• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    寵物犬牙菌斑的微生物菌群結(jié)構(gòu)分析

    2020-11-21 04:27:02周常喜趙一帆張艷萍崔利鑫吳實(shí)權(quán)
    關(guān)鍵詞:牙菌斑高通量單胞菌

    韓 磊,周常喜,趙一帆,張艷萍,崔利鑫,吳實(shí)權(quán),陳 武

    (北京農(nóng)學(xué)院 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 102206)

    牙周疾病是成年犬最常見口腔疾病之一,在所有犬種中患病率高達(dá)80%以上[1]。在英國,犬的牙周疾病已經(jīng)與骨關(guān)節(jié)炎和超重/肥胖并列成為影響動物福利的三大重要疾病[2]。

    細(xì)菌及其形成的牙菌斑是一切口腔疾病的始動因子[3]。由于衛(wèi)生習(xí)慣或口腔清潔的難度大,在犬常會形成牙菌斑的大量蓄積,口腔微生物濃度增高,進(jìn)而引發(fā)嚴(yán)重的口臭、齒齦炎、齒齦出血、齲齒、齒折與齒根膿腫等繼發(fā)疾病。輕則影響食欲和采食量,重則進(jìn)食困難甚至停止進(jìn)食,繼發(fā)營養(yǎng)不良和多種疾病乃至危及生命。分析牙菌斑的微生物菌群結(jié)構(gòu),對于防治各種口腔疾病,保障犬只健康有著十分重要的意義。近年來,人們對微生物組研究領(lǐng)域的革命性進(jìn)展都是歸功于高通量測序技術(shù)以及宏基因組學(xué)的發(fā)展。同在高通量測序技術(shù)出現(xiàn)之前的細(xì)菌培養(yǎng)的方法相比,許多培養(yǎng)條件苛刻的微生物在高通量測序技術(shù)的幫助下得以被檢測到,而且高通量測序技術(shù)可以檢測到許多的低豐度物種,因此使用不依賴培養(yǎng)法的細(xì)菌16S rRNA基因測序?yàn)榭焖俅_定犬牙菌斑樣本的微生物群落結(jié)構(gòu)和犬牙科疾病的診斷與防治藥物的研發(fā)提供了可能。

    1 材料與方法

    1.1 材 料

    樣本來自于北京地區(qū)動物醫(yī)院接受免疫接種的健康犬64只,品種不限,年齡分布在2到8歲之間。試驗(yàn)犬在采樣前4周內(nèi)沒有接受過抗生素治療,并且在牙齒上可以用眼觀察到存在顏色深淺不同的牙菌斑。

    采樣前,先用無菌生理鹽水對要進(jìn)行樣本采集的牙齒進(jìn)行沖洗,將唾液以及食物殘?jiān)宄缓笫褂脽o菌刀片在沖洗區(qū)域沿牙齒表面刮擦,使用3只無菌棉棒分別沾取刀片上的牙菌斑樣本,將無菌棉棒連同牙菌斑樣本一同分別置15 mL無菌離心管中,-80℃冰箱保存。隨機(jī)抽取一只樣本進(jìn)行檢測,其余2只作為備份。

    1.2 方 法

    1.2.1 樣本總DNA提取,PCR擴(kuò)增及測序 牙菌斑樣本的DNA采用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit (50)試劑盒嚴(yán)格按照使用說明提取,然后使用1%的瓊脂糖凝膠電泳來對提取出來的DNA進(jìn)行完整性、純度、片段大小和濃度的檢測。

    16S rRNA的V3~V4可變區(qū)通用引物設(shè)計(jì)為:341F:CCTACGGGNBGCASCAG,805R:GACTACNVGGGTATCTAATCC。PCR體系擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃變性30 s,退火30 s,72 ℃延伸60 s,共25個循環(huán)。

    樣品送至博淼生物科技有限公司在HiSeq2500/MiSeq測序平臺對牙菌斑微生物的16SrRNA V3~V4區(qū)進(jìn)行高通量測序。

    1.2.2 數(shù)據(jù)分析 首先,用FASTQC軟件對原始的下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量檢測,將Adaptor和低質(zhì)量的堿基序列去除掉,對測序原始的下機(jī)數(shù)據(jù)和質(zhì)控后的樣品reads數(shù)及數(shù)據(jù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì),然后對得到的全部有效序列進(jìn)行后續(xù)分析。依據(jù)GreenGenes數(shù)據(jù)庫,利用Mothur軟件進(jìn)行計(jì)算,最終得到可用的不包含嵌合體的序列。

    根據(jù)序列的相似性水平,在QIIME(V1.9.1)軟件中以97%的序列相似性將序列分化為數(shù)個操作分類單元(Operation Taxonomic Unit,OTU),在得到OTU分組情況后,通過對數(shù)據(jù)庫中已有的reference taxonomy(RT)參考,將OTU進(jìn)行分類注釋。

    將各樣本的OTU在QIIME2軟件上進(jìn)行計(jì)算,從而得出稀釋曲線和多樣性指數(shù),檢驗(yàn)此次試驗(yàn)數(shù)據(jù)的有效性以及可用性。然后對各樣本微生物群落結(jié)構(gòu)組成進(jìn)行分析,以在所有樣本中均有分布并且相對豐度均值≥2% 的菌屬[4]為標(biāo)準(zhǔn),對微生物群落結(jié)構(gòu)中的核心菌屬進(jìn)行定義。

    2 結(jié) 果

    2.1 牙菌斑樣本的DNA序列分析

    牙菌斑樣本的DNA經(jīng)過在Illumina HiSeq測序平臺上的測序,本次試驗(yàn)一共獲得1 567 731條優(yōu)質(zhì)序列,平均每個樣本為24 495條,這些序列可以被分類為 14個門,159個屬。通過QIIME2軟件對測序的出的OTUs數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算,繪制出各個樣本的chao1指數(shù),Shannon-Wiener指數(shù),Simpson指數(shù)以及Observed-species稀疏曲線圖,得出的所有曲線趨勢全部趨于平坦,代表本次測序的深度和寬度均達(dá)到要求。

    2.2 牙菌斑微生物結(jié)構(gòu)

    根據(jù)對數(shù)據(jù)庫中的RT將本次試驗(yàn)測得的序列進(jìn)行物種分類,再構(gòu)建樣本與物種分類單元序列豐度矩陣,使用QIME軟件對每個樣本和每個物種單元分類進(jìn)行序列豐度計(jì)算,從64例健康犬牙菌斑樣本中分類到 14個門。其中門水平的高豐度菌落(相對豐度>5%)有5個,占總序列數(shù)的96.93 %,分別為:變形菌門(Proteobacteria,37.24%)、擬桿菌門(Bacteroidetes,28. 48%)、放線菌門(Actinobacteria,12. 26%)、螺旋體門(Spirochaetes ,9.58%)、梭桿菌門(Fusobacteria,9. 38%)。本次試驗(yàn)除了發(fā)現(xiàn)5個豐度較高門水平的菌落以外,還有 5個門水平的菌落在每個樣本中均有分布但相對豐度較小,分別是厚壁菌門(Firmicutes)、綠菌門(Chlorobi)、TM7、SR1、互養(yǎng)菌門(Synergistetes)。由此可見,牙菌斑微生物群落在門水平的分布相對集中。

    同時,犬牙菌斑微生物群落結(jié)構(gòu)在屬水平的分布也相對集中,根據(jù)對核心菌屬的定義共得到6個核心菌屬,占微生物總序列的 73.41% 。分別為:卟啉單胞菌屬(Porphyromonas,19.96%)、放線菌屬(Actinomyces,14.12%)、棒桿菌屬(Corynebacterium,12.19%)、奈瑟菌屬(Neisseria,13.24%)、梭桿菌屬(Fusobacterium,9.17% )、密螺旋體屬 (Treponema,4.73%),見圖 1。

    注:圖中橫坐標(biāo)代表每個樣本,縱坐標(biāo)為百分比,每個曲線色塊代表一個菌屬所占該樣本的微生物群落屬層面的相對含量,不同顏色的色塊代表不同的菌屬

    3 討 論

    在本研究之前,牙菌斑 (plaque)這一名詞最早被Williams于1989年所提出,并且國外寵物臨床上的許多研究已經(jīng)揭示犬牙周病的主要病因?yàn)檠谰叩募?xì)菌微生物所導(dǎo)致的[5]。目前,寵物犬的飲食習(xí)慣為質(zhì)地相對較軟的商品糧和罐頭等食物,這會導(dǎo)致食物殘?jiān)例X之間的摩擦作用顯著下降 ,使得黏性食物殘?jiān)械牡鞍自谘例X上大量附著,充足的蛋白為口腔中的常在細(xì)菌提供了營養(yǎng)以及附著點(diǎn),經(jīng)過長時間的聚合從而形成了牙菌斑。而且對寵物犬牙齒進(jìn)行刷牙的護(hù)理經(jīng)常被大多數(shù)的動物主人所忽視,造成牙菌斑在牙齒上的大量增厚蓄積,引發(fā)犬的各類牙周疾病。所以說,牙菌斑是一切口腔疾病的始動因子[6]。因此,對于牙菌斑的微生物群落結(jié)構(gòu)的研究很有必要。

    微生物組中的核心菌屬是指所有或者絕大多數(shù)樣本共有的微生物[7],目前在國內(nèi)的寵物臨床中,類似對犬牙菌斑微生物群落的相關(guān)研究報(bào)道較少,部分現(xiàn)有的研究只對牙菌斑微生物群落中所含有的細(xì)菌菌屬進(jìn)行了報(bào)道[8],而本研究通過對1 567 731條優(yōu)質(zhì)的可鑒定序列進(jìn)行分析,確定了核心菌屬群落在犬牙菌斑微生物群落結(jié)構(gòu)中的分布。通過本次試驗(yàn)可以得出,同在門水平定義微生物的核心微生物組相比,在屬水平來定義要顯得更加合理。

    在國外對牙菌斑微生物群落結(jié)構(gòu)的研究中,Amy Sturgeon[9]等通過對六只狗的健康口腔樣本進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)在健康口腔中最常見的菌屬是卟啉單胞菌屬(39.2%),鐮刀菌屬(4.5%),嗜二氧化碳噬細(xì)胞菌屬(3.8%),德克斯氏菌屬(3.7%),莫拉氏菌屬(3.3%)和貝氏菌屬(2.7%)。通本次試驗(yàn)的結(jié)果相對比,牙菌斑微生物群落結(jié)構(gòu)中與健康口腔中微生物核心菌屬差異較大,只有卟啉單孢菌屬的相對豐度降低,這可能與卟啉單胞菌屬與后期增長的密螺旋體屬相結(jié)合,而形成了口腔微生物的“紅色復(fù)合物”有關(guān)[10]。 Ian J. Davis[11]等從健康牙齦,牙齦炎和輕度牙周炎的223只狗中收集齦下菌斑樣品發(fā)現(xiàn),卟啉單胞菌是所有疾病階段中最豐富的屬,尤其是在健康牙齦樣本中更為明顯。

    Changin等通過對人與犬的牙菌斑的主要菌屬對比,發(fā)現(xiàn)犬類的主要屬是放線菌屬,卟啉單胞菌屬和奈瑟氏球菌屬[12],Dent和Marsh對9種動物(猴子,狐猴,老虎, ,長頸鹿和4只美國可卡犬)的牙菌斑進(jìn)行了研究,證明了所有動物共有一個基本菌斑微生物群落的假設(shè),他們提出以放線菌屬,棒桿菌屬,梭菌屬,奈瑟菌屬為代表可能構(gòu)成人和動物齒齦緣斑塊的基本成分[13]。Takada和Hirasawa通過研究發(fā)現(xiàn)牙菌斑與犬牙周炎疾病關(guān)系密切,他們認(rèn)為棒桿菌屬在犬牙周炎中的作用可能與牙齦卟啉單胞菌在人牙周炎中的作用相同[14]。Patel和Vadalia通過對53只犬牙菌斑相關(guān)的口腔細(xì)菌菌群進(jìn)行鑒定,他們從犬的口腔中分離出的菌屬包括放線菌屬,奈瑟菌,卟啉單胞菌屬,密螺旋體屬可能構(gòu)成犬牙菌斑的基本成分[11]。Davis等在犬牙菌斑的大型橫斷面研究中,發(fā)現(xiàn)牙齦卟啉單胞菌是所有健康狀態(tài)中最常見的細(xì)菌,在牙齦下菌斑中的相對豐度為7.4[15]%。在本研究中,對犬牙菌斑樣本中核心菌屬的研究同以上文獻(xiàn)研究結(jié)果一致,表明不同地區(qū)犬的口腔牙菌分布基本相同。

    犬牙齒所在的口腔環(huán)境復(fù)雜,隨著溫度,pH值以及飲食習(xí)慣的變化都會導(dǎo)致牙齒表面的微生物群落發(fā)生改變,雖然本研究對牙菌斑微生物群落結(jié)構(gòu)中的核心菌屬群落做出了探究,但是,如何針對菌屬結(jié)構(gòu),采取有效減少口腔細(xì)菌數(shù)量的方法,從而保護(hù)牙齒健康,這些都有待今后去進(jìn)一步探究。

    綜上所述,通過本次對64例健康犬牙菌斑微生物群落的高通量測序分析確定了6個核心菌屬,為進(jìn)一步研究犬牙菌斑和預(yù)防犬牙周疾病的藥物研發(fā)及篩選提供了基礎(chǔ)研究材料,并且為寵物臨床上對于犬牙周疾病的治療提供了參考。

    猜你喜歡
    牙菌斑高通量單胞菌
    什么是牙菌斑
    高通量衛(wèi)星網(wǎng)絡(luò)及網(wǎng)絡(luò)漫游關(guān)鍵技術(shù)
    國際太空(2023年1期)2023-02-27 09:03:42
    高通量血液透析臨床研究進(jìn)展
    如何預(yù)防牙菌斑?
    健康之家(2019年9期)2019-12-14 03:44:43
    Ka頻段高通量衛(wèi)星在鐵路通信中的應(yīng)用探討
    如果停止刷牙會發(fā)生什么
    槲皮素改善大鼠銅綠假單胞菌肺感染
    中成藥(2017年9期)2017-12-19 13:34:21
    天天說刷牙,但是刷的真是“牙”本身嗎?
    中國通信衛(wèi)星開啟高通量時代
    持續(xù)性根尖周炎中牙齦卟啉單胞菌的分離與鑒定
    亚洲成人免费av在线播放| 欧美人与善性xxx| 免费看不卡的av| a级片在线免费高清观看视频| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 美女高潮到喷水免费观看| 亚洲一区二区三区欧美精品| 午夜久久久在线观看| 日韩成人av中文字幕在线观看| 国产精品久久久久久精品电影小说| 丝瓜视频免费看黄片| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 亚洲国产最新在线播放| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 男女床上黄色一级片免费看| 久久精品亚洲av国产电影网| 亚洲七黄色美女视频| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 美国免费a级毛片| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 无遮挡黄片免费观看| 另类亚洲欧美激情| 在线天堂最新版资源| 亚洲av成人精品一二三区| 日本爱情动作片www.在线观看| 麻豆乱淫一区二区| 国产成人午夜福利电影在线观看| 亚洲人成电影观看| 午夜免费鲁丝| 三上悠亚av全集在线观看| 亚洲在久久综合| 久久精品亚洲av国产电影网| 久久97久久精品| 国产亚洲一区二区精品| 亚洲,欧美精品.| 五月开心婷婷网| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 久热爱精品视频在线9| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 99国产精品免费福利视频| 高清黄色对白视频在线免费看| 美女主播在线视频| 免费av中文字幕在线| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 日韩av免费高清视频| 各种免费的搞黄视频| 亚洲国产中文字幕在线视频| 男女高潮啪啪啪动态图| 午夜久久久在线观看| 久久久久人妻精品一区果冻| www.熟女人妻精品国产| 久久久久久久久免费视频了| 国产成人a∨麻豆精品| 中文字幕高清在线视频| 我要看黄色一级片免费的| 在现免费观看毛片| 妹子高潮喷水视频| 国产野战对白在线观看| 亚洲情色 制服丝袜| 黄色怎么调成土黄色| 99久久综合免费| 老司机在亚洲福利影院| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产毛片在线视频| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 性少妇av在线| 精品一区二区三区av网在线观看 | 国产成人av激情在线播放| 9热在线视频观看99| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 一区二区日韩欧美中文字幕| 亚洲在久久综合| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 看非洲黑人一级黄片| 一级片'在线观看视频| 夫妻午夜视频| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 亚洲综合色网址| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 黑人猛操日本美女一级片| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 午夜激情久久久久久久| 欧美少妇被猛烈插入视频| 精品第一国产精品| 搡老乐熟女国产| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 久久久久久免费高清国产稀缺| 日本欧美视频一区| 91国产中文字幕| 免费观看性生交大片5| 九九爱精品视频在线观看| 国产高清不卡午夜福利| 一本色道久久久久久精品综合| 色婷婷久久久亚洲欧美| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 亚洲av中文av极速乱| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 妹子高潮喷水视频| 免费观看人在逋| 777米奇影视久久| av女优亚洲男人天堂| 热99久久久久精品小说推荐| 波多野结衣一区麻豆| 一区二区三区四区激情视频| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 两性夫妻黄色片| 久久97久久精品| 国产乱人偷精品视频| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 午夜激情久久久久久久| 蜜桃国产av成人99| 国产精品av久久久久免费| 国产精品人妻久久久影院| 成年人午夜在线观看视频| 国产精品国产av在线观看| 在线观看免费日韩欧美大片| 啦啦啦在线免费观看视频4| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 国产成人精品无人区| www.精华液| 久久久精品区二区三区| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 最新在线观看一区二区三区 | 国产精品久久久久久精品古装| 成人免费观看视频高清| 两性夫妻黄色片| 国产亚洲欧美精品永久| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 国精品久久久久久国模美| 嫩草影视91久久| 黄频高清免费视频| 久久久精品94久久精品| 免费黄网站久久成人精品| 精品免费久久久久久久清纯 | 麻豆乱淫一区二区| 国产精品av久久久久免费| 久久久国产一区二区| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 精品酒店卫生间| 国产97色在线日韩免费| 国产乱来视频区| 国产一区二区激情短视频 | 人人妻人人澡人人看| 国产在视频线精品| 久久av网站| 日韩精品有码人妻一区| 国产精品99久久99久久久不卡 | 亚洲国产最新在线播放| 黄片小视频在线播放| 亚洲美女视频黄频| 最近2019中文字幕mv第一页| 成人亚洲精品一区在线观看| av又黄又爽大尺度在线免费看| 秋霞在线观看毛片| 90打野战视频偷拍视频| 一级片'在线观看视频| 亚洲精品在线美女| 国产免费福利视频在线观看| av国产精品久久久久影院| 国产日韩欧美亚洲二区| 只有这里有精品99| 高清欧美精品videossex| 两个人免费观看高清视频| 日本色播在线视频| 美女国产高潮福利片在线看| 亚洲中文av在线| 成年女人毛片免费观看观看9 | 高清在线视频一区二区三区| 男女边摸边吃奶| 高清不卡的av网站| 人妻 亚洲 视频| 99精品久久久久人妻精品| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 精品一区二区三区av网在线观看 | av免费观看日本| av电影中文网址| 国产一卡二卡三卡精品 | 黄色 视频免费看| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| av一本久久久久| 999久久久国产精品视频| 大话2 男鬼变身卡| 99久久综合免费| 久热这里只有精品99| 精品国产乱码久久久久久小说| 国产免费一区二区三区四区乱码| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 国产男女内射视频| 伊人久久国产一区二区| 亚洲熟女精品中文字幕| www日本在线高清视频| 免费在线观看完整版高清| 精品一区二区免费观看| 免费看av在线观看网站| 国产精品av久久久久免费| 青春草亚洲视频在线观看| 自线自在国产av| a级毛片在线看网站| av卡一久久| 两个人免费观看高清视频| 人人妻人人澡人人看| 国产精品一区二区精品视频观看| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 久久 成人 亚洲| 一区二区日韩欧美中文字幕| 亚洲成国产人片在线观看| 亚洲欧美激情在线| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 亚洲欧美色中文字幕在线| av在线观看视频网站免费| 精品国产国语对白av| 日韩欧美一区视频在线观看| 亚洲免费av在线视频| 麻豆乱淫一区二区| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产成人免费无遮挡视频| h视频一区二区三区| 少妇被粗大猛烈的视频| 在线免费观看不下载黄p国产| 色94色欧美一区二区| 欧美中文综合在线视频| 波多野结衣av一区二区av| 国产 一区精品| 国产精品久久久久久精品电影小说| 亚洲中文av在线| 激情五月婷婷亚洲| 免费少妇av软件| 99精品久久久久人妻精品| 黄色视频在线播放观看不卡| 亚洲成人av在线免费| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 99热国产这里只有精品6| 少妇 在线观看| 国产熟女欧美一区二区| 丝袜美足系列| 九草在线视频观看| 国产成人av激情在线播放| 欧美97在线视频| bbb黄色大片| 国产日韩欧美视频二区| 国产成人精品无人区| 热re99久久国产66热| 久久亚洲国产成人精品v| av又黄又爽大尺度在线免费看| 欧美 日韩 精品 国产| 日韩人妻精品一区2区三区| 欧美乱码精品一区二区三区| 久久久久久久久久久免费av| 国产成人av激情在线播放| 日韩精品免费视频一区二区三区| 最新在线观看一区二区三区 | 国产精品久久久av美女十八| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 日本色播在线视频| 久久久久久免费高清国产稀缺| 久久99一区二区三区| 久久 成人 亚洲| 欧美激情 高清一区二区三区| 在线观看三级黄色| tube8黄色片| 又大又黄又爽视频免费| 国产一级毛片在线| 中文欧美无线码| 老司机在亚洲福利影院| 国产av码专区亚洲av| 黄色怎么调成土黄色| 午夜福利一区二区在线看| 七月丁香在线播放| 亚洲伊人色综图| 亚洲美女黄色视频免费看| 亚洲一区中文字幕在线| 天堂中文最新版在线下载| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 亚洲欧美成人精品一区二区| 伦理电影免费视频| h视频一区二区三区| 亚洲免费av在线视频| 亚洲精品国产av蜜桃| 欧美日韩成人在线一区二区| 狂野欧美激情性bbbbbb| 在线看a的网站| 好男人视频免费观看在线| 久久久久精品人妻al黑| 校园人妻丝袜中文字幕| 亚洲,欧美精品.| 午夜久久久在线观看| 日本91视频免费播放| 国产极品粉嫩免费观看在线| 国产精品久久久久久久久免| 男人操女人黄网站| 丝袜在线中文字幕| 亚洲美女黄色视频免费看| 少妇 在线观看| 国产成人精品久久二区二区91 | 19禁男女啪啪无遮挡网站| 久久久久精品国产欧美久久久 | 一二三四在线观看免费中文在| 国产成人精品在线电影| 啦啦啦在线免费观看视频4| 久久av网站| 欧美另类一区| 国产精品国产av在线观看| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 悠悠久久av| 一区二区三区精品91| 老司机亚洲免费影院| 最近中文字幕2019免费版| 国产免费视频播放在线视频| av有码第一页| 亚洲成人手机| 黑丝袜美女国产一区| 一二三四中文在线观看免费高清| 看免费成人av毛片| 免费观看性生交大片5| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 中国国产av一级| 国产精品久久久人人做人人爽| 成人三级做爰电影| 在线观看免费视频网站a站| 亚洲国产欧美在线一区| 国产淫语在线视频| svipshipincom国产片| 精品视频人人做人人爽| 多毛熟女@视频| 日韩精品免费视频一区二区三区| 国产激情久久老熟女| 欧美精品高潮呻吟av久久| 亚洲伊人久久精品综合| 国产野战对白在线观看| 日韩中文字幕视频在线看片| 国产成人系列免费观看| 国产亚洲欧美精品永久| 日本av手机在线免费观看| 一区二区日韩欧美中文字幕| av一本久久久久| 国产av一区二区精品久久| 啦啦啦在线观看免费高清www| 午夜福利视频在线观看免费| 最新在线观看一区二区三区 | 国产一卡二卡三卡精品 | 日韩视频在线欧美| 国产成人啪精品午夜网站| 国产淫语在线视频| 亚洲国产欧美在线一区| 精品国产一区二区三区四区第35| 成人三级做爰电影| 久热这里只有精品99| 国产精品三级大全| 一区二区日韩欧美中文字幕| 成人影院久久| 中文字幕人妻丝袜一区二区 | 免费观看av网站的网址| 在线 av 中文字幕| 日韩人妻精品一区2区三区| 97人妻天天添夜夜摸| 国产成人精品久久二区二区91 | 美女脱内裤让男人舔精品视频| av国产久精品久网站免费入址| 久久久国产精品麻豆| 毛片一级片免费看久久久久| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 热re99久久国产66热| 波野结衣二区三区在线| 色播在线永久视频| 99国产综合亚洲精品| av国产久精品久网站免费入址| 国产高清不卡午夜福利| av不卡在线播放| 在线看a的网站| 美女国产高潮福利片在线看| 视频在线观看一区二区三区| 妹子高潮喷水视频| 日韩精品有码人妻一区| 精品亚洲成国产av| 久久久国产一区二区| 精品一品国产午夜福利视频| www.熟女人妻精品国产| 国产精品二区激情视频| 中文字幕av电影在线播放| 黄色视频不卡| 亚洲成人手机| 精品免费久久久久久久清纯 | 免费看不卡的av| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 人妻一区二区av| 久久久久久久久免费视频了| 亚洲中文av在线| 99久久99久久久精品蜜桃| 叶爱在线成人免费视频播放| 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲一区二区三区欧美精品| 999精品在线视频| 免费在线观看黄色视频的| 亚洲专区中文字幕在线 | 秋霞伦理黄片| 久久久久人妻精品一区果冻| 亚洲国产日韩一区二区| 欧美乱码精品一区二区三区| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 国产精品一区二区精品视频观看| 成人手机av| 中文字幕制服av| 又大又黄又爽视频免费| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| www.精华液| 宅男免费午夜| 国产1区2区3区精品| 波野结衣二区三区在线| 五月天丁香电影| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 黄色 视频免费看| 亚洲欧洲国产日韩| 免费黄频网站在线观看国产| svipshipincom国产片| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 久久99热这里只频精品6学生| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 91精品国产国语对白视频| 人体艺术视频欧美日本| 国产 精品1| 丝袜人妻中文字幕| 悠悠久久av| 国产一区二区在线观看av| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| av网站在线播放免费| 另类亚洲欧美激情| 亚洲精品av麻豆狂野| 免费观看a级毛片全部| 久久久久久免费高清国产稀缺| 少妇被粗大猛烈的视频| av在线老鸭窝| 欧美精品av麻豆av| 不卡视频在线观看欧美| 91精品伊人久久大香线蕉| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 九色亚洲精品在线播放| 制服诱惑二区| 男女午夜视频在线观看| 免费av中文字幕在线| 亚洲,欧美,日韩| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 99精国产麻豆久久婷婷| 亚洲欧美一区二区三区国产| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 日本91视频免费播放| 亚洲欧洲日产国产| 十八禁网站网址无遮挡| 午夜福利影视在线免费观看| 母亲3免费完整高清在线观看| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 亚洲欧洲国产日韩| 男女无遮挡免费网站观看| 国产视频首页在线观看| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 天天操日日干夜夜撸| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 操出白浆在线播放| 美女午夜性视频免费| 激情五月婷婷亚洲| 亚洲中文av在线| 超碰成人久久| 久久精品亚洲av国产电影网| 伊人久久国产一区二区| 黑人猛操日本美女一级片| 国产在线视频一区二区| 午夜福利影视在线免费观看| 丝袜人妻中文字幕| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 美女扒开内裤让男人捅视频| 捣出白浆h1v1| 热99国产精品久久久久久7| 十八禁人妻一区二区| 自线自在国产av| av网站在线播放免费| 午夜福利,免费看| 久久精品国产综合久久久| 国产福利在线免费观看视频| 婷婷成人精品国产| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 一级毛片 在线播放| 久久久精品免费免费高清| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 少妇人妻精品综合一区二区| 一区二区av电影网| 秋霞伦理黄片| 91精品国产国语对白视频| 国产福利在线免费观看视频| 婷婷色av中文字幕| 中文字幕色久视频| 熟女av电影| 91精品伊人久久大香线蕉| 午夜福利网站1000一区二区三区| 国产成人欧美| 777米奇影视久久| 国产精品二区激情视频| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 另类亚洲欧美激情| 午夜日韩欧美国产| 老鸭窝网址在线观看| 中文字幕制服av| 国产男人的电影天堂91| 日本黄色日本黄色录像| 女性被躁到高潮视频| 久久性视频一级片| 国产日韩欧美亚洲二区| 久久影院123| 免费高清在线观看日韩| 秋霞在线观看毛片| 99久久精品国产亚洲精品| 人妻 亚洲 视频| 美女福利国产在线| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 成年av动漫网址| 一级片'在线观看视频| 久久久久精品人妻al黑| 久久久久网色| 欧美日韩一级在线毛片| h视频一区二区三区| 日日摸夜夜添夜夜爱| 亚洲七黄色美女视频| 国产一级毛片在线| 久久久国产一区二区| 黄色视频不卡| 国产精品99久久99久久久不卡 | 日韩一区二区视频免费看| 国产成人免费无遮挡视频| av网站免费在线观看视频| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产精品免费大片| 国产免费现黄频在线看| 狂野欧美激情性bbbbbb| 国产成人91sexporn| 欧美变态另类bdsm刘玥| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 麻豆av在线久日| 日日啪夜夜爽| 国产精品免费视频内射| 国产一区二区在线观看av| 蜜桃在线观看..| 一本久久精品| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 中文字幕制服av| 欧美国产精品一级二级三级| 色94色欧美一区二区| 99热全是精品| 爱豆传媒免费全集在线观看| 久久久久精品人妻al黑| 黄色视频在线播放观看不卡| 精品久久久久久电影网| 亚洲男人天堂网一区| 欧美国产精品va在线观看不卡| 波多野结衣一区麻豆| avwww免费| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 丝袜人妻中文字幕| 国产一区有黄有色的免费视频| xxxhd国产人妻xxx| 老鸭窝网址在线观看| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 999久久久国产精品视频| 国产片内射在线| 精品国产乱码久久久久久男人| 丰满饥渴人妻一区二区三| 国产一区亚洲一区在线观看| 国产精品久久久人人做人人爽| 一级毛片我不卡| 青草久久国产| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 国产亚洲精品第一综合不卡| 校园人妻丝袜中文字幕| 母亲3免费完整高清在线观看| 亚洲少妇的诱惑av| 久久综合国产亚洲精品| 欧美精品一区二区大全| 高清在线视频一区二区三区| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 在线看a的网站| av线在线观看网站| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 欧美xxⅹ黑人| 九九爱精品视频在线观看| 成人漫画全彩无遮挡| 国产成人精品无人区| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 色视频在线一区二区三区| 永久免费av网站大全| www.自偷自拍.com| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 嫩草影视91久久| 久久综合国产亚洲精品| 美女大奶头黄色视频| 精品亚洲成国产av| 丁香六月欧美| 只有这里有精品99| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| netflix在线观看网站| 日本色播在线视频| 国产午夜精品一二区理论片| av不卡在线播放|