迷迭香提取物對(duì)自由基誘導(dǎo)魚肝油氧化及模擬消化過(guò)程中脂質(zhì)氧化的抑制作用研究

李云菲，郭曉莉，曹騰正，相啟森，*

（1.鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州450001；2.河南省食品生產(chǎn)與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，河南鄭州450001）

魚肝油是一種從深海魚的肝臟中提煉出來(lái)的脂肪油，富含維生素A、維生素D3及多種不飽和脂肪酸，研究顯示魚肝油中的n-3系列脂肪酸具有提高免疫力、預(yù)防和治療心腦血管疾病的功效[1-3]。其中二十二碳六烯酸（docoxahexaenoic acid，DHA）除有以上功效外，還具有促進(jìn)嬰幼兒智力發(fā)育、提高記憶力、抗衰老以及防治過(guò)敏性皮炎等作用[4]。但是大量研究表明富含不飽和脂肪酸的油脂極易在加工、貯藏和食用過(guò)程中發(fā)生脂質(zhì)氧化，所產(chǎn)生的氧化產(chǎn)物不僅對(duì)色澤、風(fēng)味和質(zhì)地等食品感官品質(zhì)造成不良影響，而且還會(huì)降低食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[5-6]。因此抑制脂質(zhì)氧化成為脂類食品的重要問(wèn)題。

迷迭香（Rosmarinus officinalis L.）是目前廣泛應(yīng)用的天然香料植物之一，已被證實(shí)具有抗菌、消炎、抗腫瘤等多種生理活性功能[7-8]。因其具有良好的抗氧化活性，且安全性高，被廣泛用作動(dòng)植物油脂、油炸面制品、肉及加工肉制品等食品的添加劑[9-11]。因此，本試驗(yàn)分別采用 FeSO4/VC和偶氮二異庚腈[2，2'-azobis（2，4-dimethylvaleronitrile），AMVN]誘導(dǎo)魚肝油氧化，研究迷迭香提取物對(duì)魚肝油氧化的抑制作用，同時(shí)測(cè)定迷迭香提取物對(duì)模擬胃腸道消化過(guò)程中脂質(zhì)氧化的抑制作用，以期為控制脂質(zhì)氧化提供新思路和新發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魚肝油：挪威Nycomed有限公司；迷迭香：亳州市雅麗百花茶有限公司；胃蛋白酶（50 000 U/mL）、胰酶（800 U/mL）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）：美國(guó)Sigma公司；偶氮二異庚腈（AMVN）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；VC、FeSO4·7H2O：天津市大茂化學(xué)試劑廠；丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測(cè)試劑盒：南京建成生物工程研究所；膽汁鹽：上海源葉生物科技有限公司。

Agilent7890B型氣相色譜儀、HP-88色譜柱（100 m×0.25 mm×0.2 μm）：美國(guó) Agilent Technologies有限公司；Multiskan GO型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀：美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；VCX750型超聲儀：美國(guó)Sonics公司；C012型多功能料理機(jī)：九陽(yáng)股份有限公司；HH-S6型電熱恒溫水浴鍋：北京科偉永興儀器有限公司；XD-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海賢德實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；BSA224S-CW電子天平：德國(guó)Sartorius公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 迷迭香提取物的制備

參考Andrade等[12]的方法，并略做修改。將迷迭香干葉用多功能料理機(jī)進(jìn)行粉碎。稱取100 g干粉，加入400 mL 80%乙醇溶液，混勻后室溫（25℃）浸提2 h，過(guò)濾得上清液，連續(xù)提取2次，合并濾液，即得迷迭香粗提液。然后將粗提液于40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，所得濃縮液真空冷凍干燥24 h得到迷迭香提取物，研磨，過(guò)100目篩后置于-18℃冰箱備用。

1.2.2 魚肝油脂肪酸含量測(cè)定

將魚肝油進(jìn)行甲酯化反應(yīng)，采用氣相色譜測(cè)定其脂肪酸含量[13]。氣相色譜條件為色譜柱：HP-88（100 m×0.25 mm×0.2 μm）；進(jìn)樣口溫度：270℃；檢測(cè)器溫度：280℃；載氣：氮?dú)猓?9.999%）；進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣[分流比 =（柱流量+分流出口流量）/柱流量，100∶1（體積比）]；升溫程序：初溫 100℃，保持 13 min，以10℃/min升至180℃，保持6 min，以1℃/min升至200℃，保持20 min，以4℃/min升至230℃，保持10.5 min；進(jìn)樣量：1.0 μL。

1.2.3 迷迭香提取物對(duì)FeSO4/VC誘導(dǎo)魚肝油氧化的影響

配制終濃度為2 mg/mL的魚肝油（乙醇溶解），加入 100 μL 不同濃度（終濃度分別為 10、20、50、100、200、500 μg/mL）的迷迭香提取物溶液，混勻后再分別加入終濃度為5 mmol/L的FeSO4和500 μmol/L的VC，反應(yīng)總體積為1 mL，封口后于37℃水浴避光反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后，采用MDA試劑盒測(cè)定樣品中MDA含量表示魚肝油脂質(zhì)氧化水平，結(jié)果表示為nmol/mL。

1.2.4 迷迭香提取物對(duì)AMVN誘導(dǎo)魚肝油氧化的影響

配制終濃度為2 mg/mL的魚肝油，加入100 μL不同濃度（終濃度分別為 10、20、50、100、200、500 μg/mL）的迷迭香提取物溶液，混勻后再加入終濃度為1 mmol/L的AMVN（甲醇溶解），反應(yīng)總體積為1 mL，封口后于37℃水浴避光反應(yīng)12 h。反應(yīng)結(jié)束后，以MDA含量評(píng)價(jià)魚肝油脂質(zhì)氧化水平。

1.2.5 魚肝油乳液制備

將魚肝油與Tween 20按10∶1（體積比）比例進(jìn)行混勻，采用超聲波在冰浴條件下對(duì)其進(jìn)行均質(zhì)，具體條件為：功率225 W，均質(zhì)時(shí)間5 min，其中每工作4 s停頓2 s。

1.2.6 模擬胃腸道消化

參考Minekus等[14]的方法制備消化液并對(duì)魚肝油乳液進(jìn)行消化處理。

1）模擬胃液：各物質(zhì)終濃度分別為6.9 mmol/L KCl、0.9 mmol/L KH2PO4、25 mmol/L NaHCO3、47.2 mmol/L NaCl、0.1 mmol/L MgCl2·6H2O、0.5 mmol/L（NH4）2CO3，1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH 3.0。

2）模擬腸液：各物質(zhì)終濃度分別為6.8 mmol/L KCl、0.8 mmol/L KH2PO4、84 mmol/L NaHCO3、38.4 mmol/L NaCl、0.33 mmol/L MgCl2·6H2O，1 mol/L NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 7.0。

3）模擬胃消化樣品制備：分別取150 mL模擬胃液、10 μL CaCl2溶液（0.3 mol/L）、22 mL 魚肝油乳液、3.2 mL胃蛋白酶原液（50 000 U/mL）和 200 μL不同濃度（0、0.125、0.250、0.500、1.000 mg/mL）以去離子水為溶劑的迷迭香提取物溶液并混勻，用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH 3.0，并用去離子水調(diào)整體積至200 mL。

4）模擬胃消化：將模擬胃消化樣品于37℃、100r/min的水浴條件下進(jìn)行消化反應(yīng)，分別于0、3 h取樣進(jìn)行測(cè)定。

5）模擬腸消化樣品制備：分別取55 mL模擬腸液、80 μL CaCl2溶液（0.3 mol/L）、100 mL 模擬胃消化樣品、20 mL胰酶溶液（800 U/mL）、5 mL膽汁（160 mmol/L）和200 μL不同濃度的迷迭香提取物溶液并混勻，用1 mol/L NaOH調(diào)pH值至7.0，最后用去離子水補(bǔ)充至200 mL。

6）模擬腸消化：將上述模擬腸消化樣品于37℃、100 r/min的恒溫水浴鍋中消化，分別于0、2 h取樣進(jìn)行測(cè)定。

1.2.7 丙二醛（MDA）含量測(cè)定

分別取100 μL模擬胃消化樣品或腸消化樣品，按照MDA試劑盒操作說(shuō)明書進(jìn)行測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)均做3次平行，試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用IBM SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用單因素方差分析（one-way analysis of variance，ANOVA）中的最小顯著差異法（least significant difference，LSD）進(jìn)行顯著性分析，p＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚肝油脂肪酸成分分析

采用氣相色譜測(cè)定魚肝油脂肪酸組成，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 魚肝油脂肪酸組成Table 1 Fatty acid composition of cod liver oil

由表1可知，魚肝油主要由油酸、花生一烯酸、棕櫚酸、二十二碳六烯酸（DHA）、棕櫚一烯酸、二十碳三烯酸、二十二碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和肉豆蔻酸等組成，含量分別為16.17%、14.76%、11.47%、16.67%、7.98%、9.25%、9.92%和 4.32%，其次還含有亞油酸、硬脂酸和α-亞麻酸，含量分別為2.54%、2.38%和1.02%。魚肝油不飽和脂肪酸含量為80.67%，其中多不飽和脂肪酸為41.27%，單不飽和脂肪酸為39.40%；另外還含有19.33%的飽和脂肪酸。

2.2 迷迭香提取物對(duì)FeSO4/VC誘導(dǎo)魚肝油氧化的影響

丙二醛是油脂中不飽和脂肪酸氧化分解所產(chǎn)生的次級(jí)氧化產(chǎn)物，是衡量脂質(zhì)氧化的重要指標(biāo)[15]。迷迭香提取物對(duì)FeSO4/VC誘導(dǎo)魚肝油氧化的影響如圖1所示。

圖1 迷迭香提取物對(duì)FeSO4/VC誘導(dǎo)魚肝油氧化的影響Fig.1 Effect of rosemary extract on cod liver oil oxidation induced by FeSO4/VC

由圖1可知，對(duì)照組魚肝油氧化所產(chǎn)生的MDA含量很低，而經(jīng)FeSO4/VC處理后，魚肝油發(fā)生脂質(zhì)氧化，MDA 含量顯著升高至 385.39 nmol/mL（p＜0.05）；添加終濃度為10 μg/mL至500 μg/mL的迷迭香提取物能夠有效抑制FeSO4/VC誘導(dǎo)的魚肝油氧化。當(dāng)迷迭香提取物終濃度為500 μg/mL時(shí)，魚肝油氧化所產(chǎn)生的MDA含量顯著降低了93.47%（p＜0.05）。以上結(jié)果表明迷迭香提取物能夠有效抑制魚肝油氧化，且抑制作用隨其濃度的升高而增強(qiáng)。這與韓靜靜等[16]研究生育酚及其衍生物對(duì)FeSO4/VC誘導(dǎo)亞油酸氧化影響的結(jié)果相一致。

2.3 迷迭香提取物對(duì)AMVN誘導(dǎo)魚肝油氧化的影響

AMVN[17]是一種脂溶性偶氮類化合物，熱分解條件下會(huì)產(chǎn)生烷氧自由基，從而引發(fā)魚肝油脂肪氧化的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，加速油脂氧化。迷迭香提取物對(duì)AMVN誘導(dǎo)魚肝油氧化的影響見(jiàn)圖2。

圖2 迷迭香提取物對(duì)AMVN誘導(dǎo)魚肝油氧化的影響Fig.2 Effect of rosemary extract on cod liver oil oxidation induced by AMVN

由圖2可知，魚肝油經(jīng)AMVN誘導(dǎo)后，發(fā)生較高程度的氧化反應(yīng)，MDA生成量為38.63 nmol/mL。添加終濃度為10 μg/mL至500 μg/mL的迷迭香提取物能夠有效抑制AMVN誘導(dǎo)的魚肝油氧化。當(dāng)迷迭香提取物添加量為500 μg/mL時(shí)，其MDA生成量較未添加迷迭香提取物時(shí)顯著降低了60.16%，其抑制效果隨著迷迭香提取物濃度的升高而顯著增強(qiáng)（p＜0.05），這與迷迭香提取物對(duì)FeSO4/VC誘導(dǎo)魚肝油氧化的影響相一致。

2.4 迷迭香提取物對(duì)模擬胃腸道消化過(guò)程中魚肝油氧化的抑制作用

迷迭香提取物對(duì)模擬胃消化過(guò)程中魚肝油氧化的影響見(jiàn)圖3。

圖3 迷迭香提取物對(duì)模擬胃消化過(guò)程中魚肝油氧化的影響Fig.3 Effects of rosemary extract on lipid oxidation of cod liver oil during in vitro gastric digestion

如圖3所示，經(jīng)模擬胃消化3 h后，對(duì)照組魚肝油中MDA含量相較于0 h時(shí)顯著升高了59.39%（p＜0.05），說(shuō)明魚肝油在模擬胃消化過(guò)程中發(fā)生了脂質(zhì)氧化反應(yīng)。添加終濃度為0.125 mg/mL～1.0 mg/mL的迷迭香提取物能夠有效抑制魚肝油在模擬胃消化過(guò)程中發(fā)生的氧化。在經(jīng)模擬胃消化3 h后，當(dāng)迷迭香提取物添加濃度為1.000 mg/mL時(shí)，MDA含量比對(duì)照組降低了41.28%（p＜0.05）。添加迷迭香提取物對(duì)模擬胃消化魚肝油氧化的抑制作用隨其添加濃度的升高而增強(qiáng)，呈良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

迷迭香提取物對(duì)模擬腸消化過(guò)程中魚肝油氧化的影響見(jiàn)圖4。

圖4 迷迭香提取物對(duì)模擬腸消化過(guò)程中魚肝油氧化的影響Fig.4 Effects of rosemary extract on oxidation of cod liver oil during in vitro intestinal digestion

如圖4所示，迷迭香提取物同樣能夠有效抑制魚肝油在模擬腸消化過(guò)程中MDA的生成（p＜0.05）。經(jīng)過(guò)2 h的消化，當(dāng)迷迭香提取物添加濃度為1.000 mg/mL時(shí)，其MDA含量與對(duì)照組相比下降了46.62%（p＜0.05）。以上結(jié)果表明，迷迭香提取物能夠顯著抑制魚肝油在模擬消化過(guò)程中發(fā)生的氧化反應(yīng)，且其抑制效果隨其添加濃度的升高而增強(qiáng)（p＜0.05），這與Mielnik等[18]得出的結(jié)論相類似。Keokamnerd等[19]也發(fā)現(xiàn)迷迭香提取物能有效抑制因雞肉脂質(zhì)氧化造成的硫代巴比妥酸值 （thiobarbituric acid reactive substance，TBARS）含量的升高。這可能與迷迭香提取物中所富含的多酚類物質(zhì)有關(guān)[20]。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，迷迭香提取物能夠顯著抑制自由基誘導(dǎo)的魚肝油氧化以及魚肝油在模擬胃腸道消化過(guò)程中發(fā)生的脂質(zhì)氧化反應(yīng)，其主要原因可能是迷迭香提取物具有較強(qiáng)的自由基清除能力。在今后的研究中應(yīng)采用動(dòng)物模型進(jìn)一步評(píng)價(jià)迷迭香提取物對(duì)脂質(zhì)氧化的影響及其主要活性組分的穩(wěn)定性，從而為通過(guò)改善膳食結(jié)構(gòu)來(lái)抑制脂質(zhì)氧化提供科學(xué)理論依據(jù)。