“橙色奇跡”黃樹莓果實發(fā)育過程中抗氧化特性的研究

康曉俊，史瑞基，李文欣，李寒，張雪梅，湯軼偉，顧玉紅，*，李思琦

（1.河北農業(yè)大學生命科學學院，河北保定071000；2.河北農業(yè)大學林學院，河北保定071000；3.河北農業(yè)大學食品科技學院，河北保定071000）

樹莓（Rubus idaeus Linn.）是薔薇科（Rusaceae）懸鉤子屬（Rubus L.）植物[1]，又名覆盆子、馬林、托盤等，被人們稱為“黃金水果”、“植物界的阿司匹林”[2]。根據植株的生長特點和果實的顏色，將樹莓分為黃樹莓、紅樹莓、黑樹莓和紫樹莓這4大類[3]。黃樹莓的成熟果較甜，可溶性糖含量明顯高于紅樹莓（“費爾杜德”、“哈瑞太茲”、“紅玉”等）成熟果[4]。黃樹莓果實中揮發(fā)性香氣成分萜烯及醇酮類物質含量顯著高于“海倫”紅樹莓[5]，具有潛在的香水、香料等產品開發(fā)前景。此外，隨著人們對抗氧化延緩衰老食品的需求，鮮食果實的抗氧化性研究倍受關注。在植物體內，自由基會引起細胞的氧化衰老，為此，植物體內存在抗氧化衰老的清除自由基的系統(tǒng)，包括抗氧化酶和抗氧化物質，其中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）與過氧化物酶（peroxidase，POD）構成保護酶系統(tǒng)，通過SOD催化H+和O2-·（超氧陰離子自由基）生成H2O2（過氧化氫）與O2，H2O2被CAT或者POD催化生成O2與H2O，從而減輕或降低活性氧自由基對細胞的傷害[6-7]；自由基是引發(fā)慢性疾病的重要因素，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）是一類較為穩(wěn)定的自由基，對DPPH自由基的清除率常被作為評估抗氧化能力的重要指標[8]，在一定程度上能體現(xiàn)抗氧化物質總酚的抗氧化能力[9]，而總酚含量與抗氧化能力顯著相關[10-12]。前人闡明了不同發(fā)育時期的紅樹莓[13-14]、桑葚[15-16]、刺梨[17]、巴西櫻桃[18]、桃[19]等的抗氧化酶活性變化規(guī)律，對這些植物的開發(fā)利用有理論指導價值，而關于黃樹莓果實從青果到黃紅果不同發(fā)育時期果實的抗氧化性尚未見報道。本試驗以“橙色奇跡”黃樹莓不同發(fā)育時期的果實為試材，對抗氧化酶活性、總酚含量及其對DPPH自由基的清除率進行研究，旨在闡明不同發(fā)育時期黃樹莓果實的抗氧化特性，以期為進一步根據黃樹莓果實的抗氧化特點進行適時采收及研發(fā)抗氧化衰老的產品提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為“橙色奇跡”黃樹莓果實，采自河北省廊坊市永清縣樹莓基地，采摘4個不同發(fā)育時期的果實，依次為青果、白果、黃果、黃紅果，經過液氮速凍，轉至-80℃超低溫冰箱保存。

1.2 儀器與設備

Thermo scientific ST 8R高速冷凍離心機：德國賽默飛世爾有限公司；TU-1810紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；OHAUS CP114電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市杰瑞爾電器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 “橙色奇跡”黃樹莓果實抗氧化酶活性的測定方法

參照李文欣等[13]的方法測定黃樹莓果實的抗氧化酶活性。稱取青果、白果、黃果、黃紅果各0.3 g（3次重復），放入低溫預冷的研缽中，用移液器快速加1 mL 50 mmol/L pH 7.8磷酸緩沖液（4℃存放）入研缽中，快速研磨至勻漿狀態(tài)，迅速轉移至低溫預冷的離心管中，快速加入1 mL 50 mmol/L pH 7.8磷酸緩沖液（4℃存放）淋洗研缽并迅速轉移至低溫預冷的離心管中，重復淋洗一次，配平，將離心管在12 000 r/min和4℃的條件下離心30 min，離心結束后，輕輕倒出上清液，量取上清液體積，放到4℃條件下待用。運用分光光度計測定CAT、POD及SOD活性，所用方法依次為過氧化氫法（一個CAT活性單位以每分鐘吸光度值變化0.1來表示）、愈創(chuàng)木酚法（一個POD活性單位以每分鐘吸光度值變化0.1來表示）、氮藍四唑（nitro-blue tetrazolium，NBT）光還原法（一個酶活力單位是以抑制NBT光還原的50%的酶液量來表示）。

1.3.2 “橙色奇跡”黃樹莓果實總酚含量及DPPH自由基清除率的測定方法

1）參考李文欣等[13]的方法進行總酚的提取及測定。使用提取液為25%的鹽酸-乙醇溶液，在70℃條件下回流提取0.5 h，過濾至刻度試管，4℃條件保存?zhèn)溆谩Ｅ渲?0、10、20、30、40 mg/L 的沒食子酸標準品溶液，分別加入0.1 mL福林酚試劑、1 mL各濃度的沒食子酸標準品溶液，25℃下暗反應5 min，再加入1 mol/L Na2CO30.2 mL，用蒸餾水定容至3 mL，混勻后50℃水浴0.5 h，運用分光光度計在760 nm下測其OD值，制作標準曲線。

2）樣品總酚含量的測定：稱取樣品0.2 g，待測液同樣按上述方法進行測定，利用標準曲線所得的方程求得總酚含量。

3）DPPH自由基清除率的測定參照Ikram Ilahi等[8]的方法稍有改動，根據總酚含量測定方法得到總酚待測液，稱取2 mg DPPH粉末，用無水乙醇定容至200 mL容量瓶，配制成0.01 mg/L DPPH-乙醇溶液，4℃保存。取2 mL 0.01 mg/L DPPH-乙醇溶液和1 mL無水乙醇，混勻后運用分光光度計在517 nm下測得吸光值A0，取2.9 mL無水乙醇和0.1 mL總酚待測液，混勻后在517 nm下測得吸光值A1，取2 mL 0.01 mg/L DPPH-乙醇溶液、0.9 mL無水乙醇和0.1 mL總酚提取液，混勻后在517 nm下測得A2。清除率/%=[1-（A1-A2）/A0]×100。

1.4 數(shù)據處理

使用Excel軟件制作柱形圖；使用DPS數(shù)據處理系統(tǒng)，選擇單因素的Duncan新復極差法，對數(shù)據進行差異顯著性分析；使用SPSS軟件進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 “橙色奇跡”黃樹莓果實不同發(fā)育時期抗氧化酶活性的研究

2.1.1 “橙色奇跡”黃樹莓果實不同發(fā)育時期超氧化物歧化酶活性的變化

“橙色奇跡”黃樹莓不同發(fā)育時期果實的超氧化物歧化酶活性如圖1所示。

由圖1可知，“橙色奇跡”黃樹莓不同發(fā)育時期果實的SOD活性在4.00 U/（g·min）FW～35.58 U/（g·min）FW之間，整體呈現(xiàn)上升趨勢。黃紅果的SOD活性最高，為35.58 U/（g·min）FW，極顯著（p＜0.01）高于其他3個時期；其他3個時期差異均為極顯著，其中青果的SOD活性最低，為4.00 U/（g·min）FW。

2.1.2 “橙色奇跡”黃樹莓果實不同發(fā)育時期過氧化氫酶活性的變化

“橙色奇跡”黃樹莓不同發(fā)育時期果實的過氧化氫酶活性如圖2所示。

圖1 “橙色奇跡”黃樹莓不同發(fā)育時期的果實超氧化物歧化酶的活性Fig.1 The activity of superoxide dismutase in fruit of'orange miracle'yellow raspberry at different developmental stages

圖2 “橙色奇跡”黃樹莓不同發(fā)育時期果實的過氧化氫酶的活性Fig.2 Catalase activity of‘orange miracle’yellow raspberry fruit at different developmental stages

由圖2可知，“橙色奇跡”黃樹莓不同發(fā)育時期果實的CAT活性在3.17 U/（g·min）FW～11.69 U/（g·min）FW之間，整體呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢。其中白果的CAT活性最高，為11.69 U/（g·min）FW，極顯著（p＜0.01）高于其他3個時期，其他3個時期之間無顯著性差別。

2.1.3 “橙色奇跡”黃樹莓不同發(fā)育時期果實過氧化物酶活性的影響

“橙色奇跡”黃樹莓不同發(fā)育時期果實的過氧化物酶活性如圖3所示。

由圖3可知，“橙色奇跡”黃樹莓不同發(fā)育時期果實的POD活性在2.27 U/（g·min）FW～20.51 U/（g·min）FW之間，整體呈現(xiàn)下降趨勢。青果的POD活性最高，為20.51 U/（min·g）FW，極顯著（p＜0.01）高于其他3個時期；白果與黃果存在顯著性差異（p＜0.05）；黃紅果的POD含量最低，為2.27 U/（min·g）FW，極顯著（p＜0.01）低于其他3個時期。

圖3 “橙色奇跡”黃樹莓不同發(fā)育時期果實的過氧化物酶的活性Fig.3 Peroxidase activity of‘orange miracle’yellow raspberry fruit at different developmental stages

2.2 “橙色奇跡”黃樹莓不同發(fā)育時期果實的總酚含量的影響

“橙色奇跡”黃樹莓不同發(fā)育時期果實的總酚含量如圖4所示。

圖4 “橙色奇跡”黃樹莓不同發(fā)育時期果實的總酚含量Fig.4 The total phenolic content of‘orange miracle’yellow raspberry fruit at different developmental stages

由圖4可知，“橙色奇跡”黃樹莓不同發(fā)育時期果實的總酚含量在16.56 mg/g FW～29.30 mg/g FW之間，整體呈現(xiàn)先下降再上升的趨勢。青果的總酚含量最高，為 29.30 mg/g FW，極顯著（p＜0.01）高于其他 3個時期；黃紅果的總酚含量僅次于青果，與其他3個時期差異極顯著（p＜0.01）；白果與黃果無顯著性差異。

2.3 “橙色奇跡”黃樹莓不同發(fā)育時期果實的總酚提取液清除DPPH自由基能力的研究

“橙色奇跡”黃樹莓不同發(fā)育時期果實的總酚提取液清除DPPH自由基能力如圖5所示。

由圖5可知，“橙色奇跡”黃樹莓不同發(fā)育時期果實的總酚提取液清除DPPH自由基能力在10.21%～50.37%之間，整體呈現(xiàn)先下降再上升的趨勢。青果的總酚提取液對DPPH自由基的清除率最高，為50.37%，極顯著（p＜0.01）高于其他3個時期；白果與黃紅果之間無顯著性差別；黃果的總酚提取液清除DPPH自由基能力最低，為10.21%，極顯著（p＜0.01）低于其他3個時期。

圖5 “橙色奇跡”黃樹莓不同發(fā)育時期果實的總酚提取液清除DPPH自由基能力Fig.5 The ability of total phenolic extracts from‘orange miracle’yellow raspberry fruit at different developmental stages to scavenge DPPH free radicals

3 討論與結論

植物對于活性氧有兩套防御系統(tǒng)，分別為保護酶系統(tǒng)（SOD、CAT、POD等）以及天然的非酶自由基清除劑（酚類、胡蘿卜素、維生素C等）[20]。本課題組前期研究表明“海爾特茲”紅樹莓果實發(fā)育過程中的SOD活性、CAT活性、POD活性最高的時期依次為深紅果36.99 U/（g·min）FW，黃果41.12 U/（g·min）FW，青果9.83 U/（g·min）FW[13]；本研究中“橙色奇跡”黃樹莓不同發(fā)育時期的果實中，黃紅果的SOD活性最高，為35.58 U/（g·min）FW，白果的CAT活性最高，為11.69 U/（g·min）FW，青果的POD活性最高，為20.51 U/（g·min）FW；綜上所述，“海爾特茲”紅樹莓和“橙色奇跡”黃樹莓果實成熟過程中抗氧化酶活性的變化趨勢一致，即SOD活性連續(xù)上升、CAT活性先上升后下降、POD活性持續(xù)下降；POD、CAT、SOD依次在果實發(fā)育初期、中期、后期的抗氧化能力最強；成熟果中較高的SOD活性增強了果實的抗氧化能力，降低了自由基對果實的傷害，同時提升了鮮食果實的營養(yǎng)保健價值，因此，在黃紅果時期采摘可獲得SOD酶活性高、抗氧化能力強的黃樹莓果實。此外，本研究表明“橙色奇跡”黃樹莓果實從青果到黃紅果的發(fā)育過程中，總酚含量及其清除DPPH自由基的能力整體都呈現(xiàn)先下降再上升的趨勢，青果的總酚含量及清除DPPH自由基的能力均為最高，因此在青果時期采摘可獲得酚類物質含量高且抗氧化能力強的黃樹莓果實；Giovana Bonat Celli等[18]研究表明在巴西櫻桃紅色品種的果實發(fā)育過程中，青果時期的總酚含量與清除DPPH自由基的能力均為最高；朱明濤等[19]研究表明桃果實中總酚含量和清除DPPH自由基的能力隨著果實的發(fā)育呈現(xiàn)逐漸下降趨勢；即黃樹莓、巴西櫻桃紅色、桃在果實發(fā)育過程中均為青果（幼果）的總酚含量與清除DPPH自由基的能力最高，說明幼果通過酚類物質清除自由基起到抗氧化的作用，這為人類開發(fā)利用幼果酚類物質的藥用價值奠定基礎。

綜上所述，抗氧化酶與抗氧化物質總酚是“橙色奇跡”黃樹莓自身的兩套不同的抗氧化機制，果實在不同的發(fā)育時期通過不同的抗氧化機制達到抗氧化目的，人們可根據需求確定采收期，本文可為“橙色奇跡”黃樹莓果實抗氧化食品的研發(fā)以及適時采收提供一定的理論依據。