兩種前處理方法聯合使用定性、定量測定豆芽中4-氯苯氧乙酸

□ 尤曉惠 鄭曉敏 謝 甜 劉張霞 重慶市涪陵食品藥品檢驗所

4—氯苯氧乙酸是一種植物生長調節(jié)劑，在豆芽生產中，4—氯苯氧乙酸可以促進豆芽下胚軸粗大，減少根部萌發(fā)，加速細胞分裂[1]，使豆芽更加肥嫩、粗壯，提高豆芽的產量。曾經很長一段時間4—氯苯氧乙酸被廣泛用于豆芽的生產中。我國相關部門發(fā)布的2015 年第11 號公告，明令禁止4—氯苯氧乙酸用于豆芽生產。然而4—氯苯氧乙酸依然被濫用于豆芽的生產中，每年國家相關部門發(fā)布的不合格食品通告中非法使用4—氯苯氧乙酸導致的豆芽不合格情況頻頻出現。

目前，豆芽中4—氯苯氧乙酸的測定標準有《豆芽中植物生長調節(jié)劑的測定BJS 201703》和《SN/T 3725—2013 出口食品中對氯苯氧乙酸殘留量的測定》。BJS 201703 標準采用QuChERS 方法對豆芽樣品進行前處理，方法簡便、快速，但是處理后的樣品溶液雜質非常多，液質測定時基質效應非常嚴重，造成豆芽中4—氯苯氧乙酸定量測定結果不夠準確。SN/T 3725 標準中，通過調節(jié)豆芽樣品溶液的pH 值，改變4—氯苯氧乙酸在溶液中的溶解性對豆芽樣品中的4—氯苯氧乙酸進行提取，提取后的樣品溶液經處理后再通過MAX 小柱進行凈化，液質測定時幾乎沒有基質效應，但是該方法的提取階段非常繁瑣并且需要消耗大量的有機試劑，凈化階段也非常的耗時。文獻中也主要是采用直接提取法、QuChERS 方法和固相小柱凈化法進行前處理[2—10]，本文擬建立兩種前處理方法，一種方法可以對豆芽中4—氯苯氧乙酸進行快速篩查；另一種方法可以最大程度地消除基質干擾，從而對4—氯苯氧乙酸進行準確定量。

1 材料和方法

1.1 儀器

Agilent1290 高效液相色譜儀（Agilent 公 司）和AB4500Qtrap 質譜 儀（ABSCIEX 公 司），Milli—Q 超 純水儀（Merck—Millipore 公司），氮吹儀；Waters Oasis MAX 固相萃取小柱（20 mg/mL）。

1.2 試藥試劑

4—氯 苯氧乙酸鈉（Standford Chmi—cals），乙腈、甲醇為色譜純（美國Fisher 公司），氨水（川東化工），甲酸（阿拉丁），凈化管（含150 mg PSA、900 mg MgSO4、150 mg C18）（島津）。

1.3 色譜和質譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動相：0.1%甲酸水（A）—0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脫（梯度洗脫程序：0 ～3.0 min，90%～10%A；3.0 ～3.5 min，10% A；3.5 ～4.0 min，10% ～90%A；4.0 ～6.0 min， 90%A）；流速：0.2 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：2 μL。

離子化模式：電噴霧電離負離子模式（ESI—）；掃描方式：多反應監(jiān)測（MRM）。

監(jiān)測離子對：185.0/126.9（定量離子對）、185.0/90.9、185.0/129.0。

1.4 方法

1.4.1 QuChERS 方法

稱取粉碎均勻的豆芽樣品5.000 g置于50 mL 離心管中，精密加入10 mL 含1%甲酸的乙腈溶液，渦旋混勻5 min，5 000 r/min 離心5 min。吸取上述上清液8 mL 至凈化管，立即快速渦旋混合2 min，5 000 r/min離心5 min。精密吸取上層有機相5 mL 至氮吹管，45 ℃氮吹至近干，用1.00 mL 20%乙腈水溶液渦旋復溶，過0.22 μm 濾膜，上機。

1.4.2 QuChERS/MAX 方法

稱取粉碎均勻的豆芽樣品5.000 g置于50 mL 離心管中，其余操作同“QuChERS 方法”，氮吹至近干，用3 mL 2%甲酸水溶液渦旋復溶。

MAX 固相萃取小柱預先用3 mL甲醇和3 mL 水活化。將上述樣品溶液加入小柱中，自然流干后，依次用3 mL 5%氨水、3 mL 30%甲醇的水溶液（含2%甲酸）、3 mL 甲醇淋洗，最后用3 mL 含8%甲酸的甲醇溶液洗脫。收集洗脫液于氮吹管中，45 ℃氮吹至近干，用1.00 mL 20%乙腈水溶液渦旋復溶，過0.22 μm 濾膜，上機。

2 結果與討論

2.1 樣品前處理方法

QuChERS 方法用1% 甲 酸— 乙腈進行提取，由于乙腈對大部分化合物均有一定的溶解能力，可有效地將4—氯苯氧乙酸從豆芽中提取出來。然后通過加入無水硫酸鎂使水相和有機相分層，降低4—氯苯氧乙酸在水相中的溶解度，從而將其轉移至乙腈層中。另外加入的PSA 和C18，可去除部分色素、有機酸、酚類及非極性干擾物，從而在提高回收率的同時減少干擾。QuChERS 前處理得到的樣品溶液非常渾濁，即樣品溶液中還含有大量的干擾物質。

為了進一步降低干擾，通過MAX小柱對樣品溶液進行進一步凈化，以去除干擾雜質。通過對4—氯苯氧乙酸結構的分析，樣品溶液可以通過反向固相萃取小柱進行凈化，又可以用陽離子交換小柱進行凈化，因此，選擇MAX 小柱作為凈化柱。樣品溶液過柱后，分別選擇了3 種溶液體系對小柱進行淋洗，依次用3 mL 5%氨水、3 mL 30% 甲醇的水溶液（含2% 甲酸）、3 mL 甲醇淋洗，通過調節(jié)溶液的pH 值及逐步提高洗脫液的洗脫能力，使樣品中的干擾物得到最大程度的去除。

2.2 基質效應

對5 個空白綠豆芽樣品和5 個空白黃豆芽樣品分別用2 種前處理方法進行處理，得到空白樣品溶液。將10 μg/mL 的標準溶液（溶劑為甲醇）分別用空白樣品溶液及20%乙腈水溶液配置成100 ng/mL 的溶液，用于考察不同樣品溶液的基質效應（X），基質抑制效應的計算公式見式（1）。

式（1）中：A 為峰面積。

通過考察，QuChERS 方法基質抑制效應在55%～78%，不同豆芽的基質效應不同且黃豆芽比綠豆芽的基質抑制作用更強，凈化效果較差。定量檢測時雖然可以通過空白基質標曲進行基質效應的消除，但是由于不同豆芽間基質效應不同，空白基質標曲并不能很好地消除基質效應，因此，定量檢測時會出現定量測定結果不夠準確的問題。

QuChERS/MAX 方法， 基質抑制均小于5%，凈化效果非常好。因此，再通過空白基質標曲對定量結果進行校正，可以取得比較準確的定量結果。

2.3 回收率

在樣品中分別加入10、20、100 μg/kg的標準溶液，按照兩種處理方法進行處理。同時做陰性樣品，得到空白基質溶液，同時測定，并計算加標回收率。

通過考察，QuChERS 方法各添加水平的回收率在79% ～90%。QuChERS/MAX 方法各添加水平的回收率在75%～91%。

通過對回收率的考察，可知QuChERS 方法可以將豆芽中的4—氯苯氧乙酸有效提取出來。而QuChERS/MAX 方法，樣品溶液經過MAX 的進一步凈化在凈化過程中4—氯苯氧乙酸并沒有損失。兩種方法的回收率均較高，可滿足檢測要求。

3 結論

兩種前處理方法的回收率均較高，均可滿足實驗要求。QuChERS 方法前處理后具有嚴重的基質抑制效應，并且不同樣品之間的基質效應差別較大。但是QuChERS方法更加的快速、便捷。QuChERS/MAX 方法，經過多環(huán)節(jié)的凈化，基質效應非常小，但是由于QuChERS 方法前處理后的樣品溶液雜質依然非常多，在MAX 小柱凈化階段，一方面過柱的速度非常的慢，另一方面凈化環(huán)節(jié)較多，使得前處理耗時長，不適合大批量樣品的快速篩查。因此，QuChERS 方法適合樣品中4—氯苯氧乙酸的快速篩查；QuChERS/MAX 方法適合樣品中4—氯苯氧乙酸的定量檢測。