苯硼酸功能化納米金的合成及其對沙丁胺醇的可視化檢測*

賀茂芳，秦 蓓，張 博，胡婭琪，唐一梅，周 慧

(1.西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 西安 710021；2.西安醫(yī)學(xué)院 藥物研究所，陜西 西安 710021)

沙丁胺醇(Salbutamol，SAL)是一種人工合成的選擇性β-受體激動劑，可以促進動物體內(nèi)蛋白質(zhì)的沉積和脂肪的分解，明顯加快和提高飼料轉(zhuǎn)化率，提高酮體的瘦肉率，因此被用作畜禽的促生長劑和飼料添加劑[1]。SAL易在人和動物的內(nèi)臟、器官中殘留，嚴重危害人類的健康[2]。因此，高效、實用的檢測方法對于畜產(chǎn)品安全有著重要意義。目前，SAL的檢測方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[3-4]、液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)[5-6]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[7]、電泳法(CE)[8-9]，免疫分析法[10-11]等。然而，這些方法儀器昂貴，操作復(fù)雜，不易推廣普及。

與儀器分析法相比，基于納米金顆粒(Au NPs)的可視化檢測操作簡便、結(jié)果直觀，廣泛應(yīng)用于生物、環(huán)境和食品分析。Au NPs可視化檢測的原理為單分散的Au NPs在溶液中呈現(xiàn)酒紅色，當加入被檢測物時，Au NPs表面的功能基團與被檢測物發(fā)生反應(yīng)，引起交聯(lián)聚集，從而使顆粒間的等離子體耦合發(fā)生改變，吸收峰發(fā)生紅移，溶液的顏色由紅色變?yōu)樽仙蛩{色[12]?；贏u NPs的可視化檢測不依賴大型儀器，溶液顏色變化即可作為讀出信號，信號檢出速度較快，成本低廉，適合于現(xiàn)場檢測和不具備大型儀器的場所[13]。

根據(jù)硼親和原理，硼酸基在堿性條件下可與1,2-二羥基和1,3-二羥基結(jié)合，形成五元或六元環(huán)酯，從而實現(xiàn)對順式二羥基化合物的特異性識別[14]。SAL分子中含有1,3-二羥基和氨基，因此，作者首先以檸檬酸三鈉為穩(wěn)定劑和還原劑制備Au NPs，然后將苯硼酸修飾于Au NPs表面。由于苯硼酸與1,3-二羥基特異性結(jié)合，同時，Au NPs表面的羧基與氨基通過靜電吸引力結(jié)合，從而拉近Au NPs顆粒之間的距離，引起交聯(lián)聚集，Au NPs溶液的顏色由酒紅色轉(zhuǎn)變?yōu)樗{色，從而實現(xiàn)對SAL的可視化檢測。該方法簡便快捷，成本低廉，為SAL的檢測提供了新方法。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

四水合氯金酸：質(zhì)量分數(shù)99%，3-氨基苯硼酸：質(zhì)量分數(shù)98%，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)：質(zhì)量分數(shù)99%，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)：質(zhì)量分數(shù)99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；SAL標準品：質(zhì)量分數(shù)99%，上海三愛思試劑有限公司；4-巰基苯硼酸：質(zhì)量分數(shù)98%，北京百靈威科技有限公司；檸檬酸三鈉：分析純，國藥化學(xué)試劑有限公司。

電子天平：CPA225D，pH計：PB-10，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：DF-101S，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；紫外可見分光光度計：Cary-60，安捷倫科技有限公司；透析袋：HT1134-5，Yobios生物科技有限公司；透射電鏡：H-7650，日立科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 苯硼酸功能化納米金(Au@PBA)的制備

1.2.1.1 Au NPs的制備

參照文獻[15]，向圓底燒瓶中加入10 mL超純水、92 μLc(氯金酸)=97 mmol/L的溶液，加熱煮沸后，在磁力攪拌下迅速加入1.0 mLc(檸檬酸三鈉)=38.8 mmol/L的溶液，繼續(xù)加熱攪拌10 min，可觀察到溶液顏色由淡黃色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榛疑罱K變?yōu)榫萍t色；停止加熱，待溶液冷卻后轉(zhuǎn)移至透析袋中用水透析6 h，將得到的Au NPs溶液于4 ℃下避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 EDC/NHS偶聯(lián)法合成Au@PBA

將3.32 mg 3-氨基苯硼酸、2.3 mg NHS溶解于2 mL醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH=5.6)中，再加入3.83 mg EDC，45 ℃下反應(yīng)1 h后，加入10 mL上述Au NPs溶液，調(diào)節(jié)溶液至pH=7.4，室溫下攪拌反應(yīng)6 h，將反應(yīng)液用水透析，直至水中無3-氨基苯硼酸的紫外吸收峰。

1.2.1.3 靜電自組裝法合成Au@PBA

取10 mL Au NPs溶液于小燒杯中，加入0.5 mg 3-氨基苯硼酸，室溫攪拌反應(yīng)6 h，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至透析袋中用水透析，直至水中無3-氨基苯硼酸的紫外吸收峰。

1.2.1.4 配位共價鍵法合成Au@PBA

取10 mL Au NPs溶液于小燒杯中，用c(NaOH)=0.5 mol/L的溶液調(diào)節(jié)至pH≈11.0，攪拌下緩慢加入100 μLc(4-巰基苯硼酸)=0.1 mmol/L的溶液，室溫下攪拌反應(yīng)12 h；將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至透析袋中用水透析，直至水中無4-巰基苯硼酸的紫外吸收峰。

1.2.2 標準溶液的配制

稱取0.001 0 g SAL于10 mL容量瓶中，加入c(NH3-NH4Cl)=20 mmol/L緩沖液(pH=8.5)溶解，得到儲備液。使用時，用緩沖液稀釋至所需濃度即可。

1.2.3 檢測方法

將制備好的Au@PBA溶液用NH3-NH4Cl緩沖液(pH=8.5)稀釋10倍，取該溶液900 μL于2 mL離心管中，加入100 μL SAL標準溶液，反應(yīng)10 min后掃描溶液的吸收光譜，對比SAL加入前后溶液最大吸收波長的變化。

1.2.4 Au@PBA用量的選擇

量取100、200、300 μLρ(SAL)=1.5 μg/mL的標準溶液，分別加入到900、800、700 μLAu@PBA溶液中，10 min后掃描溶液的吸收光譜，計算650與530 nm處吸光度的比值(A650/A530)。改變ρ(SAL)=1.0、0.50 μg/mL，方法同上。對比3種ρ(SAL)下A650/A530值，確定Au@PBA的最佳用量。

1.2.5 標準曲線

取900 μL Au@PBA于2 mL的離心管中，分別加入100 μLρ(SAL)=0.1、0.2、0.5、1.0、1.5 μg/mL的標準溶液(平行5份)，反應(yīng)10 min后，掃描溶液的吸收光譜，計算A650/A530，以A650/A530為縱坐標，ρ(SAL)為橫坐標作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 Au@PBA的合成與表征

首先，以檸檬酸三鈉為還原劑和穩(wěn)定劑，合成了Au NPs；然后采用3種不同的方法向Au NPs表面修飾苯硼酸，得到Au@PBA。在EDC/NHS偶聯(lián)法中，Au NPs表面的羧基和3-氨基苯硼酸形成酰胺鍵；自組裝法的原理是Au NPs表面的羧基與3-氨基苯硼酸通過靜電吸引力結(jié)合；配位共價鍵法的原理是4-巰基苯硼酸與Au NPs形成金屬配位鍵。通過比較這3種方法所得Au@PBA的穩(wěn)定性，選擇最佳合成方案。

經(jīng)過多次的實驗發(fā)現(xiàn)，配位共價鍵法合成的Au@PBA溶液放置1 d后由酒紅色變?yōu)榛宜{色，說明其性質(zhì)極不穩(wěn)定，發(fā)生了團聚。

EDC/NHS偶聯(lián)法和靜電自組裝法合成Au@PBA的紫外可見吸收光譜圖見圖1。

λ/nma EDC/NHS偶聯(lián)法

λ/nmb 靜電自組裝法圖1 EDC/NHS偶聯(lián)法和靜電自組裝法合成Au@PBA的紫外可見吸收光譜圖

由圖1可知，EDC/NHS偶聯(lián)法合成的Au@PBA相比于Au NPs發(fā)生了明顯的紅移，其最大吸收波長為610 nm，說明Au@PBA性質(zhì)不穩(wěn)定，發(fā)生了輕微的團聚；通過靜電自組裝法合成的Au@PBA的最大吸收波長為535 nm，相比于Au NPs幾乎沒有變化，這說明Au@PBA的性質(zhì)穩(wěn)定，基本沒有發(fā)生團聚。

Au NPs和靜電自組裝法合成的Au@PBA透射電鏡圖見圖2。

由圖2可知，靜電自組裝前的Au NPs粒徑約為15 nm，且分散性好、粒徑均勻；經(jīng)過3-氨基苯硼酸修飾后，Au@PBA仍然分散良好、未發(fā)生團聚，這與紫外吸收光譜的結(jié)果一致。因此，選擇靜電自組裝法合成的Au@PBA進行SAL的檢測。

a Au NPs

b 靜電自組裝法合成的Au@PBA圖2 Au NPs和靜電自組裝法合成的Au@PBA透射電鏡圖

2.2 Au@PBA對SAL的檢測原理

向900 μL Au@PBA溶液中加入100 μLρ(SAL)=1.5 μg/mL的溶液，反應(yīng)10 min后，溶液顏色由淺紅色變?yōu)樯钏{色。

向Au@PBA中加入SAL前、后的紫外吸收光譜圖見圖3。

λ/nm圖3 向Au@PBA中加入SAL前、后的紫外吸收光譜圖

由圖3可知，加入SAL后，Au@PBA溶液的最大吸收波長由530 nm紅移至650 nm，這說明SAL與Au@PBA結(jié)合，使Au@PBA發(fā)生了交聯(lián)聚集。

向Au@PBA中加入SAL前、后的透射電鏡圖見圖4。

a 加入SAL前

b 加入SAL后圖4 向Au@PBA中加入SAL前、后的透射電鏡圖

由圖4可知，加入SAL前Au@PBA的分散良好，而加入SAL后Au@PBA發(fā)生了明顯的團聚，這一結(jié)果與紫外吸收光譜分析一致。

SAL與Au@PBA的結(jié)合原理見圖5。

圖5 Au@PBA與SAL結(jié)合的示意圖

由圖5可知，SAL分子中含有1,3-二羥基和氨基，可分別與Au@PBA表面的硼酸基和羧基結(jié)合，使Au@PBA發(fā)生交聯(lián)聚集，因而最大吸收波長由530 nm紅移至650 nm，溶液由酒紅色變?yōu)樯钏{色。因此，根據(jù)兩波長下吸光度的變化與ρ(SAL)的關(guān)系，可實現(xiàn)對SAL的定量檢測。

2.3 Au@PBA用量的選擇

Au@PBA的用量是影響靈敏度的關(guān)鍵因素。在ρ(SAL)=0.5、1.0、1.5 μg/mL時，考察了V(Au@PBA)∶V(SAL)對吸光度的影響，結(jié)果見圖6。

由圖6可知，V(Au@PBA)∶V(SAL)=9∶1，A650/A530的值最大；并且隨著ρ(SAL)的增大，A650/A530也逐漸增大。因此，選擇V(Au@PBA)∶V(SAL)=9∶1時對SAL進行檢測，可獲得最高的靈敏度。

ρ(SAL)/(μg mL-1)圖6 V(Au@PBA)∶V(SAL)對A650/A530的影響

2.4 標準曲線

將100 μLρ(SAL)=0、0.1、0.2、0.5、1.0、1.5 μg/mL的溶液與900 μL Au@PBA溶液混合(分別記為1、2、3、4、5、6樣品)，反應(yīng)10 min后，可以觀察到溶液顏色變化，結(jié)果見圖7。

圖7 不同ρ(SAL)溶液與Au@PBA混合后溶液顏色的變化

由圖7可知，溶液顏色由酒紅變?yōu)樗{灰色，并且ρ(SAL)越大，藍色越明顯，這是高ρ(SAL)溶液與Au@PBA結(jié)合，促使Au@PBA發(fā)生交聯(lián)聚集的結(jié)果。

以A650/A530為縱坐標、ρ(SAL)為橫坐標作圖，得到標準曲線，結(jié)果見圖8。

ρ(SAL)/(μg·mL-1)圖8 標準曲線

由圖8可知，線性關(guān)系良好，因此可用于對SAL的定量檢測。

3 結(jié) 論

對Au@PBA的3種合成方法進行了對比，其中，以檸檬酸三鈉為還原劑和穩(wěn)定劑合成的Au NPs與3-羧基苯硼酸通過靜電自組裝得到的Au@PBA性質(zhì)穩(wěn)定，并成功應(yīng)用于SAL的檢測。該方法簡便快捷、成本低廉、肉眼可見，并且能在10 min內(nèi)得到檢測結(jié)果，具有良好的實際應(yīng)用前景。