水稻東野型不育系異交不親和性的鑒定和遺傳分析

熊濤 聶元元 毛方明 雷建國(guó) 毛凌華 朱珊 黃仁良 沈顯華,* 嚴(yán)松,,*

（1 江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 江西省超級(jí)水稻研究發(fā)展中心 南昌 330200；2 江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 科技管理處 南昌 330200；3 江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水稻研究所 南昌 330200；#共同第一作者；*通信聯(lián)系人，E-mail: yans11@163.com；shen_xh20000913@126.com）

在自然界中，自交不親和性廣泛存在，超過60%的被子植物具有這種特征，它有利于異花傳粉，從而促進(jìn)遺傳多樣性。與自交不親和對(duì)應(yīng)的異交不親和，其存在更為廣泛。異交不親和性主要存在于異種、異屬間，親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，不親和性越高，即異交不親和是物種穩(wěn)定的重要保障[1]。植物異交不親和一般發(fā)生在遠(yuǎn)緣種間，種內(nèi)異交不親和則比較罕見。從應(yīng)用角度來看，發(fā)掘種內(nèi)異交不親和資源并闡明其遺傳機(jī)制，頗具應(yīng)用前景。將異交不親和基因?qū)胱匀黄贩N中，可作為不含該基因的品種（包括轉(zhuǎn)基因）生產(chǎn)繁殖的隔離材料使用；將不親和基因和親和基因分別導(dǎo)入不育系和恢復(fù)系，而周邊種植不含親和基因的材料，則可實(shí)現(xiàn)雜交種制種的生物學(xué)隔離。然而在雜交稻育種中，種內(nèi)的異交不親和卻是影響繁種、制種產(chǎn)量以及生產(chǎn)成本最大的因素之一。

目前，在植物自交不親和性研究方面已取得一系列重要進(jìn)展[2-4]，而對(duì)于異交不親和性的研究還比較薄弱，主要因?yàn)楫惤徊挥H和性的遺傳研究相對(duì)較難。如果不親和在兩個(gè)親本中是雙向的，就不能產(chǎn)生后代進(jìn)行遺傳研究，只有單向方可進(jìn)行[5]。

在禾本科作物中，已在玉米和水稻上發(fā)現(xiàn)有單向異交不親和現(xiàn)象。玉米上發(fā)現(xiàn)異交不親和可以追溯到一百多年前，1902 年科學(xué)家Correns 發(fā)現(xiàn)第一個(gè)異交不親和基因Ga1[6]，1936 年Burnham 報(bào)道了Ga2[7]，之后Ga3～Ga10及Tcb1等多個(gè)單向異交不親和位點(diǎn)陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)[5,8]，目前僅Ga1被克隆報(bào)道。Zhang等對(duì)Ga1位點(diǎn)中的雄性控制基因ZmGa1P進(jìn)行克隆和功能驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)ZmGa1P編碼一個(gè)在Ga1-S和Ga1-M型玉米自交系花藥中特異表達(dá)的果膠甲酯酶，ZmGa1P位于花粉管頂端，與另一個(gè)花粉管特異表達(dá)的 PME 蛋白互作，共同維持花粉管正常的甲酯化修飾程度，以保障花粉管在Ga1-S型花絲中的正常伸長(zhǎng)，最終受精結(jié)實(shí)[9]。

作為自花授粉的水稻，異交不親和主要發(fā)生在遠(yuǎn)緣野生種和栽培種以及不同染色體組的野生種之間，這也是生殖隔離的一種表現(xiàn)。2003 年Matsubara 等[10]報(bào)道了野生稻和栽培稻異交不親和的遺傳現(xiàn)象，通過正反交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)單向異交不親和由來自母本 W593A 的Cif基因和來自父本 T65wx的cim互作產(chǎn)生，與玉米相似，Cif花粉能給隱性純合的cim母本授粉結(jié)實(shí)，而cim花粉不能給顯性純合的Cif母本授粉結(jié)實(shí)，兩者都被定位在第6 染色體上，分別位于短臂和著絲粒附近。2008 年，他們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Cif其實(shí)存在兩個(gè)不連鎖的位點(diǎn)Cif1和Cif2，都在第6 染色體上，Cif1被定位在標(biāo)記R2291 和 RM204 之間 0.67 Mb 的區(qū)段上，Cif2定位在RG264 和RM3498 之間，兩標(biāo)記相距約18 cM，涵蓋著絲粒區(qū)域，與Cim位置相近[11]?？赡芤蚍纸怆y度大，之后未有新進(jìn)展報(bào)道。

我們?cè)跂|鄉(xiāng)野生稻利用過程中，也發(fā)現(xiàn)了異交不親和現(xiàn)象。20 世紀(jì)80 年代，江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所以東鄉(xiāng)野生稻為細(xì)胞質(zhì)源，采用野栽交和核置換的方法，培育出具有全新恢保關(guān)系的東野型雄性不育系[12]，之后通過多年大量測(cè)交試驗(yàn)，直至近年實(shí)現(xiàn)三系配套[13]。然而，在東野型不育系培育過程中，發(fā)現(xiàn)部分保持系品種與不育系存在異交不親和現(xiàn)象，這些品種在雜交或回交時(shí)，不育株系的異交結(jié)實(shí)率很低，甚至為零而不能繼續(xù)轉(zhuǎn)育。針對(duì)該現(xiàn)象開展了初步研究，通過構(gòu)建不同核質(zhì)背景的材料，探索東野型不育系異交不親和性的形成原因，進(jìn)而對(duì)該性狀進(jìn)行遺傳分析和基因初步定位。

1 材料與方法

1.1 材料

以東野型不育系DY1A及其保持系早秈稻中早35[13]為主要材料。其余水稻材料有粳稻品種02428、秀水 123，秈稻野敗型保持系Ⅱ-32B、金 23B、五豐B，恢復(fù)系華占、R668、廣恢308 和93-11。

利用染色體單片段代換系研究異交不親和性，該單片段代換系由 Ando 等[14]構(gòu)建，以粳稻品種Sasanishiki 為輪回受體、秈稻品種Habataki 為供體，共有 39 個(gè)系[14]。

1.2 田間試驗(yàn)

2014?2019 年，在江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院的江西南昌和海南三亞兩處試驗(yàn)基地種植，每個(gè)材料種植 6行，每行8 株，株間距為15 cm×20 cm，田間常規(guī)水肥管理。

在不育系盛花期，傍晚將不育系穎殼剪去 1/3至 1/2，保留完整雌蕊，次日取父本花粉對(duì)它充分授粉，套袋防止串粉。對(duì)同一組雜交，每個(gè)父本做3 個(gè)套袋，每個(gè)雜交套袋用2~3 穗不育系。

1.3 性狀考查

授粉后15~25 d，考查結(jié)實(shí)率。結(jié)實(shí)率(%)=實(shí)粒數(shù)/總粒數(shù)×100，取各穗結(jié)實(shí)率的平均值，利用Excel 2016 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。

1.4 基因定位分析

根據(jù)代換系群體遺傳圖譜，結(jié)合表型數(shù)據(jù)對(duì)基因進(jìn)行定位，遺傳距離用centiMorgan（cM）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 東野型不育系異交不親和性的產(chǎn)生

我們通過分別構(gòu)建同質(zhì)異核系和同核異質(zhì)系，初步探討東野型不育系異交不親和性形成的原因。

首先，我們進(jìn)行了同質(zhì)異核系雜交試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)所使用的東野型不育系DY1A，在與保持系中早35回交轉(zhuǎn)育過程中未發(fā)現(xiàn)不親和性。以DY1A 為胞質(zhì)供體，利用 3 個(gè)粳稻(Sasanishiki、02428 和秀水 123)以及 8 個(gè)秈稻(Habataki、廣恢 308、R668、93-11、華占、II-32B、金23B、五豐B)為輪回父本進(jìn)行不育系轉(zhuǎn)育。在雜交當(dāng)代，Sasanishiki 對(duì)DY1A 表現(xiàn)顯著的不親和性，F(xiàn)0結(jié)實(shí)率僅1.5%，其余10 份材料與 DY1A 雜交結(jié)實(shí)正常（>75%）。值得一提的是，東野型敗育胞質(zhì)具有廣保性，所有F1植株的花粉育性和結(jié)實(shí)率均為0。接下來，在回交第1 代，02428、秀水123、華占、93-11、廣恢308、金23B和五豐B 這7 份材料對(duì)DY1A 的雜交結(jié)實(shí)率顯著下降（回交時(shí)對(duì)每個(gè)父本只做了3 個(gè)套袋的回交，所選擇的回交單株數(shù)不大于 3，各回交世代僅計(jì)算平均結(jié)實(shí)率，未能統(tǒng)計(jì)分離比）；回交第2 代時(shí)，它們的雜交結(jié)實(shí)率繼續(xù)下降。只有Habataki、R668 和Ⅱ-32B 這3 份材料能夠正常轉(zhuǎn)育，各回交世代結(jié)實(shí)正常（表1）。由此得知：1）東野型不育系存在異交不親和現(xiàn)象；2）東野型不育系的異交親和性受核遺傳背景影響。

我們也進(jìn)行了同核異質(zhì)系雜交試驗(yàn)。在上述回交轉(zhuǎn)育過程中，金23B 和五豐B 與DY1A 在BC2F0的結(jié)實(shí)率分別為5.3%和17.7%，進(jìn)一步回交，BC3F0的結(jié)實(shí)率分別為4.5%和2.2%（表1），表現(xiàn)典型的異交不親和性。而含有野敗型敗育胞質(zhì)的同核異質(zhì)系金23A 和五豐A 與各自保持系雜交結(jié)實(shí)正常，表明東野型不育系的異交不親和性存在細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)。

此外，針對(duì)上述Sasanishiki 與DY1A 在雜交當(dāng)代不親和，也進(jìn)行了同核異質(zhì)雜交試驗(yàn)，仍以Sasanishiki 為父本，DY1A 的異質(zhì)保持系中早35 作母本，結(jié)果它們雜交結(jié)實(shí)正常，可見兩者的細(xì)胞核是親和的，進(jìn)一步說明東野型不育系的細(xì)胞質(zhì)影響了異交親和性。

綜合以上結(jié)果，明確了東野型不育系的異交不親和性由核質(zhì)互作產(chǎn)生。

2.2 東野型不育系雜交不親和類型

根據(jù)上述雜交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，東野型不育系的異交不親和性存在兩種類型，第一種類型（Ⅰ）發(fā)生在雜交當(dāng)代，以Sasanishiki 為代表。第二種類型（Ⅱ）發(fā)生在回交世代，代表品種有 02428、華占等，在BC1F0時(shí)它們就表現(xiàn)出部分不親和，且觀察到結(jié)實(shí)率有分離，隨著回交世代增加，不親和性逐漸凸顯。

2.3 利用單片段代換系研究異交不親和性Ⅰ

將 Sasanishiki 和 Habataki 與 DY1A 雜交，兩者的親和性截然相反，前者不親和，后者親和。進(jìn)而將它們衍生的一套染色體單片段代換系SL401-SL439 分別與DY1A 雜交，統(tǒng)計(jì)結(jié)實(shí)率。結(jié)果，篩選到2 個(gè)雜交親和的代換系(SL426 和SL427)，雜交結(jié)實(shí)率均在80%以上，完全正常（圖1）。其余代換系與DY1A 雜交結(jié)實(shí)率均不足10%，大部分代換系雜交幾乎不結(jié)實(shí)。表明Habataki 與DY1A 雜交的親和性有主效因子作用，且位于 SL426 和SL427 所攜帶的代換片段上。

2.4 異交不親和性Ⅰ的遺傳方式

利用親和代換系 SL426 與 Sasanishiki 的 F1及與Sasanishiki 回交的BC1F1分別與DY1A 雜交來分析異交不親和性Ⅰ的遺傳行為，結(jié)果，F(xiàn)1與DY1A雜交結(jié)實(shí)率為35.9%，表現(xiàn)中間型。BC1F1共35 株與DY1A 雜交，結(jié)實(shí)率表現(xiàn)為差（<5%）和中間型（30%~40%）兩種情況，差和中間型兩種表型株數(shù)分別是17 和18 株，符合1∶1 分離，初步推測(cè)該類型的異交不親和性Ⅰ在細(xì)胞核內(nèi)受單隱性基因控制，暫命名為CI1(t)。F1與 DY1A 雜交的結(jié)實(shí)率為中間型，說明CI1(t)的作用可能存在劑量效應(yīng)。

表1 東野型不育系DY1A與11個(gè)品種雜交/回交的結(jié)實(shí)情況Table 1. Seed setting rates of the DW-type CMS DY1A crossing/backcrossing with 11 varieties.

圖 1 DY1A 分別與 Sasanishiki、SL426 和 SL427 雜交的結(jié)實(shí)情況Fig. 1. Seed setting performances of DY1A crossing with Sasanishiki, SL426 and SL427, respectively.

2.5 初步定位CI1(t)

根據(jù)染色體代換系的遺傳圖譜[14]，第8 染色體有4 個(gè)單片段代換系，依次為SL425、SL426、SL427和SL428，SL425 與后三者不重疊，SL427 與前后相鄰的代換系SL426和SL428均有重疊片段。其中，SL426 含從 RM6838 到 RM3395 的片段，SL427 覆蓋RM3395－RM5891，兩者在RM3395 所在位置重疊；SL428 覆蓋 RM5767－RM4997，與 SL427 除RM3395 以外的片段重疊。此外，在其他染色體上，SL426 還含有第 5 染色體 RM6517、SL427 含有第 6染色體RM5957、SL428 含有第2 染色體RM3316和第 3 染色體 RM5442 的小片段，這些片段來自Habataki。第 2、3、5 和 6 染色體的代換系以及 SL428與 DY1A 雜交，結(jié)實(shí)率表型都與輪回親本Sasanishiki 相似，幾乎不結(jié)實(shí)，僅 SL426、SL427及供體親本Habataki 三者與DY1A 雜交結(jié)實(shí)正常，因此，將CI1(t)初步定位在 SL426 和SL427 的重疊區(qū)域，位于RM6838 和RM5767 兩個(gè)標(biāo)記之間，與RM3395 連鎖（圖2），前后兩標(biāo)記相距18.3 cM，物理距離約12 Mb，為精細(xì)定位奠定了基礎(chǔ)。

圖2 CI1(t)在第8 染色體上的初步定位Fig. 2. Rough mapping of of CI1(t) on chromosome 8.

3 討論

Matsubara 等[10]報(bào)道的水稻單向異交不親和僅受核基因控制，授粉后種子發(fā)育退化或皺縮，本研究中的表型與它有所區(qū)別，東野型不育系的異交不親和表現(xiàn)為結(jié)實(shí)率低或不結(jié)實(shí)，而且是一種新類型——由核質(zhì)基因互作產(chǎn)生。我們熟知的植物遠(yuǎn)緣雜交不親和，可能有一些就是由核質(zhì)互作產(chǎn)生的。

此前我們利用分子標(biāo)記通過對(duì)東鄉(xiāng)野生稻居群檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，只有部分株系含有東野型敗育細(xì)胞質(zhì)[15]，因而推測(cè)東野型不育系存在的異交不親和性，可能是含此類細(xì)胞質(zhì)的東鄉(xiāng)野生稻血緣的一種自我保護(hù)機(jī)制，即這些野生稻株系擁有特定的細(xì)胞質(zhì)基因，其他資源與它們雜交，需要帶有與這類細(xì)胞質(zhì)信號(hào)相匹配的親和核基因，才能實(shí)現(xiàn)基因交流。

相比秈稻，我們發(fā)現(xiàn)粳稻在與東野型不育系雜交/回交的較早世代就表現(xiàn)不親和性。在東野型三系雜交稻育種過程中，我們選用的粳稻品種（>50 份）轉(zhuǎn)育東野型不育系最終幾乎全部表現(xiàn)不親和，而秈稻卻有少數(shù)品種完全親和，表明東野型三系體系不適用于粳稻，而在秈稻上距離生產(chǎn)應(yīng)用仍有很長(zhǎng)的路要走，當(dāng)務(wù)之急是解決東野型不育系異交不親和性的瓶頸問題。

本研究發(fā)現(xiàn)的兩種不親和性發(fā)生在不同雜交世代，說明它們各自的控制基因可能不同。第一種類型在雜交當(dāng)代出現(xiàn)，受單隱性基因控制，并利用單片段代換系群體將其定位在第8 染色體SSR 標(biāo)記RM6838 和RM5767 之間，覆蓋著絲粒區(qū)域，對(duì)后續(xù)精細(xì)定位有一定難度。第二種類型的不親和性在回交一代時(shí)初步體現(xiàn)，回交至第二或第三代時(shí)徹底顯現(xiàn)，推測(cè)它的遺傳方式也不復(fù)雜，在育種應(yīng)用中對(duì)它們進(jìn)行遺傳改良應(yīng)是可行的。

目前對(duì)水稻異交不親和性的研究比較滯后，主要有兩方面原因。一是主觀因素，科研人員對(duì)這類性狀認(rèn)識(shí)不足，即便遇到也可能誤以為雜交沒有做好而忽視，因此相關(guān)研究報(bào)道非常少。眾所周知，手工雜交的結(jié)實(shí)率比不上自交。本研究中，DY1A與不同品種雜交、回交的結(jié)實(shí)率變幅很大（0%~88.6%），其中不乏手工雜交沒有做好的情況。實(shí)際上，影響雜交結(jié)實(shí)率的因素較多，比如授粉時(shí)的花粉數(shù)量和質(zhì)量等，所以在后續(xù)基因定位過程中，將雜交做好從而準(zhǔn)確鑒定表型十分關(guān)鍵。另一方面是客觀原因，異交不親和不同于其他農(nóng)藝性狀，它需要通過雜交試驗(yàn)來判斷表型，比對(duì)一般農(nóng)藝性狀的觀測(cè)多一道程序，若當(dāng)代雜交失敗就意味著要多一個(gè)世代來確定表型，而且對(duì)于純合與雜合表型區(qū)分不開的情況還需要利用后代家系去鑒定。不管怎樣，挖掘異交不親和材料加以研究，無論對(duì)理論還是應(yīng)用研究都很有價(jià)值。