不同部位來源脂肪干細(xì)胞促進(jìn)移植脂肪存活的實(shí)驗(yàn)研究*

楊艷清， 陳俊偉， 劉遠(yuǎn)航， 付 潔， 徐 丹， 江昌艷

武漢市第三醫(yī)院(武漢大學(xué)同仁醫(yī)院)整形外科，武漢 430060

自體顆粒脂肪移植在整形美容外科領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，特別在面部年輕化的治療方面發(fā)揮重要的作用[1-3]。為了促進(jìn)移植脂肪的存活，臨床上在進(jìn)行自體顆粒脂肪移植時常常加入脂肪干細(xì)胞，即干細(xì)胞輔助脂肪移植(cell-assisted lipotransfer，CAL)技術(shù)[4-5]。脂肪干細(xì)胞存在于人體多個部位，本研究觀察了分別來自腹部和大腿的脂肪干細(xì)胞在體內(nèi)促進(jìn)移植脂肪存活方面的差異，為臨床選擇脂肪干細(xì)胞的獲取部位提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

脂肪組織取自2015年3月至2017年2月在武漢市第三醫(yī)院整形外科行脂肪抽吸術(shù)的女性患者，共14例，包括來自腹部和大腿的脂肪組織標(biāo)本各7例?；颊吣挲g19～36歲，平均24.28歲。2組患者年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義。上述標(biāo)本的獲取均征得患者本人知情同意。

雌性裸鼠7只，購自北京華阜康生物科技股份有限公司[動物許可證編號：SCXK(京)2014-0004]，質(zhì)量15～18 g，4周齡。

1.2 人脂肪干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

在無菌條件下分別抽吸獲取7例腹部和7例大腿的脂肪組織標(biāo)本，PBS反復(fù)浸泡沖洗，洗凈標(biāo)本上的血液。清洗后加入等體積的0.1%Ⅰ型膠原酶，恒溫水浴鍋消化60 min后在低速離心機(jī)中以1200 r/min離心6 min。棄除懸浮的脂肪顆粒、脂滴、脂肪細(xì)胞和培養(yǎng)液，保留最下層的細(xì)胞沉淀。用含有10%胎牛血清(FBS)、1%雙抗(青霉素和鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)液重懸，以1×106/mL的細(xì)胞密度接種于75 cm2的培養(yǎng)瓶內(nèi)，然后放入恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。收集培養(yǎng)的第3代細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

1.3 脂肪干細(xì)胞輔助脂肪移植模型的制備

收集培養(yǎng)的第3代脂肪干細(xì)胞，自體顆粒脂肪均取自腹部。取4周齡雌性裸鼠7只，將裸鼠用2%戊巴比妥鈉按照50 mg/kg進(jìn)行腹腔注射麻醉，然后利用注射器將細(xì)胞注射至裸鼠背部皮下。每只裸鼠移植3個部位，一側(cè)為腹部來源脂肪干細(xì)胞輔助脂肪移植組(A組)：將數(shù)量為1×106/mL腹部來源脂肪干細(xì)胞混懸于0.2 mL DMEM培養(yǎng)液中，然后與0.3 mL脂肪細(xì)胞混合；對稱的另一側(cè)為大腿來源脂肪干細(xì)胞輔助脂肪移植組(B組)：將數(shù)量為1×106/mL大腿來源脂肪干細(xì)胞混懸于0.2 mL DMEM培養(yǎng)液中，然后與0.3 mL脂肪細(xì)胞混合；另外一處(背部尾側(cè)端中線處)為陰性對照組(C組)：0.2 mL DMEM完全培養(yǎng)液與0.3 mL脂肪細(xì)胞均勻混合?；旌虾蟮募?xì)胞按照隨機(jī)原則注射于裸鼠腰背區(qū)皮下的3個區(qū)域。

1.4 脂肪移植術(shù)后觀察

脂肪移植術(shù)后3個月，對移植的脂肪組織進(jìn)行觀察，包括①移植物組織的細(xì)胞鑒定：對分離培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行油紅O染色觀察；②移植物體積測定：術(shù)后3個月取材，肉眼觀察并測算移植物體積大小(移植物長徑×寬徑×高×π/6)；③濕重測量：沿移植物包膜外分離，完整取出移植物，用電子天平對其進(jìn)行濕重測定。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面抗原的表達(dá)

本實(shí)驗(yàn)選取了FITC熒光素標(biāo)記的CD13、CD29、CD44、CD45、CD90和CD105單克隆抗體，使用流式細(xì)胞儀檢測培養(yǎng)的第3代細(xì)胞，結(jié)果顯示，從脂肪組織分離培養(yǎng)的干細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)記物CD13、CD29、CD44、CD90和CD105，而不表達(dá)造血細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)記物CD45(圖1)。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測脂肪干細(xì)胞表面抗原標(biāo)記物的表達(dá)Fig.1 Expression of cell surface CD markers of ADSCs by flow cytometry

2.2 移植物細(xì)胞油紅O染色結(jié)果

觀察分離培養(yǎng)獲得的細(xì)胞，可見胞質(zhì)內(nèi)有少量微小脂滴形成，細(xì)胞油紅O染色后可見脂滴被染成橘紅色(圖2)，符合脂肪細(xì)胞的細(xì)胞學(xué)特征。

圖2 細(xì)胞油紅O染色(×400)Fig.2 Cells stained with oil red O staining(×400)

2.3 大體觀察

術(shù)后3個月，A組脂肪塊體積最大，B組脂肪塊體積次之，C組移植物體積明顯小于其他組(圖3)。其中A組移植物體積平均值為(0.065±0.008)cm3，B組移植物體積平均值為(0.032±0.006)cm3，C組移植物體積平均(0.011±0.004)cm3。實(shí)驗(yàn)組(A組和B組)移植物體積與陰性對照組的差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)，A組與B組兩組間比較，移植物體積差異亦具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 濕重測量

術(shù)后3個月，A組和B脂肪移植物濕重分別為(0.201±0.020)g、(0.146±0.070)g，兩組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

A：腹部來源脂肪干細(xì)胞輔助脂肪移植組；B：大腿來源脂肪干細(xì)胞輔助脂肪移植組；C：陰性對照組圖3 植入術(shù)后3個月大體觀察圖Fig.3 Gross observation 3 months after implantation

3 討論

Matsumoto等[6]首先提出細(xì)胞輔助脂肪移植的概念，脂肪組織來源干細(xì)胞在體內(nèi)可促進(jìn)游離移植脂肪的存活已得到證實(shí)[6-7]。干細(xì)胞輔助脂肪移植中脂肪干細(xì)胞的作用可能包括：可分化為脂肪細(xì)胞并促進(jìn)脂肪組織再生；可分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管生成；可釋放血管生成因子，誘導(dǎo)移植脂肪周圍血管再生等[8-9]。不同部位來源的脂肪干細(xì)胞促進(jìn)血管化的作用不盡相同，前期我們的研究發(fā)現(xiàn)：與來自大腿的脂肪干細(xì)胞相比較，來自腹部的脂肪干細(xì)胞在向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化和分泌血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子方面有更多的優(yōu)勢，可能更利于新生血管的形成[10]。干細(xì)胞輔助脂肪移植技術(shù)也可以改善游離移植脂肪的存活率，脂肪干細(xì)胞存在于身體多個部位，不同部位來源的脂肪干細(xì)胞在促進(jìn)體內(nèi)移植脂肪存活方面有無差異性，是本課題研究的重點(diǎn)內(nèi)容。

我們分別分離及培養(yǎng)來自腹部和大腿的脂肪干細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀檢測，結(jié)果顯示，細(xì)胞表面出現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞特異性標(biāo)志物CD13、CD29、CD44、CD90和CD105，而不表達(dá)造血系的表面標(biāo)記物CD45，符合間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，且由非造血系細(xì)胞分化而來。將培養(yǎng)的第3代脂肪干細(xì)胞與取自同一人體的腹部顆粒脂肪混合移植于裸鼠腰背部皮下，然后觀察移植物體積和濕重的變化。移植術(shù)后3個月，細(xì)胞油紅O染色后可見脂滴被染成橘紅色，符合脂肪細(xì)胞的細(xì)胞學(xué)特征，說明移植存活的組織為脂肪組織。實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組A組(腹部來源脂肪干細(xì)胞輔助脂肪移植組)、實(shí)驗(yàn)組B組(大腿來源脂肪干細(xì)胞輔助脂肪移植組)和陰性對照組脂肪塊體積分別是(0.065±0.008)cm3、(0.032±0.006)cm3和(0.011±0.004)cm3。實(shí)驗(yàn)組移植物體積明顯大于對照組(均P<0.01)，而A組體積又大于與B組，差異亦具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。A組和B組脂肪移植物濕重分別為(0.201±0.020)g和(0.146±0.070)g，兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。上述研究結(jié)果表明脂肪干細(xì)胞可以促進(jìn)移植脂肪的存活，而且來自腹部的脂肪干細(xì)胞可能比來自大腿的脂肪干細(xì)胞更易促進(jìn)腹部脂肪顆粒的存活。

我們的研究中不同部位獲取的脂肪干細(xì)胞出現(xiàn)促進(jìn)脂肪存活的差異，這可能與不同部位脂肪干細(xì)胞的功能差異有關(guān)。這在一定程度上提示我們，在臨床利用脂肪干細(xì)胞輔助脂肪移植技術(shù)時，獲取來自于腹部的脂肪干細(xì)胞可能更有利于促進(jìn)腹部顆粒脂肪的存活。由于本研究采集的顆粒脂肪都來自于腹部，如果取來自于大腿的顆粒脂肪，不同部位脂肪干細(xì)胞輔助移植時是否也存在存活率的差異性，以及同一部位脂肪干細(xì)胞是否更利于同一部位的顆粒脂肪存活，將是我們下一步要研究的問題。