混生荒漠植物葉片功能性狀與其根際微生物多樣性的關(guān)系

李善家，王輝，茍偉，伍國(guó)強(qiáng)，蘇培璽

1.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730050；2.中國(guó)科學(xué)院西北生態(tài)環(huán)境資源研究院，甘肅 蘭州 730000

在植物長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，C3與 C4植物表現(xiàn)出不同的環(huán)境適應(yīng)策略（Chen et al.，1996；Fernández et al.，2019；Ripley et al.，2010；Zhu et al.，2008）。有些植物在特定生境下混生，混生的一個(gè)重要特征是種間結(jié)合，它們適應(yīng)極端環(huán)境的能力高于單生種群，比如C3與C4植物在外界干旱、鹽堿等逆境脅迫下的混生通常表現(xiàn)出相互促進(jìn)的關(guān)系（Gross et al.，2010；Pugnaire et al.，2001；Tewksbury et al.，2001）。包括提高C3植物葉片光化學(xué)反應(yīng)速率、水分利用效率（蘇銘等，2018）、生物量（韓梅等，2006）和存活率等（Franks，2003），并降低了C4植物在逆境中生長(zhǎng)的優(yōu)越性（Su et al.，2012）。在中國(guó)西部干旱內(nèi)陸地區(qū)，由 C3植物紅砂（Reaumuriasongarica）和 C4植物珍珠豬毛菜（Salsolapasserina）共同構(gòu)成的超旱生小半灌木層片在黑河山前荒漠生境下普遍存在（丘明新等，1982）。在C3紅砂和C4珍珠豬毛菜種間混生區(qū)域中，有時(shí)紅砂和珍珠豬毛菜獨(dú)立生長(zhǎng)，稱(chēng)為單生；有時(shí)兩者常常緊密的結(jié)合生長(zhǎng)在一起，稱(chēng)為聯(lián)生，這種種間聯(lián)合的程度隨外界生境的變化而變化（Su et al.，2012），顯示了C3紅砂和C4珍珠豬毛菜的聯(lián)生是適應(yīng)環(huán)境的客觀方式。葉片功能性狀量化了植物在環(huán)境脅迫下的權(quán)衡策略，并與根際微生物結(jié)構(gòu)密切相關(guān)（Pandey et al.，2019）。通過(guò)對(duì)聯(lián)生C3紅砂和 C4珍珠豬毛菜根際微生物群落結(jié)構(gòu)的研究可以解釋其葉片功能性狀適應(yīng)環(huán)境的變化規(guī)律。

根際微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的變化對(duì)植物生長(zhǎng)、植物演替和其他關(guān)鍵功能有重要影響（Bever，1994）。根際微生物包括根際促生細(xì)菌和菌根真菌，促生細(xì)菌可以增強(qiáng)植物在逆境脅迫下對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力，如提高了植物鮮重（Abdel et al.，2020；Chiappero et al.，2019）、光合效率（Hmaeid et al.，2019）、葉面積和葉綠素含量，并增強(qiáng)葉片養(yǎng)分吸收能力（Anbi et al.，2020；Chiappero，2019；Hmaeid，2019；Mia et al.，2010；Pandey et al.，2019）、降低植物葉片滲透壓（Abdel et al.，2020）；菌根真菌與植物界 80%以上的植物根際共生（Borkowska，2002），為葉片提供了水分和養(yǎng)分（Brundrett，2002）。菌根真菌可以提高植物光化學(xué)反應(yīng)速率、葉綠素含量（Mikiciuk et al.，2019；Sheng et al.，2008；Zhu et al.，2012），還可以使葉相對(duì)含水量、葉面積（Birhane et al.，2012）和葉水勢(shì)（Porcel et al.，2004）等葉片水分生理功能性狀受到影響。其中根際促生細(xì)菌和菌根真菌之間也存在相互作用（Boer et al.，2005）。在干旱、鹽堿等逆境條件下，很多研究表明，根際促生細(xì)菌和菌根真菌的協(xié)同作用，通常對(duì)植物適應(yīng)逆境發(fā)揮積極作用（Khajeeyan et al.，2019；Kohler et al.，2008）。

在中國(guó)西北干旱區(qū)，水分是影響植物葉片功能性狀的一個(gè)關(guān)鍵因子（Haase et al.，1999）?；诖耍狙芯恳院诤恿饔蛏角案瓯贑3植物紅砂與C4植物珍珠豬毛菜形成的混生區(qū)域?yàn)檠芯繉?duì)象，研究混生荒漠植物根際微生物多樣性對(duì)其葉片水分生理功能性狀的影響，旨在探究荒漠環(huán)境下根際微生物在聯(lián)生植物生存策略中所起的作用，為植物與微生物相互作用關(guān)系研究提供科學(xué)理論依據(jù)。具體內(nèi)容包括：（1）分析混生荒漠植物根際微生物（細(xì)菌、真菌）多樣性組成與結(jié)構(gòu)；（2）比較珍珠豬毛菜、紅砂葉片水分生理功能性狀；（3）揭示根際微生物多樣性指數(shù)與功能性狀之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域與樣品采集

2018年8月中旬，研究區(qū)位于黑河流域山前戈壁（38°54′N(xiāo)，100°15′E），是珍珠豬毛菜、紅砂的荒漠灌木混生區(qū)域。海拔 1590 m，屬溫帶大陸性氣候，年均氣溫為6—8 ℃，年均降水量為130 mm，年蒸發(fā)量達(dá) 2000—2350 mm。戈壁土質(zhì)干旱、鹽堿程度高，常為粗砂、礫石。珍珠豬毛菜平均株高58 cm，冠幅854 cm2，葉片呈球狀；紅砂平均株高53 cm，冠幅879 cm2，葉片為短小棒狀，常常聯(lián)生在一起。

在采樣區(qū)隨機(jī)采集長(zhǎng)勢(shì)良好，大小一致的聯(lián)生珍珠豬毛菜（Associated growthSalsolapasserina，AGSP），聯(lián)生紅砂（Associated growthReaumuria songarica，AGRS），單生珍珠豬毛菜（Isolation growthSalsolapasserina，IGSP），單生紅砂（Isolation growthReaumuriasongarica，IGRS）各5—10株。然后分別將4種植物地上部置于保鮮箱中保藏，以防水分散失。分別挖取4種植物地下部，先去除根部結(jié)合疏松的土壤，然后用無(wú)菌刷分別小心刷取植物與根部結(jié)合緊密的土壤，過(guò)100目篩，用無(wú)菌離心管分裝，野外放置于-40 ℃保鮮箱中保存，備土壤微生物基因組DNA提取及微生物多樣性分析。

1.2 方法

1.2.1 葉片功能性狀測(cè)定

在野外09:00—11:00使用WP4-T露點(diǎn)水勢(shì)儀（Decagon，USA）對(duì)新鮮、長(zhǎng)勢(shì)一致的葉片水勢(shì)[LWP/MPa]進(jìn)行測(cè)定，并分別稱(chēng)取AGSP、AGRS、IGSP、IGRS的葉片鮮質(zhì)量（m1，g），葉面積（S，cm2）用 LI-3100葉面積儀（LI-COR，USA）進(jìn)行測(cè)定，葉體積（V，cm3）用5 mL量筒排水法換算測(cè)定，浸入水中4—6 h后稱(chēng)取飽和鮮質(zhì)量（m2，g），在80 ℃烘箱干燥至恒質(zhì)量后，測(cè)定其干質(zhì)量（m3，g）；分別計(jì)算出總含水量[TWC=(m1-m3)×m1-1×100%]；相對(duì)含水量[RWC=(m1-m3)×(m2-m3)-1×100%]；比葉面積[SLA/(cm2·g-1)=S×m3-1]；比葉體積[SLV/(cm3·g-1)=V×m3-1]；比葉質(zhì)量[LMA/(g·cm-2)=m3×S-1]。自由水含量（FW）的測(cè)定：選取新鮮的植物葉片置于稱(chēng)量瓶中，加入等量60%蔗糖溶液后置于暗處 4 h，其間不時(shí)輕輕搖動(dòng)。到預(yù)定的時(shí)間后，充分搖動(dòng)溶液。分別用阿貝折射儀測(cè)定糖液濃度，同時(shí)測(cè)定原來(lái)的糖液濃度。設(shè)稱(chēng)量瓶質(zhì)量為（m1，g），稱(chēng)量瓶與葉片的質(zhì)量為（m2，g），稱(chēng)量瓶與葉片及糖液的質(zhì)量為（m3，g），糖液原來(lái)的濃度為（c1，mol·L-1），浸過(guò)植物組織后糖液的糖液的濃度為（c2，mol·L-1）。葉片穩(wěn)定碳同位素（δ13C，‰）用MAT-253穩(wěn)定碳同位素質(zhì)譜儀測(cè)定，分析結(jié)果均相對(duì)于國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) PDB（Pee Dee River Belemnites Standard）。計(jì)算珍珠豬毛菜、紅砂葉片自由水含量和δ13C質(zhì)量分?jǐn)?shù)的公式如下：

ω(13C)l/ω(12C)l為植物葉片13C與12C的比率，ω(13C)s/ω(12C)s為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)PDB中13C與12C的比率。

1.2.2 根際微生物多樣性測(cè)序

使用MoBio土壤微生物DNA強(qiáng)力提取試劑盒（ PowerSoil? DNA Isolation Kit，MO BIO Laboratories）對(duì)AGSP、AGRS、IGSP、IGRS根際土分別進(jìn)行基因組DNA提取，提取的基因組DNA做0.7%瓊脂糖凝膠電泳，并通過(guò)260 nm/280 nm和260 nm/230 nm之比評(píng)估DNA的質(zhì)量和數(shù)量。提取的細(xì)菌和真菌基因組進(jìn)行 16S-rDNA V4+V5區(qū)和ITS1區(qū)PCR擴(kuò)增（細(xì)菌引物為：F5'-GTGYCAGCMG CCGCGGTAA-3'；R5'-CCGYCAATTYMTTTRAG TT-3'；真菌引物為：F5'-CTTGGTCATTTAGAGGAA GTAA-3'；R5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3')與純化（1.8%的瓊脂糖凝膠電泳）。目的片段分別用DNA純化試劑盒（MinElute? PCR Purification Kit）回收，最后將純化產(chǎn)物進(jìn)行Illumina Hiseq 2500高通量測(cè)序。

PCR 50 μL體系：基因組DNA（50 ng），引物（10 μmol·L-1，1.5 μL），Q5 High-Fidelity DNA Polymerase（0.2 μL），High GC Enhancer（10 μL），PCR Buffer（10 μL），dNTP（1 μL），ddH2O 補(bǔ)至總體系 50 μL。

PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min之后，以95 ℃ 1 min；50 ℃ 1 min；72 ℃ 1 min 循環(huán) 15次，72 ℃末端延伸7 min，4 ℃保溫。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)

16S-rDNA先進(jìn)行 PE reads拼接（FLASH v1.2.7）得到Raw Tags，然后通過(guò)Raw Tags過(guò)濾（Trimmomatic v0.33），得到Clean Tags，接著去除嵌合體（UCHIME v4.2）得到Effective Tags。在相似性97%的水平上，以0.005%作為閾值，進(jìn)行OTU聚類(lèi)（QIIME version 1.8.0）。并在Silva（細(xì)菌）和UNITE（真菌）分類(lèi)學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（置信度閾值為0.8）上對(duì)OTU進(jìn)行分類(lèi)學(xué)注釋?zhuān)≧DP Classifier version 2.2）?；谝逊诸?lèi)的OTU進(jìn)行細(xì)菌和真菌Alpha多樣性（Chao1指數(shù)、Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)）分析（Mothur version v.1.30），計(jì)算Alpha多樣性公式如下：

Chao1指數(shù)：

Sobs為觀測(cè)到的OTU數(shù)，n1為只有一條序列的OTU數(shù)，n2為只有兩條序列的OTU數(shù)。

Simpson指數(shù)：

Sobs為樣品中總物種數(shù)目，N為樣品總個(gè)體數(shù)，ni為第i種個(gè)體數(shù)。

采用單因素方差分析（One-way ANOVATurkey HSD）法，分析AGSP、AGRS、IGSP、IGRS 4種植物樣品的TWC、FW、RWC、LWP、LMA、SLA、SLV、δ13C 8個(gè)水分生理功能性狀差異顯著性并進(jìn)行多重比較（P＜0.05）。用Pearson相關(guān)系數(shù)分析8個(gè)水分生理功能性狀和根際細(xì)菌與真菌α多樣性指數(shù)的相關(guān)性，并進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)（P＜0.05）。用冗余分析（RDA）說(shuō)明4種植物葉片功能性狀之間的變異、相似性和根際微生物多樣性與葉片功能性狀的關(guān)系，并用蒙特卡羅檢驗(yàn)（monte-carlo test）約束軸的顯著性。以上分析都由R（3.5.2）完成（Pearson相關(guān)性和冗余分析由psych包和vegan包完成）。

2 結(jié)果與分析

2.1 混生荒漠植物葉片功能性狀特征

分析混生荒漠植物群落珍珠豬毛菜和紅砂的 8個(gè)葉片功能性狀后發(fā)現(xiàn)，珍珠豬毛菜TWC變化范圍為 68.54%—80.76%；FW 變化范圍為 66.82%—78.56%；SLV 變化范圍為 3.65—5.34 cm3·g-1；δ13C變化范圍為-17.73‰— -16.32‰；RWC變化范圍為56.64%—69.04%；SLA變化范圍為24.52—34.63 cm2·g-1；LMA 變化范圍為 0.029—0.041 g·cm-2；LWP變化范圍為-12.36— -7.86 MPa。紅砂TWC變化范圍為 52.42%—62.21%；FW 變化范圍為49.52%—60.82%；SLV變化范圍為 1.26—2.84 cm3·g-1；δ13C 變化范圍為-24.21‰— -25.62‰；RWC變化范圍為62.12%—68.73%；SLA變化范圍為 13.70—24.63 cm2·g-1；LMA 變化范圍為 0.041—0.073 g·cm-2；LWP 變化范圍為-12.89— -9.23 MPa。C4植物珍珠豬毛菜的TWC、FW、SLV、δ13C均顯著（P＜0.05）高于 C3植物紅砂（圖 1），表明C4植物珍珠豬毛菜組織或器官的代謝活動(dòng)旺盛，C3植物紅砂生長(zhǎng)緩慢、抗性較強(qiáng)。

單生與聯(lián)生珍珠豬毛菜 LWP的變化范圍分別為-7.86— -8.42、-10.62— -12.36 MPa，單生與聯(lián)生紅砂 LWP的變化范圍分別為-9.23— -11.02、-11.26— -12.89 MPa。單生與聯(lián)生珍珠豬毛菜RWC的變化范圍分別為65.87%—69.04%、56.64%—58.76%。C3植物紅砂和 C4植物珍珠豬毛菜的聯(lián)生，顯著（P＜0.05）降低了兩種植物的LWP，同時(shí)顯著（P＜0.05）降低了珍珠豬毛菜的RWC。與單生植株相比，植株的聯(lián)生沒(méi)有顯著影響SLA和LMA，但是消除了單生植株 SLA和 LMA的顯著性差異（P＜0.05）。

2.2 混生荒漠植物根際土壤微生物群落組成分析

OTU序列代表物種分類(lèi)信息，利用Venn圖可以分析AGSP、AGRS、IGSP、IGRS根際細(xì)菌和真菌之間共有的或特有的 OTU數(shù)目，直觀地表現(xiàn)出根際細(xì)菌和真菌間OTU的重合情況。如圖2所示，AGSP、AGRS、IGSP、IGRS共有細(xì)菌OTUs有92個(gè)，共有真菌OTUs有202個(gè)。珍珠豬毛菜和紅砂的聯(lián)生，使得珍珠豬毛菜和紅砂 OTU數(shù)目總量增加，根際微生物珍珠豬毛菜特有的根際細(xì)菌 OTUs由原來(lái)的123個(gè)增加到131個(gè)，根際真菌由75個(gè)增加到116個(gè)，紅砂特有的根際細(xì)菌OTUs由原來(lái)的118個(gè)增加到313個(gè)；但是在紅砂特有的根際真菌中，聯(lián)生并沒(méi)有導(dǎo)致根際真菌OTUs的增加，反而使得紅砂OTUs總量降低。

圖1 混生荒漠植物珍珠豬毛菜、紅砂葉片功能性狀比較Fig.1 Comparison of the functional traits of the leaves of mixed desert plants Salsola passerina and Reaumuria songarica

圖2 混生荒漠植物珍珠豬毛菜、紅砂根際細(xì)菌和真菌OTUs Venn圖Fig.2 OTUs Venn map of mixed desert plants Salsola passerina, Reaumuria songarica rhizosphere bacteria and fungi

在 Silva（細(xì)菌）和 UNITE（真菌）分類(lèi)學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)上對(duì) OTU進(jìn)行分類(lèi)學(xué)注釋后，在門(mén)分類(lèi)水平上檢測(cè)出AGSP、AGRS、IGSP、IGRS中細(xì)菌分別有22、26、22、25個(gè)門(mén)，真菌門(mén)數(shù)相同，都有13個(gè)。在4個(gè)樣品中，前10個(gè)共有細(xì)菌類(lèi)群分別占細(xì)菌總類(lèi)群的 96.2%、96.1%、96.8%、96.6%。其中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類(lèi)群（豐度≥1%）為：變形菌門(mén)（Proteobacteria）、放線菌門(mén)（Actinobacteria）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、浮霉菌門(mén)（Planctomycetes）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）、藍(lán)細(xì)菌門(mén)（Cyanobacteria）、芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）和疣微菌門(mén)（Verrucomicrobia）。前10個(gè)共有真菌類(lèi)群分別占真菌總類(lèi)群的92.5%、93.4%、94.4%、92.2%，見(jiàn)圖3。優(yōu)勢(shì)真菌類(lèi)群（豐度≥1%）為：子囊菌門(mén)（Ascomycota）、擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota）、被孢霉門(mén)（Mortierellomycota）和壺菌門(mén)（Chytridiomycota）。

對(duì)AGSP、AGRS、IGSP、IGRS細(xì)菌門(mén)分類(lèi)水平上的比較可知，前 10個(gè)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)中，僅有紅砂細(xì)菌的藍(lán)細(xì)菌門(mén)（Cyanobacteria）（3.9%）的相對(duì)豐度顯著（P＜0.05）高于珍珠豬毛菜（1.3%）；其他門(mén)細(xì)菌相對(duì)豐度無(wú)顯著（P＞0.05）變化。紅砂和珍珠豬毛菜的聯(lián)生，也沒(méi)有引起前 10個(gè)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)的相對(duì)豐度顯著變化。在真菌門(mén)分類(lèi)水平上，植株類(lèi)別和單生聯(lián)生均未顯著（P＞0.05）改變優(yōu)勢(shì)真菌的相對(duì)豐度。

Chao1、Shannon和Simpson指數(shù)是衡量物種α多樣性的常用指標(biāo)，其中Chao1指數(shù)衡量物種豐度的大小，Chao1指數(shù)越大，物種豐富度越高；用Shannon和Simpson指數(shù)衡量物種多樣性，Shannon指數(shù)值越大，Simpson指數(shù)值越小，物種均勻度越高。由表1可知，珍珠豬毛菜和紅砂的聯(lián)生導(dǎo)致細(xì)菌豐富度與細(xì)菌多樣性均高于單生植株。聯(lián)生珍珠豬毛菜的真菌豐富度與多樣性均高于單生珍珠，而聯(lián)生紅砂的真菌豐富度與多樣性均低于單生紅砂。

2.3 根際微生物多樣性與葉片功能性狀的聯(lián)系

分別利用混生植物根際細(xì)菌、真菌多樣性與葉片功能性狀進(jìn)行冗余分析（RDA），以 α多樣性指數(shù)（Chao1、Simpson、Shannon）為環(huán)境解釋變量，F(xiàn)W、TWC、RWC、LWP、SLA、SLV、δ13C 為功能響應(yīng)變量來(lái)揭示兩者之間的相互關(guān)系。結(jié)果顯示，蒙特卡羅置換檢驗(yàn)（monte-carlo test）約束軸前兩軸均顯著。細(xì)菌和真菌調(diào)整R2值之后，第一軸解釋了總體變量的71.78%，前兩軸共解釋了總體變量的76.82%。第一軸可以區(qū)分紅砂和珍珠豬毛菜之間物種葉片功能性狀差異，第二軸可以區(qū)分不同物種的單生聯(lián)生。植株的聯(lián)生會(huì)使植物葉片功能性狀發(fā)生變異，并且C4植物珍珠豬毛菜比C3植物紅砂變異程度更大。真菌α多樣性與葉片功能性狀之間的相互關(guān)系中，前兩軸與細(xì)菌解釋度相同。細(xì)菌的Chao1指數(shù)與葉片 TWC、FW、LWP顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），細(xì)菌 Simpson指數(shù)與 LWP顯著正相關(guān)（P＜0.05）、Shannon指數(shù)與 LWP顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。真菌Chao1指數(shù)均與TWC、FW、SLA、SLV、LMA、LWP顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），Shannon指數(shù)與RWC、LWP顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）（圖4、表 2）。

圖3 混生荒漠植物珍珠豬毛菜、紅砂根際細(xì)菌和真菌在門(mén)水平上的組成Fig.3 The composition of the mixed desert plants Salsola passerina, Reaumuria songarica rhizosphere bacteria and fungi at the Phylum level

表1 根際細(xì)菌和真菌α多樣性指數(shù)Table 1 Rhizosphere bacteria and fungi alpha diversity index

3 討論

植物功能性狀反映了物種對(duì)其生長(zhǎng)環(huán)境的長(zhǎng)期適應(yīng)和響應(yīng)，植物的各個(gè)性狀之間也存在著相互依賴(lài)和相互制約的關(guān)系，反映了植物適應(yīng)環(huán)境的生存策略（Reich et al.，2003）。在干旱荒漠條件下，通過(guò)對(duì)C4植物珍珠豬毛菜和C3植物紅砂葉片功能性狀特征進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn) C4植物的 TWC、FW、SLV、δ13C均顯著高于C3植物紅砂。葉片含水量是植物水分平衡的最重要特征之一，可以反映出植物組織或器官的代謝活動(dòng)（Zargar et al.，2019）。這與大多數(shù)研究結(jié)果相似，C4植物珍珠豬毛菜比 C3植物紅砂在干旱荒漠地區(qū)的生長(zhǎng)具有優(yōu)勢(shì)，這是 C4植物長(zhǎng)期的遺傳生理結(jié)構(gòu)與外界環(huán)境相互作用的綜合結(jié)果（Edwards et al.，2008；Taylor et al.，2014）。葉片TWC、FW含量高，植物代謝活動(dòng)旺盛，生長(zhǎng)速率較快，對(duì)逆境抗性弱；反之，植物生長(zhǎng)速率慢，對(duì)逆境抗性強(qiáng)。SLV反映出植物的耐旱力，通常與有機(jī)物質(zhì)的獲取和環(huán)境適應(yīng)特征有關(guān)，在干旱脅迫下，葉片一般表現(xiàn)出較小的SLV（李善家等，2013）。δ13C值則可以反映出植物的長(zhǎng)期水分利用效率（Canavar et al.，2014；Condon et al.，2002）。LWP是植物對(duì)干旱脅迫適應(yīng)的一個(gè)重要指標(biāo)（Elsayed et al.，2011）。在干旱脅迫下，通常葉片維持低 LWP有利于從地下部吸收水分。無(wú)論珍珠豬毛菜還是紅砂，聯(lián)生植株的LWP均與單生植株相比顯著降低，即珍珠豬毛菜與紅砂的種間聯(lián)生增強(qiáng)了對(duì)水分和資源的獲取能力，也增強(qiáng)了對(duì)干旱脅迫的適應(yīng)能力。珍珠豬毛菜和紅砂的聯(lián)生，還消除了 SLA和LMA的顯著性差異，即聯(lián)生珍珠豬毛菜的SLA降低，LMA升高，相反，聯(lián)生紅砂SLA升高，LMA降低。SLA和LMA通常反映出植物葉片水分利用效率和資源分配策略（Wellstein et al.，2017；Zhou et al.，2020），SLA與植物的用水策略有關(guān)（Wright et al.，2001），并且與基本的植物功能緊密結(jié)合（Hulshof et al.，2013），SLA越小，LMA越大，導(dǎo)致了葉片組織越致密，抗旱能力越強(qiáng)。這種種間聯(lián)生，顯示了在干旱脅迫環(huán)境下的種間互補(bǔ)。以上的研究結(jié)果顯示，聯(lián)生降低了C4植物珍珠豬毛菜在逆境下的資源獲取能力，并提高了C3植物紅砂的適應(yīng)能力。

圖4 混生荒漠植物珍珠豬毛菜、紅砂葉片功能性狀與根際細(xì)菌和真菌多樣性冗余分析Fig.4 Redundancy analysis of leaf functional characters and diversity of rhizosphere bacteria and fungi of mixed desert plants Salsola passerina,Reaumuria songarica

表2 根際微生物α多樣性與混生植物葉片功能性狀相關(guān)性Table 2 Correlation between rhizosphere microbial alpha diversity and mixed plant leaf functional traits

植物葉片功能性狀與遺傳和外界環(huán)境密切相關(guān)，葉片功能性狀的變化反應(yīng)出植物在特定環(huán)境下的生存策略。在嚴(yán)酷生境下，植物對(duì)資源的利用和分配尤為重要。植物依賴(lài)土壤基質(zhì)生長(zhǎng)，幾乎所有的碳水化合物、礦質(zhì)元素等支撐植物生長(zhǎng)所需要的物質(zhì)都來(lái)源于根系在土壤中的吸收（Hacquard et al.，2015），所以植物根系環(huán)境對(duì)植物的影響至關(guān)重要（Motte et al.，2018）。并且植物根系在生長(zhǎng)過(guò)程中也向土壤中分泌根際分泌物。有研究顯示，根系中根系分泌物和植物殘?bào)w占光合產(chǎn)物40%（Motte et al.，2018），主要以糖類(lèi)化合物、有機(jī)酸、氨基酸等有機(jī)物的形式存在（Richardson et al.，2009）。根系分泌物的組成決定了根際微生物數(shù)量和結(jié)構(gòu)分布（Eisenhauer et al.，2017），微生物是土壤與根系物質(zhì)交互過(guò)程中的主要驅(qū)動(dòng)力，即根際微生物群落通過(guò)自身的生命活動(dòng)在植物根際形成微環(huán)境，進(jìn)而來(lái)影響植物的生長(zhǎng)。本文通過(guò)對(duì)C4珍珠和C3紅砂，單生和聯(lián)生植株之間的根際細(xì)菌、真菌在門(mén)水平上的分析，結(jié)果顯示，在單生植株中，C4珍珠細(xì)菌和真菌的豐富度（OTU、Chao1）均低于C3紅砂，C4珍珠和 C3紅砂種間聯(lián)生之后，珍珠紅砂根際細(xì)菌、C4珍珠豬毛菜根際真菌的豐富度和均勻度（Simpson、Shannon）大幅提高，但引起C3紅砂根際真菌豐富度和均勻度下降。細(xì)菌相對(duì)豐度（≥1%）的前十門(mén)中，變形菌門(mén)（Proteobacteria）、放線菌門(mén)（Actinobacteria）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）、疣微菌門(mén)（Verrucomicrobia）對(duì)植物根際營(yíng)養(yǎng)及礦質(zhì)元素的吸收起重要作用。眾多研究表明，變形菌門(mén)與土壤 pH、總碳、總氮含量呈顯著正相關(guān)，放線菌門(mén)與土壤總氮含量呈顯著正相關(guān)（Nacke et al.，2011）。酸桿菌門(mén)與土壤總碳含量、氮含量和碳氮比之間呈負(fù)相關(guān)（Chroňáková et al.，2015；Will et al.，2010）。綠彎菌門(mén)與土壤總氮和鉀含量呈正相關(guān)（Sousa et al.，2020）。綠彎菌門(mén)和厚壁菌門(mén)均與纖維素降解相關(guān)。疣微菌門(mén)與土壤氮、磷、鉀、鈣和鎂的含量相關(guān)（Bao et al.，2019）。根際真菌豐度最高的前十門(mén)中，子囊菌門(mén)（Ascomycota）和擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota）的豐度占總真菌的80%。子囊菌門(mén)參與土壤中纖維素的分解（Stursova et al.，2012），與土壤有機(jī)碳，總氮呈正相關(guān)關(guān)系，而擔(dān)子菌門(mén)與之呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（Bastida et al.，2013）。有研究顯示，根際土壤細(xì)菌與真菌之間也存在互作現(xiàn)象。本研究發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌優(yōu)勢(shì)門(mén)中的變形菌門(mén)、放線菌門(mén)、厚壁菌門(mén)還可以作為輔助細(xì)菌促進(jìn)真菌與植物根系共生（Frey-Klett et al.，2007）。根際微生物不僅可以影響寄主植物根系發(fā)育（Brundrett，2002），而且大多與固氮、溶磷作用密切相關(guān)，同時(shí)可以加強(qiáng)對(duì)植物根系對(duì)資源的獲取和利用（Bashan et al.，2010）。Adesemoye et al.（2008）通過(guò)研究微生物菌劑對(duì)玉米吸收養(yǎng)分中的作用，發(fā)現(xiàn)微生物菌劑可以增加玉米養(yǎng)分含量和整個(gè)植物的生長(zhǎng)，并使土壤中氮、磷、鉀的含量降低，增強(qiáng)了植物對(duì)土壤養(yǎng)分的吸收。而土壤養(yǎng)分對(duì)于植物葉片性狀的影響至關(guān)重要（張慧文等，2010）。所以根際微生物在影響植物葉片功能性狀中起間接作用。植物-土壤-根際微生物之間的物質(zhì)交流是一個(gè)龐大而又復(fù)雜的交互系統(tǒng)，同時(shí)在特定的環(huán)境下，植物葉片功能性狀是多因素共同決定的結(jié)果，葉片功能性狀也是植物適應(yīng)環(huán)境的綜合權(quán)衡。

以上分析表明，聯(lián)生珍珠豬毛菜（AGSP）、聯(lián)生紅砂（AGRS）、單生珍珠豬毛菜（IGSP）和單生紅砂（IGRS）根際細(xì)菌、真菌在優(yōu)勢(shì)門(mén)水平中的組成并無(wú)很大差異。而α多樣性分析顯示，C4珍珠豬毛菜和C3紅砂之間的種間聯(lián)生使得根際細(xì)菌、真菌豐富度和均勻度發(fā)生變化，這種根際微生物的變化是否可以解釋C4珍珠豬毛菜和C3紅砂種間聯(lián)生引起的葉片功能性狀的改變？通過(guò)冗余分析（RDA）和Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，根際細(xì)菌和真菌的豐富度與均勻度均與LWP呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系；SLA、SLV、LMA主要受真菌豐富度的影響，與之顯著負(fù)相關(guān)?？傊仓甑穆?lián)生提高根際細(xì)菌和真菌的豐富度與均勻度，導(dǎo)致葉片SLA、LWP降低，增強(qiáng)了聯(lián)生植物在荒漠干旱環(huán)境中的抗旱能力。

4 結(jié)論

對(duì)聯(lián)生珍珠豬毛菜、聯(lián)生紅砂、單生珍珠豬毛菜和單生紅砂葉片功能性狀分析表明，C4珍珠豬毛菜總含水量（TWC）、自由水含量（FW）、比葉體積（SLV）、δ13C均顯著高于 C3植物紅砂。C4珍珠豬毛菜與C3紅砂的聯(lián)生，不僅顯著降低了兩種植物的葉水勢(shì)（LWP），而且消除了單生珍珠豬毛菜與單生紅砂比葉面積（SLA）和比葉重（LMA）的顯著性差異。同時(shí)兩種植物的種間聯(lián)生，也提高了根際土壤細(xì)菌的數(shù)量和多樣性。根際微生物與植物葉片功能性狀的相互關(guān)系表明：C4珍珠豬毛菜和 C3紅砂根際細(xì)菌和真菌的豐富度（Chao1）與均勻度（Shannon）均與葉水勢(shì)（LWP）顯著負(fù)相關(guān)；比葉面積（SLA）、比葉體積（SLV）與真菌豐富度顯著負(fù)相關(guān)。總之，C4珍珠豬毛菜和C3紅砂的種間聯(lián)生，體現(xiàn)了植物在嚴(yán)酷荒漠生境中的生存策略。