一種快速測(cè)定苦丁茶中苦丁茶皂苷A 含量的方法

□ 呂華瑛 山東中醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校 車(chē)彥云 云南中醫(yī)藥大學(xué)

苦丁茶是一種純天然保健茶。冬青科冬青屬植物苦丁的干燥葉，是正品苦丁茶的主要來(lái)源，主產(chǎn)于廣東省、廣西壯族自治區(qū)和海南省等地?？喽〔柚兄饕性碥?、黃酮、多酚、氨基酸、揮發(fā)油與多糖等多種化學(xué)成分，其中，三萜皂苷類(lèi)化合物是其主要活性成分，有顯著降低低密度脂蛋白在血管內(nèi)沉積，改善血液微循環(huán)的藥理活性，對(duì)降壓、降糖、降血脂、防治動(dòng)脈粥樣硬化以及由此引發(fā)的心腦血管疾病有積極治療意義[1—2]。目前，苦丁茶的質(zhì)量分析主要集中在測(cè)定黃酮、三萜、氨基酸、揮發(fā)性成分等方面[3]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合苦丁茶的功效，選取其中含量高、降血脂活性強(qiáng)的三萜皂苷類(lèi)成分苦丁茶皂苷A 為指標(biāo)，用高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定，為全面客觀反映苦丁茶的質(zhì)量?jī)?yōu)劣，合理制定苦丁茶等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 儀器與試藥

Agilent 1100 型高效液相色譜儀，Chemstation 色譜工作站，Sartorius—BS110S 電子天平（德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器有限公司），KQ—500DE 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

苦丁茶皂苷A（kudinoside A）對(duì)照品為實(shí)驗(yàn)室自制，經(jīng)HPLC 法檢測(cè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)在98.0%以上；乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。10 批不同等級(jí)品次的苦丁茶樣品主要購(gòu)買(mǎi)收集自廣西、海南、廣東。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取條件優(yōu)化

分別從提取方法、提取溶劑、提取時(shí)間、固液比4 方面進(jìn)行研究。首先以60%甲醇作溶劑用回流和超聲法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，顯示回流法提取優(yōu)于超聲法。又考察不同濃度甲醇和乙醇對(duì)提取的影響，顯示80%甲醇與60%甲醇對(duì)苦丁茶皂苷A 的提取率遠(yuǎn)高于其他溶劑，從經(jīng)濟(jì)上考慮，確定60%甲醇為提取溶劑。進(jìn)一步考察不同固液比、提取時(shí)間的影響，顯示以固液比1 ∶250，用60%甲醇回流提取1 h，待測(cè)成分提取效果最好。

2.2 色譜條件優(yōu)化

為獲得苦丁茶皂苷A 的最佳分離效果，實(shí)驗(yàn)考察了4 種不同的液相色譜柱、4 種不同的流動(dòng)相、不同的柱溫以及不同流動(dòng)相的流速等色譜條件。結(jié)果表明：Kromasil 100—5C18柱的分離效果最優(yōu)；采用乙腈—0.1%磷酸水為流動(dòng)相，0.8 mL/min 的流速梯度洗脫，柱溫30 ℃，可以使苦丁茶皂苷A的色譜峰保留時(shí)間適中，并能與干擾組分的色譜峰良好分離。

2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

取苦丁茶皂苷A 對(duì)照品甲醇溶液進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，在226 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收，故確定226 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.4 色譜條件

Kromasil 100—5C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱。流動(dòng)相：乙腈（A）—0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫：0 ～10 min，15%～30% A；10 ～30 min，30% ～40% A；30 ～35 min，40% A。體積流量：0.8 mL/min。檢測(cè)波長(zhǎng)：226 nm。柱溫：30 ℃。進(jìn)樣量：10 μL。高效液相色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 苦丁茶樣品的HPLC 圖譜

2.5 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取干燥至恒重的苦丁茶皂苷A 對(duì)照品適量，加入60%甲醇溶解、定容，制成濃度為0.510 mg/mL 的對(duì)照品儲(chǔ)備液，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

2.6 供試品溶液的制備

取粉碎、過(guò)40 目篩并低溫干燥至恒重的苦丁茶粉0.1 g，加入60%甲醇25 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，80 ℃加熱回流60 min，取出，自然放冷至室溫，以60%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.22 μm 微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.7 線性關(guān)系考察

精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL，以60%甲醇定容于5 mL 容量瓶中，再分別精密吸取苦丁茶皂苷A 對(duì)照品溶液（0.051 0 mg/mL）1、5、10、15、20、25 μL 與30 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜峰面積。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=489.55X—0.59，r=0.999 9。結(jié)果表明苦丁茶皂苷A 進(jìn)樣量在0.102 ～3.06 μg/mL 時(shí)，呈良好的線性關(guān)系。

2.8 精密度試驗(yàn)

取同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定苦丁茶皂苷A 峰面積，計(jì)算RSD為0.47%，表明本方法精密度良好。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批苦丁茶樣品6 份，按2.6項(xiàng)下方法平行制備6份供試樣品溶液，分別進(jìn)樣10 μL，計(jì)算苦丁茶皂苷A 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，平均結(jié)果為2.56%，RSD為1.12%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.10 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液分別于0、2、4、8、12、24 h 依次進(jìn)樣，記錄不同時(shí)間的色譜圖，計(jì)算苦丁茶皂苷A 的峰面積RSD 為1.54%，RSD 值≤2%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.11 回收率試驗(yàn)

取廣西大新苦丁茶樣品粉末6 份，每份0.05 g，精密稱(chēng)定，分別精密加入0.051 0 mg/mL 的苦丁茶皂苷A 對(duì)照品甲醇溶液25 mL，按2.6 供試品溶液制備方法制備并測(cè)定，平均回收率為99.6%（RSD=0.86%）。

2.12 樣品測(cè)定

取不同產(chǎn)地與等級(jí)苦丁茶樣品，制備供試品溶液。分別精密吸取苦丁茶皂苷A 對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，計(jì)算苦丁茶皂苷A 含量，見(jiàn)表1。

表1 苦丁茶中苦丁茶皂苷A 的測(cè)定結(jié)果（n=3）

3 結(jié)果與討論

實(shí)驗(yàn)顯示：①來(lái)自3 個(gè)不同產(chǎn)地、相同等級(jí)苦丁茶中指標(biāo)成分苦丁茶皂苷A 的含量差異不大，但是來(lái)自同一產(chǎn)地海南、不同等級(jí)苦丁茶中指標(biāo)成分含量有一定差異，從數(shù)據(jù)上可以明顯看出，普通級(jí)＞一級(jí)＞特級(jí)＞極品，這可能與不同等級(jí)苦丁茶烘焙加工溫度有密切關(guān)系，隨著烘焙溫度的提高，苦丁茶皂苷A 的含量降低，后期需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。②茶葉碎屑中含有較多的苦丁茶皂苷A，將苦丁茶冬青葉開(kāi)發(fā)為新的降血脂藥物而言，茶葉碎屑都可用作原料，利于降低開(kāi)發(fā)新藥的成本。③苦丁茶冬青老齡葉與嫩葉中指標(biāo)成分含量差異較大，但老齡葉中所含其他化學(xué)成分是否與嫩葉有差異，還有待研究。

本實(shí)驗(yàn)建立的測(cè)定方法簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，可考慮作為苦丁茶質(zhì)量?jī)?yōu)劣的檢測(cè)控制標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，若以苦丁茶干燥品計(jì)算，其所含主要活性成分苦丁茶皂苷A 限度標(biāo)準(zhǔn)可暫定為不低于20 mg/g。