血紅蛋白A2在靜止型和標(biāo)準(zhǔn)型α-地中海貧血篩查中的價(jià)值探討

王玉霞 戴慶福 林玉梅 盧永芳 曹春芳

地中海貧血（地貧）是由于珠蛋白鏈合成減少或缺乏所致的一種遺傳性溶血性貧血，是我國(guó)南方地區(qū)最常見(jiàn)、危害最大的單基因遺傳病之一，其中廣西、廣東、海南最為嚴(yán)重[1]，福建亦為地貧高發(fā)區(qū)[2]。臨床上根據(jù)珠蛋白肽鏈?zhǔn)軗p類別的不同，主要分為α-地貧和β-地貧兩種，以α地貧為主，尤其以東南亞缺失型常見(jiàn)[3]。由于中、重型α-地貧患者預(yù)后不良，現(xiàn)階段尚無(wú)根治的方法，因此，如何有效開(kāi)展婚前、孕前篩查及時(shí)發(fā)現(xiàn)基因攜帶者和加強(qiáng)產(chǎn)前診斷是防止重型地貧兒出生的有效手段。目前，臨床上地貧的診斷主要依賴常規(guī)血液分析各紅細(xì)胞參數(shù)，再進(jìn)行血紅蛋白電泳，根據(jù)HbA2含量降低或升高初步分為α或β-地貧者，最后進(jìn)行基因診斷分型。一般認(rèn)為HbA2含量降低（<2.5%）疑為α-地貧，但靜止型和標(biāo)準(zhǔn)型α-地貧患者其含量常出現(xiàn)降低不明顯或正?，F(xiàn)象，極易導(dǎo)致被漏篩[4-5]。為進(jìn)一步了解HbA2對(duì)α-地貧初篩的效果，本研究對(duì)近年來(lái)檢出的靜止型和標(biāo)準(zhǔn)型α-地貧患者的HbA2含量與基因檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了相關(guān)性研究，并對(duì)可能影響HbA2檢測(cè)結(jié)果的缺鐵因素進(jìn)行分析，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2013年5月-2017年12月，在筆者所在醫(yī)院進(jìn)行血液分析、血紅蛋白電泳篩查、血清鐵蛋白及地貧基因檢測(cè)的疑為地中海貧血的8 979例患者為研究對(duì)象，其中男1 167例，女7 811例，年齡1～90歲，平均（46.56±3.31）歲。疑似地貧患者診斷標(biāo)準(zhǔn)：（1）血細(xì)胞分析指標(biāo)MCV<80 fl或MCH<27 pg；（2）無(wú)其他感染性疾病或血液性疾??；（3）無(wú)其他嚴(yán)重內(nèi)科慢性疾病或并發(fā)癥。地貧缺鐵組及對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）通過(guò)地貧基因檢測(cè)確診為靜止型和標(biāo)準(zhǔn)型患者；（2）血清鐵蛋白檢測(cè)結(jié)果，男性<30 μg/L，女性<15μ g/L；（3）對(duì)照組為血細(xì)胞分析指標(biāo)MCV<80 fl或MCH<27 pg，但地貧基因檢測(cè)正常且血清鐵蛋白檢測(cè)男性<30 μg/L，女性<15 μg/L。

1.2 儀器與試劑

血細(xì)胞分析采用日本Sysmex XT-2001i全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀及配套試劑和質(zhì)控品；血紅蛋白電泳HbA2含量測(cè)定，采用法國(guó)Sebia全自動(dòng)毛細(xì)管電泳分析儀自動(dòng)掃描系統(tǒng)分析及配套試劑和質(zhì)控品；血清鐵蛋白檢測(cè)，采用羅氏E601全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀和原裝配套進(jìn)口試劑及質(zhì)控品；基因擴(kuò)增采用ABI 2720基因擴(kuò)增儀，DNA提取及檢測(cè)試劑均為深圳亞能生物技術(shù)公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)本采集 患者取半坐臥位，在30 s內(nèi)先后收集患者靜脈血4 ml分別置入于EDTA-K2抗凝的紫色真空采血管和內(nèi)含有分離膠的黃色真空采血管中，立即混勻后送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行血細(xì)胞分析、血紅蛋白A2含量測(cè)定、血清鐵蛋白的測(cè)定。

1.3.2 血細(xì)胞分析 采用XT-2001i全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀檢測(cè)，主要觀察指標(biāo)為MCV、MCH，當(dāng)患者M(jìn)CV<80 fl和MCH<27 pg時(shí)進(jìn)行血紅蛋白電泳分析，觀察血紅蛋白A2含量。

1.3.3 血紅蛋白電泳（HbA2含量測(cè)定） 將采集的靜脈血標(biāo)本以5 000 r/min速度離心5 min，加樣槍吸取90 μl溶血素于稀釋杯，再加18 μl離心后的紅細(xì)胞層標(biāo)本于稀釋杯中進(jìn)行溶血稀釋，然后用儀器進(jìn)行檢測(cè)。每批樣本均同時(shí)使用儀器的配套質(zhì)控品進(jìn)行質(zhì)控后，對(duì)所有的樣本處理結(jié)果進(jìn)行記錄。血紅蛋白電泳HbA2篩查標(biāo)準(zhǔn)：HbA2<2.5%或出現(xiàn)異常血紅蛋白區(qū)帶，則為α-地貧初篩陽(yáng)性。

1.3.4 血清鐵蛋白檢測(cè) 采用羅氏E601全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套試劑檢測(cè)血清鐵蛋白。血清鐵蛋白正常參考范圍：男性 30～400 μg/L，女性 15～150 μg/L。

1.3.5 α-地貧基因診斷

1.3.5.1 DNA樣本的提取 取患者抗凝血2 ml，吸200 μl全血于吸有500 μl WB裂解液的試管中振蕩均勻，短暫離心后加入100 μl沉淀液PB，振蕩均勻后12 000 r/min速度離心5 min，將上清加入離心柱中，分別依次加入已加入無(wú)水乙醇的W1一次，W2兩次，棄濾液，取出離心柱，于1.5 ml干凈離心管，加入100 μl洗脫液EB，離心后，離心管內(nèi)即為收集備用的DNA溶液。

1.3.5.2 α-地貧3種缺失型診斷 采用跨越斷裂點(diǎn)（Gap-PCR）方法診斷中國(guó)人常見(jiàn)的α-地貧3種缺失型：東南亞缺失型（--SEA）基因、-α3.7缺失型基因和-α4.2缺失型基因；采用gap-PCR 和反向點(diǎn)雜交芯片技術(shù)（RDB），對(duì)α-地貧常見(jiàn)的3種非缺失型點(diǎn)突變基因進(jìn)行檢測(cè)，包括α2珠蛋白基因突變類型 αWS CD122），CAC-CAG；αQS（CD125），CTG-CCG；αCS（CD142），TAA-CAA。缺失型采用通過(guò)電泳來(lái)判斷結(jié)果，突變型采用反向斑點(diǎn)雜交方法，根據(jù)顯色情況判斷結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本文數(shù)據(jù)資料分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理。計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HbA2正常的靜止型和標(biāo)準(zhǔn)型α-地貧中不同基因型所占比例

8 979例疑為地貧血患者中檢出為靜止型和標(biāo)準(zhǔn)型α-地貧3 588例，陽(yáng)性率為39.96%。其中HbA2正常2 980例，占83.05%（2 980/3 588），HbA2異 常 608例，占 16.94%（608/3 588），見(jiàn)表 1。

2.2 靜止型和標(biāo)準(zhǔn)型α-地貧基因突變與缺失情況

從基因突變的類型看，靜止型和標(biāo)準(zhǔn)型α-地中海貧血中無(wú)論HbA2是否正常均以缺失型為主，分別為97.71%（3 506/3 588）、93.91%（571/608），兩者間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。在缺失型中東南亞缺失型雜合子（--SEA/αα）2 942例，占比最高為82.00%（2 942/3 588），其次為右缺失型雜合子（-α3.7/αα）394例，占 10.98%（394/3 588），左缺失型雜合子（-α4.2/αα）168例，占4.68%（168/3 588）；而非缺失型只占2.29%（82/3 588），其中ααQS/αα突變22例，占 0.61%（22/3 588），ααCS/αα突 變 45例，占 1.25%（45/3 588），ααWS/αα突變15例，占0.42%（15/3 588），見(jiàn)表1。部分缺失型α-地貧基因檢測(cè)電泳圖譜見(jiàn)圖1。

表1 3 588例靜止型和標(biāo)準(zhǔn)型α-地貧基因類型在HbA2正常中的占比

圖1 部分缺失型α地貧基因檢測(cè)電泳圖譜

2.3 缺鐵與HbA2含量的關(guān)系

在2 980例靜止型和標(biāo)準(zhǔn)型α-地貧HbA2含量正常的患者中，檢出1 379例血清鐵蛋白降低。檢測(cè)結(jié)果顯示，血清鐵蛋白<15 μg/L女性鐵缺乏患者841例（地貧缺鐵組）占60.98%（841/1379），HbA2平均含量為（2.2±0.23）%，對(duì)照組530例為（2.4±0.24）%，兩者間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；血清鐵蛋白<30 μg/L男性鐵缺乏患者538例（地貧缺鐵組）占39.01%（538/1 379），HbA2平均含量為（2.39±0.25）%，而對(duì)照組310例含量為（2.5±0.24）%，兩者間差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表2。

表2 血清鐵蛋白降低與HbA2含量的關(guān)系 [%，（±s）]

表2 血清鐵蛋白降低與HbA2含量的關(guān)系 [%，（±s）]

性別 組別 HbA2含量 P值女性 地貧缺鐵組（n=841） 2.20±0.23 >0.05對(duì)照組（n=530） 2.40±0.24男性 地貧缺鐵組（n=538） 2.39±0.25 >0.05對(duì)照組（n=310） 2.50±0.24

3 討論

α-地貧在臨床上分為4種類型：靜止型、標(biāo)準(zhǔn)型、中間型（Hb H?。⒅匦停℉b Bart’s水腫胎），其分型的機(jī)制是根據(jù)α-肽鏈基因缺失或突變的個(gè)數(shù)來(lái)劃分。重型Hb Bart’s水腫胎患兒有4個(gè)α-肽鏈基因缺失或突變，常在妊娠晚期中死于宮內(nèi)中，或出生后幾小時(shí)內(nèi)一般都會(huì)死亡。中間型Hb H 病患者有3個(gè)α-肽鏈基因缺失或突變，患者為長(zhǎng)期輕度或中度貧血，重者可有黃疸，約2/3以上的患者有肝脾腫大，血象出現(xiàn)小細(xì)胞低色素改變，紅細(xì)胞滲透脆性下降及壽命期縮短等癥狀。靜止型和標(biāo)準(zhǔn)型患者α-肽鏈基因缺失或突變數(shù)量較少為1～2個(gè)，在臨床表現(xiàn)上可無(wú)臨床癥狀或僅輕微，但按照孟德?tīng)栠z傳規(guī)律，其孕育的胎兒有可能產(chǎn)生中間型或重型α-地貧兒。目前地貧患者沒(méi)有有效的藥物治療，主要依靠預(yù)防，因此如何加強(qiáng)對(duì)靜止型和標(biāo)準(zhǔn)型α-地貧的篩查尤為重要。

本研究表明，在采用MCV和MCH兩項(xiàng)指標(biāo)篩查后的可疑地貧患者中靜止型和標(biāo)準(zhǔn)型α-地貧陽(yáng)性率達(dá)39.96%，而且其中HbA2正常者占其大部分，為83.05%。從表1結(jié)果可以看出，HbA2對(duì)靜止型和標(biāo)準(zhǔn)型α-地貧的篩查存在較多漏診，不宜依靠HbA2結(jié)果對(duì)該類患者進(jìn)行α-地貧篩查。因此，目前采用MCV、MCH和HbA2這種篩查方式可導(dǎo)致很大部分的靜止型和標(biāo)準(zhǔn)型α-地貧漏診，應(yīng)引起足夠的重視。分析其原因可能與地貧患者易發(fā)生多樣化的血紅蛋白變體有關(guān)[6]。雖然常規(guī)MCH、MCV檢測(cè)操作簡(jiǎn)便且成本低，對(duì)地貧患者篩查有一定的可行性，但其靈敏度及特異度不高，容易出現(xiàn)漏診現(xiàn)象[7-9]。本文研究表明，HbA2在靜止型和標(biāo)準(zhǔn)型α-地貧中有很大部分是正常的，這就導(dǎo)致很多地貧患者可能被漏篩，由于HbA2對(duì)靜止型和標(biāo)準(zhǔn)型α-地貧篩查沒(méi)有特異性，地中海貧血基因攜帶者的臨床表型又有很高的異質(zhì)性，而基因診斷是地中海貧血確診的金標(biāo)準(zhǔn)[10]，才能更好地檢出攜帶者。我們建議應(yīng)對(duì)所有的可疑患者都應(yīng)進(jìn)行地中海貧血基因檢測(cè)，同時(shí)無(wú)法明確病因或血液學(xué)、血紅蛋白分析異常，應(yīng)加強(qiáng)α-地中海貧血的遺傳咨詢及產(chǎn)前基因診斷具有重要意義。

地貧不僅僅由于珠蛋白基因缺失或突變導(dǎo)致Hb成分改變，幼紅細(xì)胞利用鐵也發(fā)生障礙[11]，導(dǎo)致患者血清鐵增高[12]，但靜止型和標(biāo)準(zhǔn)型α-地中海貧血患者可使血清鐵蛋白降低[13]。本研究同時(shí)對(duì)可能影響HbA2的缺鐵因素進(jìn)行了探討，結(jié)果表明，當(dāng)女性患者血清鐵蛋白<15 μg/L或男性患者血清鐵蛋白<30 μg/L時(shí)，應(yīng)該考慮缺鐵HbA2含量產(chǎn)生一定的影響，在地貧初篩時(shí)應(yīng)予以考慮。這與相關(guān)研究報(bào)道相符[14-15]。α-地貧MCV及MCH假陽(yáng)性主要以小細(xì)胞低色素貧血為主，致病原因較多，一般因缺血引起的貧血中有表現(xiàn)為MCH、MCV降低，初篩為地中海貧血患者中也有部分患者屬于缺鐵性貧血所致，因此，初篩為地貧的患者需經(jīng)過(guò)血清鐵蛋白檢測(cè)排除，降低地中海貧血假陽(yáng)性發(fā)生，減少對(duì)地中海貧血和珠蛋白生成障礙性貧血并發(fā)缺鐵性貧血（IDA）的誤診[16]。受檢者HbA2雖然處于正常范圍，但由于MCV或MCH異常，同樣有必要進(jìn)行基因檢測(cè)，以免漏診。

綜上所述，HbA2在靜止型和標(biāo)準(zhǔn)型α-地中海貧血患者篩查中，具有一定的價(jià)值，但易導(dǎo)致漏診發(fā)生和缺鐵的干擾。因此，HbA2作為地中海貧血的有力篩查手段，應(yīng)配合血細(xì)胞指標(biāo)CMV、MCH和基因診斷才能更好地為臨床確診提供靠依據(jù)。