ADS-8型大孔吸附樹脂純化金針菇總黃酮工藝的優(yōu)化及活性測(cè)定

王廣慧 譚吉麗 杜艷超 楊靜怡 尚雅楠 任麗娜

摘要：為了確定ADS-8型大孔吸附樹脂純化金針菇總黃酮工藝的最佳條件以及純化后總黃酮的抑菌性和抗氧化性，通過靜態(tài)吸附和解析試驗(yàn)，探討了樣品液pH、樣品液濃度對(duì)樹脂吸附總黃酮性能的影響，以及在以乙醇為洗脫液的情況下，洗脫液用量和洗脫劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮解析效率的影響，并對(duì)純化后的金針菇總黃酮抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和沙門氏菌4個(gè)菌種以及清除2 ，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽自由基（ABTS·）的能力進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，純化工藝的最佳條件為樣品液pH為5，樣品液濃度為1.19 mg/mL，洗脫液乙醇的體積分?jǐn)?shù)為70%，乙醇用量為140 mL。在上述條件下金針菇總黃酮的純化倍數(shù)是1.84倍;金針菇總黃酮對(duì)4種參測(cè)菌均具有抑制效果，抑菌能力大小依次為大腸桿菌>沙門氏菌>金黃色葡萄球菌>枯草芽孢桿菌;金針菇總黃酮對(duì)ABTS·具有清除能力，說明其具有抗氧化性，但弱于對(duì)照維生素C。

關(guān)鍵詞：ADS-8型大孔樹脂;金針菇總黃酮;純化;抑菌性;抗氧化性

中圖分類號(hào)：TS201.2? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2020）18-0112-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.18.022 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Optimization and activity determination of total flavonoids from Flammulina velutipes

purified by ADS-8 macroporous adsorption resin

WANG Guang-hui，TAN Ji-li， DU Yan-chao， YANG Jing-yi， SHANG Ya-nan， REN Li-na

（College of Food and Pharmaceutical Engineering， Suihua University， Suihua? 152061， Heilongjiang， China）

Abstract： In order to determine the optimal conditions for the purification of Flammulina velutipes flavonoids by ADS-8 macroporous resin and the antibacterial and antioxidative properties of flavonoids after purification， the effects of pH and concentration of sample solution on the adsorption properties of flavonoids in resin and the effects of eluent dosage and eluent volume fraction on the analytical efficiency of flavonoids in the case of ethanol as eluent were studied， and the ability of purified flavonoids to inhibit Staphylococcus aureus， Escherichia coli， Bacillus subtilis and Salmonella enteritidis was tested. The ability of scavenging 2，2-diazo-bis （3-ethyl-benzothiazole-6-sulfonic acid） diammonium salt （ABTS·） was detected. The results showed that the optimal conditions for this purification process were that the pH of the sample solution was 5， the concentration of the sample solution was 1.19 mg/mL， the volume fraction of the eluent ethanol was 70%， and the amount of ethanol was 140 mL. Under the above conditions， the purification ratio of flavonoids was 1.84 times. The flavonoids had inhibitory effects on four kinds of reference bacteria. The order of antibacterial ability was Escherichia coli> Salmonella enteritidis>Staphylococcus aureus>Bacillus subtilis. The results showed that the total flavonoids of Flammulina velutipes had the ability of scavenging ABTS·， indicating that it had antioxidant activity， but weaker than vitamin C.

Key words： ADS-8 macroporous resin; Flammulina velutipes flavonoids; purification; antibacterial; antioxidant

金針菇[Flammulina velutipes]是世界上著名的食藥兩用菌，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值?，F(xiàn)代藥理研究表明，金針菇含有多種有效藥用成分，特別是黃酮類化合物具有抗氧化、抗腫瘤、降血壓、抗炎、保護(hù)心腦血管系統(tǒng)等多種生物活性[1-3]，但是迄今為止，關(guān)于金針菇總黃酮純化技術(shù)的研究并不是很多，而且所獲得的總黃酮純化效果一般。大孔吸附樹脂是具有大孔結(jié)構(gòu)并且不含交換基團(tuán)的有機(jī)高聚物吸附劑，具有理化性質(zhì)穩(wěn)定、選擇性好、不溶于堿酸及有機(jī)溶劑中、能夠快速吸附且吸附容量大、再生容易、機(jī)械強(qiáng)度高等優(yōu)點(diǎn)[4]。本研究分析了ADS-8型大孔吸附樹脂純化金針菇總黃酮工藝的最佳條件，并對(duì)純化后總黃酮的抑菌和抗氧化能力進(jìn)行了檢測(cè)，以期為金針菇總黃酮的進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

ADS-8型大孔吸附樹脂，購(gòu)自上海莼試生物技術(shù)有限公司;試驗(yàn)所用各種化學(xué)試劑都為國(guó)產(chǎn)分析純，購(gòu)自常州市旭宏化工有限公司;金針菇、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、沙門氏菌（Salmonella enteritidis），取自綏化學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。木瓜蛋白酶、纖維素酶，購(gòu)自北京奧博星生物科技有限責(zé)任公司。

1.2 主要儀器

752型紫外-可見分光光度計(jì)，購(gòu)自上海菁華科技儀器有限公司;TGL-20bR型冷凍離心機(jī)，購(gòu)自上海安亭科學(xué)儀器廠;YXQ-LS-75SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌器，購(gòu)自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;牛津杯（內(nèi)徑6 mm），購(gòu)自上海魯碩實(shí)業(yè)有限公司;ZD-85型氣浴恒溫振蕩器，購(gòu)自江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 總黃酮含量的測(cè)定方法 采用硝酸鋁-亞硝酸鈉法測(cè)定金針菇中總黃酮的含量。線性回歸方程的獲得方法參見文獻(xiàn)[5]。

1.3.2 金針菇中總黃酮的提取 除去金針菇中雜質(zhì)，在50 ℃烘箱中干燥，使用高速萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎（粉碎之后過80目篩），稱取由此獲得的子實(shí)體干粉，放入錐形瓶中，用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（pH 6）混勻，料液比為1∶35（g/mL）。然后加入由等質(zhì)量的纖維素酶和木瓜蛋白酶混合而成的復(fù)合酶，酶用量為金針菇粉樣品量的1.00%。將錐形瓶置于恒溫水浴鍋中進(jìn)行酶解，溫度為50 ℃，時(shí)間為80 min。酶解結(jié)束后在115 ℃下高壓提取40 min。提取后離心，將上清液蒸發(fā)濃縮后用3倍體積的95%乙醇在4 ℃冰箱中沉淀12 h，離心，棄沉淀（含多糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)），上清液備用[5]。

1.3.3 大孔吸附樹脂的預(yù)處理 稱取ADS-8型大孔樹脂40 g置入250 mL具塞錐形瓶中，用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇浸泡24 h，然后用95%乙醇洗至流出的液體清亮、無(wú)渾濁為止，再用去離子水洗至液體無(wú)醇味。然后再分別用酸堿處理，即以濃度為5%（g/g）的HCl溶液浸泡4 h，用去離子水洗至中性，再用濃度為4%（g/g）的NaOH溶液浸泡4 h，用去離子水洗至中性，備用[6]。

1.3.4 樹脂靜態(tài)吸附和靜態(tài)解吸動(dòng)力學(xué)的研究

1）靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)研究。稱取已處理過的ADS-8型大孔樹脂2 g置于具塞錐形瓶中，然后加入濃度為1.76 mg/mL的金針菇黃酮樣品溶液100 mL，置于25 ℃、100 r/min的恒溫振蕩器中每隔2 h測(cè)定一次樣品液中總黃酮的濃度，測(cè)定時(shí)間設(shè)定為2、4、6、8、10、12 h，測(cè)定至大孔樹脂吸附飽和為止。繪制出大孔樹脂的靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線。

[吸附率=C1V1-C2V2C1V1×100%]? ? （1）

式中，C1、C2分別表示初始樣品液中黃酮濃度和吸附后溶液中黃酮濃度（mg/mL）;V1、V2分別表示初始樣品液的體積和吸附后溶液的體積（mL）。

2）靜態(tài)解吸動(dòng)力學(xué)研究。將經(jīng)過靜態(tài)吸附的大孔樹脂濾去上清液，然后用去離子水反復(fù)沖洗樹脂直至上清液不再渾濁，加入體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇溶液100 mL，密封，然后放入氣浴恒溫振蕩器中，設(shè)定溫度為25 ℃、速度為100 r/min振蕩12 h進(jìn)行解吸，在不同時(shí)間（2、4、6、8、10、12 h）分別測(cè)定解析液吸光度，然后繪制靜態(tài)解析曲線。

[解析率=C3V3C1V1-C2V2×100%]? ? （2）

式中，C1、C2、C3分別表示初始樣品液中黃酮濃度、吸附后溶液中黃酮濃度以及解析液濃度（mg/mL）;V1、V2、V3分別表示初始樣品液的體積和吸附后溶液的體積以及解析液體積（mL）。

1.4 樹脂純化金針菇黃酮工藝條件的優(yōu)化

1.4.1 樣品液pH對(duì)黃酮吸附率的影響 將5份等體積、質(zhì)量濃度為1.76 mg/mL的金針菇黃酮提取液用濃度為5%的鹽酸和濃度為2%的NaOH溶液調(diào)成pH為4.0、5.0、6.0、7.0和8.0，分別取60 mL于250 mL的裝有2 g預(yù)處理后樹脂的錐形瓶中，密封，并將其置于25 ℃、100 r/min恒溫振蕩器中振搖10 h，待其充分吸附后，靜止2 h，以速度為3 000 r/min離心10 min，分別測(cè)定上清液體積及其中的黃酮濃度，并計(jì)算黃酮吸附率。然后將樹脂用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液洗脫后再生備用。

1.4.2 樣品液濃度對(duì)黃酮吸附率的影響 將pH為5，濃度分別為0.64、1.19、1.76、2.29、2.87 mg/mL的金針菇黃酮樣品液32 mL于250 mL的裝有2 g預(yù)處理后樹脂的三角瓶中進(jìn)行試驗(yàn)，后續(xù)步驟同“1.4.1”。

1.4.3 洗脫劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮解析率的影響 將5份已飽和吸附金針菇黃酮的樹脂先用去離子水沖洗至流出液無(wú)色，再分別用100 mL乙醇體積分?jǐn)?shù)為 40%、50%、60%、70%、80%的洗脫劑在25 ℃、100 r/min條件下振蕩10 h進(jìn)行解吸。計(jì)算黃酮解析率。

1.4.4 洗脫劑用量對(duì)黃酮解析率的影響 將5份已飽和吸附金針菇黃酮的樹脂先用去離子水沖洗至流出液無(wú)色，再分別用80、100、120、140、160 mL乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%的洗脫劑在25 ℃，以100 r/min振蕩解吸10 h。計(jì)算黃酮解析率[7-9]。

1.5 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

分別取按最佳工藝條件純化所獲得的金針菇總黃酮解析液與純化前總黃酮樣品液放于烘箱中烘干，精確稱取烘干后物質(zhì)的干重，通過計(jì)算總黃酮在解析液及樣品液烘干后物質(zhì)中所占的比例，得到黃酮的純化倍數(shù)，重復(fù)3次。

1.6 抑菌圈法檢測(cè)純化后金針菇總黃酮的抑菌性

將活化后的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌4個(gè)菌種在37 ℃恒溫振蕩器中以轉(zhuǎn)速120 r/min連續(xù)培養(yǎng)至菌體濃度為1×106～1×107 CFU/mL（此時(shí)菌懸液在600 nm波長(zhǎng)處OD值為0.1）。

在LB固體培養(yǎng)基上均勻涂布各菌懸液0.1 mL后插入牛津杯。將純化后的金針菇黃酮樣品液用生理鹽水稀釋成不同質(zhì)量濃度，各取0.1 mL加入牛津杯中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后測(cè)量抑菌圈大小。所有試驗(yàn)均設(shè)3組平行，以生理鹽水作為對(duì)照 [10，11]。

1.7 金針菇黃酮的抗氧化性測(cè)定

通過測(cè)定金針菇黃酮對(duì)ABTS·的清除能力來(lái)檢測(cè)其抗氧化性[11，12]。

稱取ABTS 40.00 mg，加入去離子水10 mL，1.0 mg/mL的過硫酸鉀8.00 mL，室溫避光靜置16 h，然后轉(zhuǎn)移到250 mL容量瓶中，加32 mL去離子水，用無(wú)水乙醇定容至刻度，放置10 h備用。在5只試管中依次加入0.5 mL不同濃度的黃酮樣品溶液、1.5 mL 95%乙醇、2 mL按上述方法配好的ABTS溶液，混合，靜置，30 min后在734 nm波長(zhǎng)下測(cè)得吸光度A1;用2 mL去離子水代替ABTS溶液，其他步驟同上，測(cè)得吸光度A2;保留ABTS溶液，但以95%乙醇代替黃酮提取液，其他步驟同上，測(cè)出吸光度A0。同時(shí)以維生素C作為對(duì)照。

[ABTS·清除率=A0A1-A2A0×100%]? ? （3）

2 結(jié)果與分析

2.1 線性回歸方程

按照文獻(xiàn)[5]所述方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為y=0.146 1x-0.023 8（R2=0.999），其中y為吸光度，x為蘆丁濃度（mg/mL）。

2.2 樹脂靜態(tài)吸附和靜態(tài)解吸動(dòng)力學(xué)的研究結(jié)果

2.2.1 靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué) 樹脂靜態(tài)吸附曲線如圖1所示。由圖1可知，吸附時(shí)間為10 h時(shí)，吸附達(dá)到飽和。吸附時(shí)間不到10 h時(shí)樹脂吸附的不完全，而若超過10 h后繼續(xù)吸附則浪費(fèi)時(shí)間和能源，所以后續(xù)試驗(yàn)的吸附時(shí)間都取10 h。

2.2.2 靜態(tài)解析動(dòng)力學(xué) 樹脂靜態(tài)解析曲線如圖2所示。 由圖2可知，樹脂解析時(shí)間為10 h時(shí)，解析率達(dá)到最大，所以后續(xù)試驗(yàn)的解析時(shí)間都取10 h。

2.3 樹脂純化金針菇總黃酮工藝條件的優(yōu)化

2.3.1 樣品液pH對(duì)金針菇總黃酮吸附率的影響 當(dāng)樣品液pH為4.0、5.0、6.0、7.0和8.0時(shí)，金針菇中總黃酮吸附率分別為27.3%、38.1%、35.7%、33.7%、27.0%;當(dāng)樣品溶液pH為5.0時(shí)吸附率最大，隨著pH從5.0到8.0不斷升高，吸附率逐漸降低?？赡苁怯捎诮疳樄娇傸S酮是多羥基酚類化合物，呈弱酸性，在酸性條件時(shí)總黃酮能保持分子狀態(tài)可以形成氫鍵，有利于大孔吸附樹脂的吸附，而在堿性條件下總黃酮分子中羥基離子化，不利于氫鍵形成，從而導(dǎo)致吸附率降低。

2.3.2 樣品液濃度對(duì)金針菇總黃酮吸附率的影響 當(dāng)樣品液濃度為0.64、1.19、1.76、2.29、2.87 mg/mL時(shí)，金針菇中總黃酮吸附率分別為33.5%、36.9%、31.7%、31.2%、29.5%;樣品液濃度在1.19 mg/mL時(shí)吸附率最大，但當(dāng)樣品液濃度超過1.19 mg/mL后，吸附率逐漸下降?？赡苁且?yàn)楫?dāng)樣品液濃度過低時(shí)，樹脂吸附不完全，隨著樣品液濃度的增大，樹脂吸附量增加。而當(dāng)樣品液濃度過大時(shí)，與總黃酮競(jìng)爭(zhēng)樹脂吸附點(diǎn)的雜質(zhì)增多，所以飽和吸附率降低。

2.3.3 洗脫液體積分?jǐn)?shù)對(duì)金針菇總黃酮解析率的影響 當(dāng)洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%、70%、80%時(shí)，金針菇中總黃酮吸附率分別為52.3%、63.7%、70.6%、74.3%、51.0%;隨著洗脫液乙醇的體積分?jǐn)?shù)逐漸增大，解析率也逐漸增加，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)解析率最大，但超過70%后，解析率反而下降。可能是因?yàn)樵谙疵撘簼舛冗^大時(shí)會(huì)洗下大量雜質(zhì)，從而降低總黃酮解析率，而當(dāng)洗脫液濃度較小時(shí)則會(huì)導(dǎo)致總黃酮洗脫不完全而使洗脫效率變差。

2.3.4 洗脫劑用量對(duì)金針菇總黃酮解析率的影響 當(dāng)洗脫液乙醇用量為80、100、120、140、160 mL時(shí)，金針菇中總黃酮吸附率分別為51.7%、74.5%、81.3%、91.7%、91.7%;隨著洗脫劑用量的增加，解析率逐漸增大，在140 mL時(shí)達(dá)到最大值，即使用量繼續(xù)增大，解析率也不會(huì)再增大，所以洗脫液的最佳用量為140 mL。

2.3.5 工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 由表1可知，金針菇總黃酮解析液經(jīng)以上最佳工藝條件的純化，純化倍數(shù)為1.86倍。

2.4 純化后金針菇總黃酮的抑菌能力

對(duì)每個(gè)金針菇總黃酮濃度下3次平行試驗(yàn)所獲得的抑菌圈直徑取平均值，所得結(jié)果見表2。由表2可知，在0.25～0.65 mg/mL濃度范圍內(nèi)，對(duì)4個(gè)菌種的抑菌能力與金針菇總黃酮濃度呈正相關(guān)，抑菌程度大小順序?yàn)榇竽c桿菌>沙門氏菌>金黃色葡萄球菌>枯草芽孢桿菌。

2.5 金針菇總黃酮的抗氧化性

金針菇總黃酮和維生素C對(duì)ABTS·清除率的檢測(cè)結(jié)果見圖3。由圖3可知，在所測(cè)濃度范圍內(nèi)，2種物質(zhì)對(duì)ABTS·的清除能力都隨濃度增加而加強(qiáng)，在同濃度下，金針菇總黃酮的清除率弱于維生素C，但二者差距隨濃度提高而縮小。

3 小結(jié)

通過單因素試驗(yàn)對(duì)ADS-8型大孔吸附樹脂純化金針菇總黃酮的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化研究，并對(duì)純化后總黃酮的抑菌及抗氧化性進(jìn)行了檢測(cè)。根據(jù)研究結(jié)果得出如下結(jié)論：

1）ADS-8型大孔吸附樹脂純化金針菇總黃酮的最優(yōu)條件為樣品液pH為5，樣品液濃度為1.19 mg/mL，洗脫液乙醇的體積分?jǐn)?shù)為70%，乙醇體積為140 mL。在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，金針菇總黃酮的純化倍數(shù)為1.84倍。

2）抑菌性研究結(jié)果表明，金針菇總黃酮對(duì)4種測(cè)試菌均顯示出抑菌效果，且抑菌能力與金針菇總黃酮濃度呈正相關(guān)。對(duì)4種菌的抑菌能力排列順序?yàn)榇竽c桿菌>沙門氏菌>金黃色葡萄球菌>枯草芽孢桿菌。

3）抗氧化研究結(jié)果表明，金針菇總黃酮對(duì)ABTS·具有一定的清除能力，顯示其具有一定的抗氧化能力，且隨著總黃酮濃度的增大而增強(qiáng)，但其抗氧化性弱于同濃度下的維生素C。

綜上所述，利用ADS-8型大孔樹脂對(duì)金針菇總黃酮進(jìn)行純化的工藝可行，為金針菇總黃酮的開發(fā)利用提供了參考。

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