3 提取時間對葛根素和大豆苷提取效果的影響Fig.3 The effect of extraction time on extraction effect of puerarin and daidzein

葛根素和大豆苷的提取曲線變化趨勢基本相似，在提取時間低于45 min時，異黃酮的提取率變化不大，在提取時間為50 min時異黃酮的提取效果最佳。

不同提取溫度對9號產(chǎn)地粉葛的異黃酮提取效果見圖4。

圖4 提取溫度對葛根素和大豆苷提取效果的影響Fig.4 The effect of extraction temperature on extraction effect of puerarin and daidzein

葛根素和大豆苷的提取曲線變化趨勢相似，當提取溫度從40℃提升到50℃時，葛根素和大豆苷的提取率急劇升高并達到頂峰，高于50℃后平緩下降，表明在提取溫度為50℃時異黃酮的提取效果最佳。

以上單因素試驗結(jié)果顯示，葛根中異黃酮成分的最佳提取因素分別為50%乙醇、液料比45∶1（mL/g）、提取時間50 min、提取溫度50℃。

2.4 正交試驗

基于單因素試驗結(jié)果，對乙醇的體積分數(shù)、液料比、提取溫度、提取時間4個因素進行L9（34）正交試驗，結(jié)果見表5。

表5 正交試驗結(jié)果（n=3）Table 5 Orthogonal test results（n=3）

續(xù)表5 正交試驗結(jié)果（n=3）Continue table 5 Orthogonal test results（n=3）

由正交試驗結(jié)果和極差分析可知，當以葛根素提取率為指標時，4個因素對工藝的影響效果為A＞D＞C＞B，其理論最優(yōu)組合為A2B1C2D3，該組合恰好是正交試驗實際最優(yōu)組；以大豆苷的提取率為指標時，4個因素對工藝的影響效果為D＞B＞A＞C，其最優(yōu)組合為A2B1C3D3。兩個指標顯示的結(jié)果，最優(yōu)的提取溫度存在差異，由于葛根中的葛根素含量遠大于大豆苷的含量，并從節(jié)能方面考慮，本項目主要參考以葛根素的提取率為指標的分析結(jié)果。綜上所述，最優(yōu)的水平組合為A2B1C2D3，即最佳提取條件為使用40%乙醇作為提取溶劑，液料比控制在40∶1（mL/g），在50℃條件下超聲輔助提取60 min。

3 結(jié)論

廣西各個產(chǎn)地的粉葛、野葛的水分含量均低于14%，符合《中國藥典》的規(guī)定，其中產(chǎn)于廣西桂林的粉葛水分含量最低，為7.13%；產(chǎn)于玉林市的野葛多糖和總異黃酮含量較高，分別為1.106 0、5.163 0 g/100 g，該產(chǎn)地的野葛中所含葛根素和大豆苷含量最高，分別為41.767 5、5.788 4 mg/g。綜合考察9個產(chǎn)地葛根原料的水分含量、多糖和總異黃酮含量，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)于廣西玉林市的野葛品質(zhì)最佳。