常規(guī)超聲聯(lián)合LAMP2、ARFI在PBC患者肝纖維化程度監(jiān)測(cè)中的價(jià)值

常雋 張文婷

原發(fā)性膽汁性膽管炎(primary biliary cirrhosis, PBC)是肝內(nèi)直徑40～80 μm小膽管的非化膿性特異性免疫性損傷，此病呈進(jìn)行性發(fā)展，最終發(fā)展至肝硬化[1-2]。肝纖維化是由多種致病因子所導(dǎo)致的肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生，其不是一個(gè)獨(dú)立的疾病，而是一個(gè)病理生理過程[3-5]。尋找一種方法能夠在肝纖維化演進(jìn)為肝硬化的過程進(jìn)行準(zhǔn)確評(píng)估，為臨床有針對(duì)性的選擇治療方案，具有重要意義[6-7]。常規(guī)超聲是臨床評(píng)估慢性乙型肝炎患者病情的常規(guī)手段，但常規(guī)超聲難以準(zhǔn)確評(píng)估肝纖維化分期[8]。因此單獨(dú)依靠常規(guī)超聲難以滿足臨床需求。溶酶體膜蛋白-2 (Lysosomal Granule Membrane Protein，LAMP2)主要在胎盤、肺和肝臟表達(dá)，既往認(rèn)為該蛋白是一種結(jié)構(gòu)蛋白，近期研究認(rèn)為LAMP2除了履行結(jié)構(gòu)蛋白功能外，還參與自身免疫疾病，自噬體形成、內(nèi)體融合、膽固醇運(yùn)輸、肝纖維化等生理病理過程[9]。此外，也有研究表明聲輻射力脈沖成像(Acoustic radiation force impulse，ARFI)與乙型肝炎纖維化病情進(jìn)展相關(guān)。在此背景下，本研究旨在分析常規(guī)超聲聯(lián)合LAMP2、ARFI在PBC患者肝纖維化程度監(jiān)測(cè)中的價(jià)值，為臨床準(zhǔn)確評(píng)估PBC患者肝纖維化程度提供參考。

資料與方法

一、一般資料

選擇2016年2月至2019年4月在本院進(jìn)行治療的，經(jīng)肝穿刺病理組織學(xué)檢查確診為PBC的96例患者的完整資料進(jìn)行回顧性分析。根據(jù)Child-Pugh分級(jí)分為A級(jí)41例、B級(jí)24例，C級(jí)31例，其中男性62例，女性34例，年齡60～80歲，平均(64.2±4.3)歲，中位年齡74歲。另隨機(jī)選取在本院進(jìn)行健康體檢的患者60例作為對(duì)照組，其中男性34例，女性26例，年齡61～82歲，中位年齡73歲，平均年齡(65.1±3.9)歲。入組患者及家屬均對(duì)本研究知情同意，并簽署知情同意書。

二、納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：入組患者符合2000年美國肝臟病學(xué)會(huì)關(guān)于PBC的指導(dǎo)意見，具體如下：(1) 反映膽汁淤積的生化指標(biāo)上升持續(xù)超過半年；(2) B超或者膽管造影結(jié)果表明患者膽管系統(tǒng)排泄正常; (3) 入組患者血清AMA或AMA-M2陽性；(4) 肝臟穿刺檢查符合PBC病理特征。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1) 伴有自發(fā)腹膜炎、結(jié)核等疾病者；(2)伴有肝癌或其他腫瘤者。

三、觀察指標(biāo)及方法

(一)常規(guī)超聲檢查 入組患者在肝臟活檢前后1周內(nèi)實(shí)施常規(guī)超聲檢查，重點(diǎn)觀察“肝包膜、肝實(shí)質(zhì)”圖像，肝包膜使用高頻線陣探頭，選擇最容易被觀察的劍突下肝左葉，探頭垂直肝臟。采用低頻凸陣探頭探查肝實(shí)質(zhì)，在右肋間切面觀察。采集圖像存儲(chǔ)后，分別由兩位醫(yī)生對(duì)存儲(chǔ)的圖像采取雙盲法進(jìn)行半定量評(píng)分，具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下表，分別對(duì)肝包膜，肝實(shí)質(zhì)和脾面積進(jìn)行計(jì)分，總分為超聲得分。

超聲指標(biāo)1分2分3分肝包膜光滑欠光滑鋸齒狀肝實(shí)質(zhì)均勻欠均勻結(jié)節(jié)狀脾面積<20 cm2≥20 cm2

(二)免疫組化法檢測(cè) LAMP2在肝組織的表達(dá)，LAMP2陽性信號(hào)存在于肝細(xì)胞胞漿，為棕黃色顆粒，由兩位病理科醫(yī)生對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行判斷，評(píng)分內(nèi)容包括兩部分；一為細(xì)胞染色強(qiáng)度，分陰性、若陽性、陽性和強(qiáng)陽性，分別對(duì)應(yīng)0分、1分、2分和3分。二為在高倍顯微鏡下選擇3個(gè)以上的視野，計(jì)算陽性細(xì)胞百分比，分為4個(gè)等級(jí)，陽性細(xì)胞百分比分別為：0.01%～25%，25.01%～50%，50.01%～75%，75.01%～100%。最終評(píng)分由染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)百分比對(duì)應(yīng)數(shù)值是乘積，依據(jù)得分劃分為陰性(0～1分，—)，弱陽性(2～4分，+)，陽性(5～8分，++)，強(qiáng)陽性(9～12分，+++)。

(三)使用彩超ARFI成像檢測(cè)與肝組織硬度直接相關(guān)的剪切波速(shear wave velocity, AWV)，探頭4Cl，頻率3.0-4.5 MHz。檢查時(shí)安排受檢者平臥，平靜呼吸時(shí)屏氣，避開血管及膽管，s5、s6、s7、s8肝段每段測(cè)量3次，取均值作為肝臟ARFI值。

(四)肝穿刺活檢 采用經(jīng)皮肝穿刺活檢術(shù)，一般要求組織長度1.5 cm以上，所取組織應(yīng)包括10個(gè)以上的完整匯管區(qū)，過程中注意排除破碎的肝組織標(biāo)本，標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋后進(jìn)行連續(xù)切片，進(jìn)行常規(guī)HE染色，參照“病毒性肝炎防治方案”[10]進(jìn)行肝纖維化分期。

四、 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、PBC與對(duì)照組患者ARFI及LAMP2及超聲積分比較

如下表所示，可見，PBC患者ARFI，LAMP2和超聲積分均高于對(duì)照組，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

二、不同Child-Pugh分級(jí)PBC患者LAMP2、ARFI及超聲積分比較

如表2所示，本次研究中，經(jīng)F檢驗(yàn)可知，PBC患者中不同Child-Pugh分級(jí)者，對(duì)比他們的ARFI，

表1 PBC與對(duì)照組患者ARFI及LAMP2及超聲積分比較

表2 不同Child-Pugh分級(jí)PBC患者LAMP2、ARFI及超聲積分比較

LAMP2和超聲積分水平，結(jié)果提示相關(guān)指標(biāo)在不同分級(jí)患者之間的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。t檢驗(yàn)結(jié)果表明，Child-Pugh為B級(jí)的患者ARFI，LAMP2和超聲積分均顯著高于A級(jí)患者(P<0.05)，Child-Pugh為C級(jí)的患者ARFI，LAMP2和超聲積分均顯著高于A級(jí)和B級(jí)患者(P<0.05)。

三、LAMP2、ARFI和超聲積分水平與PBC患者病理分期的相關(guān)性

相關(guān)分析中使用Pearson相關(guān)性方法進(jìn)行，對(duì)LAMP2、ARFI及超聲積分與PBC肝臟病理分期的潛在聯(lián)系進(jìn)行分析，結(jié)果表明LAMP2、ARFI及超聲積分與PBC患者Child-Pugh分級(jí)均呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。

表3 LAMP2、ARFI及超聲積分與PBC肝臟

四、ROC曲線分析法用于討論LAMP2、ARFI和超聲積分水平診斷PBC患者肝纖維化狀態(tài)的價(jià)值

如下表，采用ROC曲線分析LAMP2、ARFI和超聲積分水平聯(lián)合對(duì)肝纖維化進(jìn)行診斷，ROC曲線分析可見，同時(shí)聯(lián)合檢測(cè)的方法對(duì)于PBC患者肝纖維化程度的診斷評(píng)估均具有更高的診斷效力，其靈敏度以及準(zhǔn)確度、特異度分別為0.874、0.931、0.922，均顯著高于三個(gè)指標(biāo)單獨(dú)檢測(cè)。

表4 ROC曲線分析LAMP2、ARFI及超聲積分

討 論

臨床上，PBC患者的病理變化以進(jìn)行性、非化膿性和破壞性的肝內(nèi)小膽管損傷為典型病理特征，病情嚴(yán)重，可惡化為肝硬化。病理檢查固然是當(dāng)前PBC診斷中不可動(dòng)搖的權(quán)威公認(rèn)金標(biāo)準(zhǔn)，但其也有致命缺陷。此外，由于PBC的臨床前期和無癥狀期不存在不適癥狀，因此對(duì)PBC進(jìn)行早期診斷較為困難。因此本研究結(jié)合此前有關(guān)PBC病理的研究結(jié)果，探討常規(guī)超聲，LAMP2以及ARFI應(yīng)用于肝纖維化程度動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)的可行性及臨床價(jià)值。

研究通過回顧性分析，了解到于我院進(jìn)行治療的96例PBC患者，PBC患者ARFI，LAMP2和超聲積分均高于對(duì)照組。本研究表明不同病情PBC患者ARFI、LAMP2和超聲積分差異顯著。C級(jí)的患者ARFI、LAMP2和超聲積分比A和B級(jí)患者水平更高，同時(shí)ARFI以及LAMP2、超聲積分水平可見C等級(jí)的受試對(duì)象高于A和B級(jí)受試對(duì)象。所以在不同Child-Pugh分級(jí)的PBC患者中，這三個(gè)重要的特征性指標(biāo)(ARFI，LAMP2以及超聲積分)均存在明顯差異，這一結(jié)果提示上述3指標(biāo)具有應(yīng)用于臨床動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)肝纖維化程度的可能。為進(jìn)一步分析ARFI，LAMP2和超聲積分與PBC患者肝纖維的相關(guān)性，本研究在賦值后進(jìn)行了Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果表明結(jié)果表明LAMP2、ARFI及超聲積分與Child-Pugh分級(jí)是正相關(guān)的。使用ROC曲線評(píng)估了3個(gè)指標(biāo)對(duì)PBC病情評(píng)估的價(jià)值，可見聯(lián)合檢測(cè)方案的靈敏度、準(zhǔn)確度、特異度均顯著高于單獨(dú)檢測(cè)。上述結(jié)果表明可采用ARFI，LAMP2聯(lián)合超聲積分對(duì)PBC患者動(dòng)態(tài)纖維化程度進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，以達(dá)到指導(dǎo)臨床治療的目的。常規(guī)超聲對(duì)于PBC的診斷，主要是根據(jù)其在不同病理分期的不同超聲特征[11]，總體而言，PBC患者肝臟實(shí)質(zhì)回聲增強(qiáng)，可見細(xì)密結(jié)節(jié)狀，肝內(nèi)膽管伴有輕度擴(kuò)張，膽管壁水腫，回聲增強(qiáng)。伴隨病情變化，肝血流動(dòng)力學(xué)也逐漸發(fā)生變化。ARFI利用發(fā)射的低頻聲脈沖使目標(biāo)區(qū)組織產(chǎn)生位移，再利用追蹤波束獲得組織位移情況，從而計(jì)算得到目標(biāo)區(qū)與周圍組織相對(duì)硬度圖像及目標(biāo)區(qū)組織的剪切波速度值[12-14]，因此其能夠通過測(cè)量肝實(shí)質(zhì)硬度值間接反映肝臟纖維化程度和其儲(chǔ)備功能。本研究結(jié)果也表明超聲評(píng)分與PBC患者Child-Pugh分級(jí)呈現(xiàn)一定的相關(guān)性。

盡管LAMP2具體功能尚不十分清楚，此前研究發(fā)現(xiàn)，溶酶體膜蛋白成分中50%為LAMP1與LAMP2，因此 LAMP2作為溶酶體膜的重要成分參與維持溶酶體膜的正常結(jié)構(gòu)，同時(shí)其分子的腔內(nèi)段結(jié)構(gòu)存在高度糖基化特點(diǎn)，保護(hù)溶酶體膜降解風(fēng)險(xiǎn)和降解程度更低。近年來研究發(fā)現(xiàn)[15]，LAMP2不單純作為一種結(jié)構(gòu)蛋白存在于膜結(jié)構(gòu)中，同時(shí)還在很多免疫性疾病與病理過程中直接調(diào)控中性粒細(xì)胞的黏附、自噬作用，并且與抗原遞呈也有關(guān)聯(lián)[16], 因此被作為一種新的ANCA亞型提出。既往有實(shí)驗(yàn)性研究選取LAMP2基因缺陷的小鼠為研究對(duì)象，分析其與小鼠免疫功能的關(guān)聯(lián)發(fā)現(xiàn) LAMP2對(duì)細(xì)胞自噬作用會(huì)產(chǎn)生重要影響，是自噬過程中不可或缺的關(guān)鍵因子之一。研究還顯示[17]，自噬在膽管上皮細(xì)胞損傷中會(huì)出現(xiàn)，并且自噬降解的調(diào)節(jié)異常與線粒體異?？乖谋磉_(dá)有關(guān)，可能參與PBC小膽管損傷過程。一定程度上解釋了LAMP2在肝組織中的表達(dá)與PBC患者肝纖維化的關(guān)聯(lián)機(jī)制。

綜上所述，可以得出結(jié)論，常規(guī)超聲聯(lián)合LAMP2、ARFI可準(zhǔn)確評(píng)估PBC患者肝纖維化程度。但需要注意的是Child-Pugh分級(jí)并不能對(duì)肝硬化的嚴(yán)重程度進(jìn)行全面體現(xiàn)，因此在后續(xù)的研究中，需要選擇更為可靠的評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)一步分析LAMP2，ARFI和超聲積分與肝纖維化的相關(guān)性及其重要意義。