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    斷裂點(diǎn)精確定位在平衡易位胚胎染色體分析中的應(yīng)用

    2020-11-24 08:04:04王珺茍興慶王茜怡王曉紅張碩
    生殖醫(yī)學(xué)雜志 2020年11期
    關(guān)鍵詞:斷裂點(diǎn)易位斷點(diǎn)

    王珺,茍興慶,王茜怡,王曉紅*,張碩

    (1.空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心,西安 710038;2.復(fù)旦大學(xué)婦產(chǎn)科醫(yī)院集愛遺傳與不育診療中心,上海 200011)

    染色體平衡易位的新生兒出生率約為1/2 000,平衡易位是染色體結(jié)構(gòu)異常中最常見的畸變類型[1-2]。平衡易位患者在生育年齡前通常無明顯臨床癥狀,但其生殖細(xì)胞在減數(shù)分裂過程中會(huì)大概率產(chǎn)生多種比例的不平衡配子,精子和卵母細(xì)胞結(jié)合后無法產(chǎn)生正常的二倍體胚胎,從而導(dǎo)致出現(xiàn)反復(fù)性流產(chǎn)、胚胎發(fā)育停止、胎兒畸形和晚期新生兒缺陷等不良妊娠結(jié)局[3-5]。同時(shí),在胚胎發(fā)育過程中由于非姐妹染色體單體之間或同一染色體上含有同源序列的脫氧核糖核酸(DNA)分子,DNA分子間/內(nèi)重新組合形成同源重組,這些同源重組的存在將會(huì)對(duì)染色體是否易位的判斷造成影響。

    在過去幾年中,有許多學(xué)者嘗試使用顯微切割和二代測(cè)序、等位基因映射識(shí)別、單體型連鎖分析(PGH)雙端測(cè)序和長讀長測(cè)序來獲得平衡易位斷裂點(diǎn)的精確定位,隨后通過靶向PCR-Sanger測(cè)序技術(shù)精準(zhǔn)定位到斷裂點(diǎn)或基于斷裂點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)進(jìn)行連鎖分析,鑒定完全正常的胚胎[6-11]。但是,在高度重復(fù)和可變易位區(qū)域中確定精確斷點(diǎn)仍然不穩(wěn)定且不準(zhǔn)確。

    本研究針對(duì)兩例染色體平衡易位攜帶同胞兄弟,利用基因芯片測(cè)序結(jié)合熒光強(qiáng)度比(LRR)、B等位頻率(BAF)、PGH和基因型識(shí)別兩對(duì)夫婦、男方母親及胚胎的染色體結(jié)構(gòu)。該方法盡可能縮小斷裂點(diǎn)區(qū)域,精確判斷染色體拷貝數(shù)結(jié)果,加之對(duì)單體型結(jié)果的評(píng)判,更準(zhǔn)確的篩選染色體完全正常的胚胎,為改進(jìn)并完善染色體結(jié)構(gòu)變異檢測(cè)技術(shù)提供可能。

    資料與方法

    一、研究對(duì)象

    本研究中兩對(duì)平衡易位攜帶夫婦(夫婦A、B)來自陜西省空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心。詳細(xì)家系圖見圖1?;颊叻驄DA中的男方(Ⅱ4)為哥哥,患者夫婦B中男方(Ⅱ5)為弟弟,兄弟二人均已婚且婚后4年均未行避孕措施,其雙方配偶(Ⅱ3和Ⅱ6)于2018年11月因原發(fā)性不孕癥就診。細(xì)胞遺傳學(xué)檢查發(fā)現(xiàn),兩對(duì)夫婦中的女方(Ⅱ3和Ⅱ6)均為原發(fā)性不孕癥,兩對(duì)夫婦中的男方(Ⅱ4和Ⅱ5)均為平衡易位攜帶者,染色體平衡易位均為46,XY,t(14;16)(q24;p13.3),經(jīng)男方父母核型驗(yàn)證,兄弟二人平衡易位均為母源變異遺傳。該兩對(duì)夫婦簽署了知情同意后進(jìn)行胚胎植入前遺傳學(xué)診斷(PGD),該研究方案得到空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

    Ⅱ3(哥哥妻子)和Ⅱ4(哥哥)為夫婦A;Ⅱ5(弟弟)和Ⅱ6(弟弟妻子)為夫婦B圖1 平衡易位家系圖

    二、促排卵和胚胎培養(yǎng)

    兩對(duì)夫婦均采用短效長方案促排卵,當(dāng)3個(gè)主導(dǎo)卵泡直徑≥18 mm時(shí),肌肉注射250 mg人絨毛膜促性腺激(HCG)(艾澤,默克,美國),36 h后經(jīng)陰道取卵。獲卵后經(jīng)培養(yǎng)39~40 h行卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射(ICSI),待胚胎發(fā)育到囊胚期116~144 h(D5~D6)根據(jù)評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)Gardner[12]評(píng)估胚胎質(zhì)量,所有胚胎冷凍保存。

    三、芯片檢測(cè)

    分別抽取兩對(duì)夫婦及男方母親(I2)各5 ml外周血放入抗凝管(三力醫(yī)用科技發(fā)展有限公司),并嚴(yán)格按照血液和組織抽提試劑盒(DNeasy,QIAGEN,德國)說明書提取DNA。胚胎發(fā)育第5天取其滋養(yǎng)外胚層中5~10個(gè)細(xì)胞置于0.2 ml EP管中,根據(jù)胚胎細(xì)胞制備試劑盒(REPLI-g Single Cell DNA Library Kit,QIAGEN,德國)說明書裂解細(xì)胞,并通過多重置換擴(kuò)增技術(shù)(MDA)進(jìn)行全基因組擴(kuò)增(WGA),在恒溫30℃擴(kuò)增8 h,后在65℃條件下滅活3 min。擴(kuò)增過程中設(shè)置陰陽性對(duì)照,其中陰性對(duì)照為4 μl胚胎培養(yǎng)過程中的空白培養(yǎng)液,陽性對(duì)照為細(xì)胞系(GM16457,科里爾醫(yī)學(xué)研究所NIGMS人類遺傳細(xì)胞庫,美國)分離的5~10個(gè)細(xì)胞。根據(jù)芯片檢測(cè)試劑盒說明書(Illumina HumanKaryomap-12 DNA Analysis Kit,Illumina,美國)對(duì)分離的DNA和WGA產(chǎn)物進(jìn)行處理,采用Illumina Human Karyomap-12芯片V1.0進(jìn)行檢測(cè),再使用Illumina iScan Bead Array Reader對(duì)其進(jìn)行掃描。

    四、染色體的拷貝數(shù)變異(CNV)分析

    采用Genome Studio軟件和Karyo Studio軟件(Illumina)處理微陣列掃描數(shù)據(jù)以分析CNV?;诙咚狗植紭?gòu)建14種LRR和BAF模型,用于識(shí)別拷貝數(shù)異常的基因組區(qū)域[13-14]。在正常樣本中,每個(gè)位置的離散BAF應(yīng)該在0、0.5和1(分別對(duì)應(yīng)于0/0、0/1、1/1三種基因型),LRR應(yīng)該為0,偏離期望位置則表示拷貝數(shù)異常。

    五、PGH分析

    若平衡易位為遺傳型,則以平衡易位攜帶者的攜帶型親本為參考,尋找攜帶型親本為純合基因型、平衡易位攜帶者為雜合基因型的SNPs,判斷出平衡易位攜帶者的易位單體,同時(shí)要滿足平衡易位攜帶者為雜合基因型、其配偶為純合基因型的SNPs,判斷出胚胎是否攜帶平衡易位;若平衡易位為新發(fā)型或胚胎中存在不平衡易位相關(guān)的拷貝數(shù)變異,可以尋找平衡易位攜帶者為雜合基因型及其另一半為純合基因型的有效SNPs,用于確定易位攜帶鏈的單體型。

    六、精確斷裂點(diǎn)

    結(jié)合CNV、單體型與胚胎基因型三種分析方法,明確易位斷裂點(diǎn)所在區(qū)域。CNV分析基于Karyo Studio軟件分析BAF與LRR的分布來確定CNV斷點(diǎn);PGH基于家系中有效SNPs進(jìn)行分型,不能正確分型的區(qū)域則考慮可能存在CNV;存在拷貝數(shù)異常的胚胎,其缺失區(qū)域內(nèi)位點(diǎn)應(yīng)該完全為純合基因型。綜合以上多方面的指標(biāo),分析各胚胎的斷裂點(diǎn)區(qū)域,并確定染色體結(jié)構(gòu)為不平衡易位型(指在易位相關(guān)染色體存在CNV)、易位攜帶型(指易位相關(guān)染色體不存在CNV,但其為平衡易位攜帶者)或正常型(指易位相關(guān)染色體結(jié)構(gòu)正常,不攜帶平衡易位)。

    七、胚胎植入與產(chǎn)前診斷

    綜合評(píng)估兩對(duì)夫婦所有胚胎的單體型結(jié)果、染色體結(jié)果和胚胎形態(tài)學(xué)結(jié)果(囊胚期胚胎評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)參考Gardner[12]標(biāo)準(zhǔn)),優(yōu)先選擇染色體正常型且形態(tài)學(xué)評(píng)分較高(4AA>4AB>4BA>4BB,若滋養(yǎng)外胚層和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)目較少,胚胎質(zhì)量評(píng)分由“4BB”降為“4B-B-”)的胚胎復(fù)蘇,經(jīng)知情同意分別植入母體,于孕中期(17~22+6周),行羊水穿刺胎兒染色體G顯帶核型分析,再次確認(rèn)PGH胚胎檢測(cè)結(jié)果。

    結(jié) 果

    一、促排卵結(jié)局

    在采用短效長方案促排卵后,夫婦A中的女方(Ⅱ3)共獲卵15枚,ICSI后正常受精13枚,達(dá)到活檢標(biāo)準(zhǔn)胚胎6枚(1-1、1-3、1-5、1-6、1-7和2-2號(hào)胚胎);夫婦B中的女方(Ⅱ6) 獲卵14枚,ICSI后正常受精12枚,達(dá)到活檢標(biāo)準(zhǔn)胚胎9枚(1、2、3、4、5、7、8、9和10號(hào)胚胎),對(duì)活檢合格的胚胎進(jìn)行PGH檢測(cè)并凍存。

    二、精確平衡易位斷裂點(diǎn)

    1.CNV分析結(jié)果:平衡易位攜帶者中14號(hào)染色體的斷點(diǎn)約在chr14:70 000 000(±3 Mb)附近。其中,染色體正??截悢?shù)為2,夫婦A中有2枚胚胎(1-1和1-7號(hào)胚胎)在平衡易位相關(guān)的14號(hào)染色體斷點(diǎn)下游拷貝數(shù)為3,有1枚胚胎(2-2號(hào)胚胎)在14號(hào)染色體斷點(diǎn)下游拷貝數(shù)為1;夫婦B中有1枚胚胎(1號(hào)胚胎)在平衡易位相關(guān)的14號(hào)染色體斷點(diǎn)下游拷貝數(shù)為3;有3枚胚胎(8、9和10號(hào)胚胎)在平衡易位相關(guān)的14號(hào)染色體斷點(diǎn)下游拷貝數(shù)為1;另外,夫婦A的1-5號(hào)胚胎在10號(hào)染色體出現(xiàn)新發(fā)的拷貝數(shù)異常,拷貝數(shù)為3,夫婦B的4號(hào)胚胎在15號(hào)染色體出現(xiàn)新發(fā)的拷貝數(shù)異常,拷貝數(shù)為1(表1)。

    表1 胚胎CNV分析結(jié)果

    分析14號(hào)染色體拷貝數(shù)BAF分布發(fā)現(xiàn),在拷貝數(shù)異常區(qū)域(黃色標(biāo)記),染色體拷貝數(shù)為3的胚胎(1-1、1-7和1號(hào)胚胎)的拷貝數(shù)異常區(qū)域BAF主要離散分布在0、0.33、0.66和1附近(圖2A);染色體拷貝數(shù)為1的缺失胚胎(2-2、8、9和10號(hào)胚胎)的拷貝數(shù)異常區(qū)域BAF主要離散分布在0和1附近(圖2C);分析14號(hào)染色體拷貝數(shù)LRR分布發(fā)現(xiàn),染色體拷貝數(shù)為3的胚胎的拷貝數(shù)異常區(qū)域相較于拷貝數(shù)正常區(qū)域LRR升高,由于受基因組GC含量、基因組復(fù)雜度及芯片熒光信號(hào)的飽和度影響,LRR升高不太明顯(圖2B);染色體拷貝數(shù)為1的胚胎的拷貝數(shù)異常區(qū)域相較于拷貝數(shù)正常區(qū)域LRR降低(圖2D)。

    2.單體型連鎖分析(PGH)結(jié)果:分別以夫婦A的1-3號(hào)胚胎、夫婦B的2號(hào)胚胎為參考,在該斷點(diǎn)±3 Mb做PGH。夫婦A的PGH發(fā)現(xiàn),1-1、1-7和2-2號(hào)胚胎從斷裂點(diǎn)位置P點(diǎn)(chr14:69 757 189)開始,父源鏈的點(diǎn)分布出現(xiàn)顏色交叉現(xiàn)象(胚胎中父源鏈顏色與參考胚胎父源鏈顏色相同表示來自同一條鏈,相反則表示來自不同鏈,提示存在同源重組的可能),即為拷貝數(shù)異常區(qū)域;夫婦B的PGH發(fā)現(xiàn),1、8、9和10號(hào)胚胎從斷裂點(diǎn)位置P點(diǎn)(chr14:70 880 373)開始,父源鏈的點(diǎn)分布出現(xiàn)顏色交叉(圖3)。綜合PGH結(jié)果,判斷14號(hào)染色體斷裂點(diǎn)在chr14:69 757 189上游。

    3.基因型分析結(jié)果:基因型分析發(fā)現(xiàn),chr14:69 757 189上游區(qū)域中距離其最近的符合孟德爾遺傳定律且基因型為雜合的位點(diǎn)位于chr14:69 340 569,表示斷點(diǎn)位于chr14:69 340 569下游;下游中距離chr14:69 340 569最近的不符合孟德爾遺傳定律的純合型位點(diǎn)位于chr14:69 752 603,表示斷點(diǎn)位于chr14:69 752 603上游(表2)。

    結(jié)合CNV、PGH及基因型分析,我們最終可推測(cè)該平衡異位的14號(hào)染色體的斷點(diǎn)位置在chr14:69 340 569~69 752 603之間,范圍大小約412 Kb。

    三、植入前遺傳學(xué)檢測(cè)(PGD)結(jié)果

    PGH分析以男方母親(I2)為參考,則需要選擇攜帶者母親基因型為純合、兄弟二人基因型為雜合的位點(diǎn)分別構(gòu)建單體型。兄弟二人中的易位攜帶鏈,則可根據(jù)鏈的顏色判斷胚胎的來源鏈。14號(hào)染色體斷點(diǎn)區(qū)域與16號(hào)染色體斷點(diǎn)區(qū)域的顏色均與參考鏈顏色相反時(shí),即為正常型胚胎;與參考均相同即為易位攜帶型胚胎;一條顏色相同,另一條顏色相反時(shí)則為不平衡易位型胚胎。

    夫婦A的1-3和1-6號(hào)胚胎在14q24.1斷裂點(diǎn)區(qū)域與16p13.33斷裂點(diǎn)區(qū)域顏色與參考鏈相反,均為正常型胚胎,可優(yōu)先移植;1-5號(hào)胚胎在14q24.1斷裂點(diǎn)區(qū)域與16p13.33斷裂點(diǎn)區(qū)域顏色與參考鏈相同,為遺傳性易位攜帶型胚胎,同時(shí)1-5號(hào)胚胎在10號(hào)染色體存在新發(fā)CNV異常,故不可移植;1-1、1-7和2-2號(hào)胚胎在14q24.1斷裂點(diǎn)區(qū)域與16p13.33斷裂點(diǎn)區(qū)域,其中一條鏈顏色與參考鏈相反,另一條鏈顏色與參考鏈相同,則為不平衡易位攜帶型胚胎,故不可移植(圖4A、圖4B和表3)。同理,夫婦B中2、3、5和7號(hào)胚胎為正常型胚胎,可優(yōu)先移植;1、8、9和10號(hào)胚胎為不平衡易位攜帶型胚胎,故不可移植;其中4號(hào)胚胎單體型雖為正常型,但其15號(hào)染色體存在新發(fā)CNV異常,故不可移植(圖4C、圖4D和表3)。

    A:染色體拷貝數(shù)為“3”的胚胎的BAF分布;B:染色體拷貝數(shù)為“3”的胚胎的LRR分布;C:染色體拷貝數(shù)為“1”的胚胎的BAF分布;D:染色體拷貝數(shù)為“1”的胚胎的LRR分布;藍(lán)色為拷貝數(shù)正常區(qū)域;黃色為拷貝數(shù)異常區(qū)域圖2 胚胎14號(hào)染色體BAF和LRR分布圖

    A:夫婦A;B:夫婦B;男方兩條鏈以紅色和藍(lán)色表示;女方兩條鏈以黃色和綠色表示圖3 PGH圖

    表2 胚胎斷點(diǎn)區(qū)域SNP位點(diǎn)基因型分析結(jié)果

    (續(xù)表)

    A:夫婦A和各胚胎14號(hào)染色體;B:夫婦A和各胚胎16號(hào)染色體;C:夫婦B和各胚胎14號(hào)染色體;D:夫婦B和各胚胎16號(hào)染色體;男方兩條鏈以紅色、藍(lán)色表示,女方兩條鏈以黃色、綠色表示圖4 平衡易位相關(guān)染色體的PGH分析圖

    表3 胚胎PGH分析結(jié)果

    四、臨床妊娠結(jié)局

    綜合胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)估,夫婦A和夫婦B最終分別選擇胚胎等級(jí)均為4BB的1-3號(hào)和5號(hào)囊胚期胚胎單囊胚植入母體。分別在孕18周時(shí)進(jìn)行羊水穿刺,產(chǎn)前診斷結(jié)果與胚胎檢測(cè)結(jié)果一致,胎兒并無染色體異常,均于2019年12月足月順利分娩正常嬰兒。

    討 論

    SNP芯片是通量較高、使用范圍較廣的分析染色體拷貝數(shù)的平臺(tái),它能有效提高染色體拷貝數(shù)的檢測(cè)精度,在一定范圍內(nèi)增加樣本數(shù)無需額外的費(fèi)用,亦可反復(fù)使用從而提高異常染色體的檢出效率[15-17]。本研究中應(yīng)用的胚胎植入前PGH技術(shù)就是一種基于SNP芯片的連鎖分析PGD技術(shù),其原理是通過對(duì)胚胎與其父母、近親進(jìn)行全基因組范圍內(nèi)的SNP檢測(cè),通過SNP位點(diǎn)進(jìn)行家系 PGH,然后通過對(duì)染色體異常的胚胎進(jìn)行斷裂點(diǎn)定位,從而確定該家系易位染色體的斷裂點(diǎn)區(qū)域,最后對(duì)該區(qū)域上下游連鎖區(qū)域進(jìn)行分析,確定攜帶有易位染色體的單體型,進(jìn)而確定胚胎是否攜帶了易位的染色單體。與其他用于區(qū)分平衡易位的方法不同,PGH技術(shù)無需預(yù)實(shí)驗(yàn)、操作較簡單,不僅能檢測(cè)胚胎的拷貝數(shù)變異和易位攜帶,還能夠應(yīng)用于大部分單基因遺傳病的檢測(cè),而且其快速的報(bào)告周期特點(diǎn)更符合臨床需求[18-22]。

    PGH檢測(cè)過程中連鎖分析的前提是該區(qū)域沒有發(fā)生同源重組,一般認(rèn)為上下游5 Mb范圍內(nèi)的同源重組概率較低,遺傳距離越近,發(fā)生同源重組的概率越低。對(duì)于平衡易位或羅氏易位患者,易位斷裂點(diǎn)通常為同源重組高發(fā)區(qū)域,而這些斷裂點(diǎn)附近的同源重組通常會(huì)給胚胎PGH帶來潛在的分析風(fēng)險(xiǎn),所以斷裂點(diǎn)的位置的精確定位有助于保障分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。本研究基于芯片檢測(cè)技術(shù),提出一種新的有助于精確平衡易位斷裂點(diǎn)的分析思路。芯片檢測(cè)技術(shù)一般基于芯片位點(diǎn)LRR和BAF的分布情況進(jìn)行CNV檢測(cè),但是這種簡單指標(biāo)的分析方法通常分辨率不是很高。為了精確易位斷裂點(diǎn),我們結(jié)合LRR、BAF、PGH和基因型分析等4個(gè)方面對(duì)平衡易位斷裂點(diǎn)進(jìn)行精確定位。基于孟德爾遺傳定律,家系中正常的二倍體區(qū)域可以正常分型,而CNV區(qū)域的分型結(jié)果通常是錯(cuò)誤的?;谶@一原則,可根據(jù)家系中的分型結(jié)果協(xié)助精確斷裂點(diǎn)。胚胎的位點(diǎn)基因型同樣可以幫助確定染色體易位斷點(diǎn)范圍,比如缺失區(qū)域不會(huì)存在雜合性位點(diǎn)等。本文中平衡易位患者經(jīng)CNV結(jié)合LRR與BAF指標(biāo)分析,確定染色體平衡易位斷裂點(diǎn)在chr14:70 000 000(±3 Mb)。結(jié)合單體型分析結(jié)果,縮小斷點(diǎn)范圍至chr14:69 203 145~69 757 189(554 Kb)。在考慮斷點(diǎn)區(qū)域位點(diǎn)的基因型與孟德爾遺傳定律后,斷點(diǎn)范圍縮小至chr14:69 340 569~69 752 603(412 Kb)。斷點(diǎn)縮小的范圍與芯片中位點(diǎn)設(shè)計(jì)的密度、位點(diǎn)人群頻率、家系中有效位點(diǎn)的分布等相關(guān)。

    本文中的平衡易位染色體為14號(hào)染色體長臂和16號(hào)染色體短臂末端,核型為46,XY,t(14;16)(q24;p13.3)。由于16號(hào)染色體末端拷貝數(shù)異常的區(qū)域較小,難以明確判斷CNV,所以本文只基于14號(hào)染色體做出判斷。但在各胚胎的PGH過程中,我們同樣針對(duì)各個(gè)胚胎16號(hào)染色體的相互之間分型結(jié)果與14號(hào)染色體是否一致進(jìn)行了考慮。需要注意的一點(diǎn)是,夫婦B中的8號(hào)、9號(hào)和10號(hào)3個(gè)胚胎染色體結(jié)構(gòu)一致,在斷裂點(diǎn)上游三者的分型結(jié)果即顏色應(yīng)該相同。但是,從PGH圖中可以明顯看出斷裂點(diǎn)上游區(qū)域9號(hào)胚胎的顏色(紅色)跟其他兩者(藍(lán)色)不同,可以推測(cè)在9號(hào)胚胎距離斷裂點(diǎn)很小的區(qū)域可能發(fā)生了同源重組(圖4C)。由于9號(hào)胚胎存在CNV,所以很容易被排除在備選胚胎之外,但是如果該重組發(fā)生在沒有CNV的胚胎當(dāng)中,則要相當(dāng)警惕斷點(diǎn)的具體位置,因?yàn)楹芸赡軐误w型結(jié)果判斷成相反面。本文介紹了PGH用于輔助判斷CNV,但是如果拷貝數(shù)重復(fù)是父親或母親一方一條染色體的2個(gè)拷貝,這種情況也值得注意,因?yàn)橥ǔ_@種拷貝數(shù)異常并不會(huì)導(dǎo)致位點(diǎn)的基因型發(fā)生變化,進(jìn)而并不會(huì)帶來單體型分型異常。本文結(jié)合LRR、BAF、PGH和基因型4個(gè)方面的生物學(xué)信息,可有效定位CNV斷裂點(diǎn)。

    本研究在常規(guī)PGH檢測(cè)的基礎(chǔ)上,結(jié)合了易位斷裂點(diǎn)精確定位分析,為臨床PGH技術(shù)的開展提供了新的思路,未來可以推廣到更多的臨床案例分析中,可以降低因斷裂點(diǎn)附近發(fā)生同源重組引起分型錯(cuò)誤的概率,從而進(jìn)一步提升PGH技術(shù)的準(zhǔn)確性。

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