陰山胡枝子種子萌發(fā)期的耐鹽性及其對(duì)鹽脅迫的生理響應(yīng)

趙 露，姜鳳琴，苗玉華，張曉宇，劉治國(guó)，劉桂霞

(1.河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002； 2.張家口市林業(yè)和草原局草原監(jiān)理站，河北 張家口 075000； 3.內(nèi)蒙古赤峰市敖漢旗農(nóng)牧局，內(nèi)蒙古 赤峰 024300)

受全球氣候變化、人口不斷增長(zhǎng)的影響，土壤鹽堿化程度日趨嚴(yán)重，造成農(nóng)作物減產(chǎn)；土地鹽堿化現(xiàn)象已成為我國(guó)農(nóng)業(yè)面臨的重要生態(tài)環(huán)境問(wèn)題之一[1]。土壤中高濃度的鹽會(huì)導(dǎo)致植物生理干旱，生長(zhǎng)受到抑制，通常表現(xiàn)為植株形態(tài)變得矮小，葉片顏色變?yōu)榘稻G，生長(zhǎng)速度變得緩慢，植物的細(xì)胞膜透性被破壞，一些與膜結(jié)合的酶類活性也被降低，從而引發(fā)植物一系列的代謝失調(diào)。因此，鹽濃度對(duì)植物產(chǎn)量和生長(zhǎng)影響較大，會(huì)影響植物絕大部分的重要生命過(guò)程[3]。高鹽度會(huì)導(dǎo)致植物減產(chǎn)甚至死亡。因此，土壤鹽脅迫對(duì)植物的危害不容忽視，而研究不同種類不同濃度鹽溶液對(duì)種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響非常必要。

陰山胡枝子[Lespedezainschanica(Maxim.) Schindl.]為豆科(Leguminosae)胡枝子屬(Lespedeza)的落葉小灌木，廣泛分布于東北、華北、山西等地，是林緣、山地灌叢的伴生成分，適應(yīng)性強(qiáng)，耐干旱瘠薄，根系比較發(fā)達(dá)，是理想的水土保持植物和綠肥作物；營(yíng)養(yǎng)豐富，是優(yōu)良的飼用植物[2]。研究表明，陰山胡枝子對(duì)NaCl 溶液的脅迫表現(xiàn)出較好的耐受性，耐鹽半致死濃度為1.0%[3]，而對(duì)Na2CO3和復(fù)鹽脅迫下陰山胡枝子的耐受性未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)采用3種不同鹽分處理陰山胡枝子種子，測(cè)定萌發(fā)期的萌發(fā)指標(biāo)和生理指標(biāo)，以期為陰山胡枝子在不同鹽堿地環(huán)境下的育苗與開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用2018年采自河北省張家口市沽源縣的陰山胡枝子種子，室內(nèi)進(jìn)行干燥和清選，去除果皮，4 ℃冰箱中貯存，2019年3月進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

本試驗(yàn)設(shè)置了Na2CO3、NaCl、復(fù)鹽(50%NaCl、30%Na2SO4、10%NaHCO3、10%Na2CO3)等3種鹽溶液，每種鹽分別設(shè)置0.3%、0.6%、0.9%等3種濃度，以清水為對(duì)照，共10個(gè)處理，每處理4次重復(fù)。陰山胡枝子種子的萌發(fā)采用培養(yǎng)皿濾紙法培養(yǎng)。首先稱取適量的種子放入80 ℃水中泡30 min。然后從中挑取飽滿、未萌發(fā)的種子放于75%酒精中消毒10 min，再用無(wú)離子水洗凈，最后在鋪有雙層濾紙、已加目標(biāo)濃度的鹽溶液的培養(yǎng)皿中放置50粒種子，放入(25±5)℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天定時(shí)補(bǔ)充溶液，并從點(diǎn)種第2天就開始每天定時(shí)觀察和記錄種子的發(fā)芽數(shù)量，到種子萌發(fā)狀態(tài)穩(wěn)定時(shí)(28 d)計(jì)算發(fā)芽率。

在種子萌發(fā)穩(wěn)定期取樣測(cè)定陰山胡枝子抗氧化酶活性(超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)、過(guò)氧化氫酶(CAT))、可溶性蛋白含量等數(shù)據(jù)，在種子萌發(fā)結(jié)束后取樣測(cè)定相對(duì)葉綠素含量和胚根的長(zhǎng)度等數(shù)據(jù)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)

鹽堿害指數(shù)(%)=[(對(duì)照種子的發(fā)芽率-處理種子的發(fā)芽率)/對(duì)照發(fā)芽率]×100%。

耐鹽堿級(jí)別評(píng)價(jià)方法為，通過(guò)公式計(jì)算鹽堿害指數(shù)，確定耐鹽堿級(jí)別，其中鹽堿害指數(shù)為0～20.00%，耐鹽堿級(jí)別為1級(jí)；鹽堿害指數(shù)為20.10%～40.00%，耐鹽堿級(jí)別為2級(jí)；鹽堿害指數(shù)為40.10%～60.00%，耐鹽堿級(jí)別為3級(jí)；鹽堿害指數(shù)為60.10%～80.00%，耐鹽堿級(jí)別為4級(jí)；鹽堿害指數(shù)為80.10%～100.00%，耐鹽堿級(jí)別為5級(jí)[4]。

耐鹽指數(shù)=(平均相對(duì)發(fā)芽率+平均胚根長(zhǎng)度+相對(duì)發(fā)芽勢(shì))/3[5]；

發(fā)芽率(%)=(處理種子的發(fā)芽率/供試種子數(shù))×100%[6]；

發(fā)芽勢(shì)(%)=(發(fā)芽種子數(shù)高峰日正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%；

胚根長(zhǎng)(cm)：萌發(fā)10 d后每種處理各取10株幼苗用刻度尺測(cè)量其胚根長(zhǎng)度，并計(jì)算平均值。

相對(duì)葉綠素含量(SPAD)：試驗(yàn)結(jié)束后每種處理各取5株陰山胡枝子幼苗，用SPAD-502 Plus便攜式葉綠素測(cè)定儀測(cè)定其相對(duì)葉綠素含量，計(jì)算平均值。

抗氧化酶活性：本試驗(yàn)測(cè)定采用氮藍(lán)四唑(NBT)法超氧化物歧化酶的活性、愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過(guò)氧化物酶的活性和紫外吸光光度法測(cè)定過(guò)氧化氫酶活性[7]。

可溶性蛋白含量：應(yīng)用考馬斯亮藍(lán)(G-250)染色法[8]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均用Microsoft Excel軟件進(jìn)行記錄，并依據(jù)相對(duì)應(yīng)公式計(jì)算，計(jì)算結(jié)果運(yùn)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，使用Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行不同處理間顯著性分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，最后使用Microsoft Excel軟件作圖。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 鹽脅迫對(duì)陰山胡枝子種子發(fā)芽率的影響

3種鹽脅迫都對(duì)陰山胡枝子種子的發(fā)芽率產(chǎn)生了顯著影響(p<0.05)。由圖1可知，隨著鹽脅迫濃度的增加，3種鹽處理的發(fā)芽率均呈顯著降低的趨勢(shì)；同一濃度不同鹽溶液脅迫下發(fā)芽率也有顯著差異。當(dāng)濃度為0.3%時(shí)，Na2CO3、NaCl、復(fù)鹽處理的發(fā)芽率均較對(duì)照顯著降低，分別降低了30.4%，16.9%和18.6%；NaCl和復(fù)鹽處理的發(fā)芽率差異不顯著，但均顯著高于Na2CO3處理的發(fā)芽率；當(dāng)濃度為0.6%時(shí)，Na2CO3和復(fù)鹽處理的發(fā)芽率降低幅度大，分別較對(duì)照降低了82.9%和75.8%；NaCl處理的降低幅度較小，降低了30.7%；當(dāng)濃度為0.9%時(shí)，各鹽分處理之間差異顯著，NaCl和復(fù)鹽處理的顯著高于Na2CO3處理的發(fā)芽率，但兩者之間差異不顯著。

注：大寫字母代表同種鹽溶液，不同濃度處理之間的差異顯著； 小寫字母代表相同濃度不同鹽溶液處理之間的差異顯著。下同。圖1 鹽脅迫對(duì)陰山胡枝子種子發(fā)芽率的影響

2.2 鹽脅迫對(duì)陰山胡枝子種子胚根長(zhǎng)的影響

鹽脅迫顯著影響了陰山胡枝子的胚根長(zhǎng)(p<0.01)。由圖2可知，Na2CO3溶液、NaCl溶液和復(fù)鹽溶液處理的陰山胡枝子胚根長(zhǎng)度均隨濃度增加而顯著降低，與對(duì)照相比，下降幅度為28.7%～76.7%。同一濃度下不同鹽處理胚根長(zhǎng)由高到低的順序均為NaCl>復(fù)鹽>Na2CO3；NaCl溶液處理對(duì)胚根長(zhǎng)的抑制作用弱于Na2CO3和復(fù)鹽。

圖2 鹽脅迫對(duì)陰山胡枝子幼苗胚根長(zhǎng)度的影響

2.3 鹽脅迫對(duì)陰山胡枝子種子相對(duì)葉綠素含量的影響

由圖3可知，隨著濃度的增加，各種鹽溶液處理的陰山胡枝子幼苗的相對(duì)葉綠素含量均顯著降低，且在0.3%濃度后相對(duì)葉綠素含量基本不變。同一濃度下，不同鹽溶液處理之間的陰山胡枝子相對(duì)葉綠素含量差異不顯著。

圖3 鹽脅迫對(duì)陰山胡枝子幼苗相對(duì)葉綠素含量的影響

2.4 鹽脅迫對(duì)陰山胡枝子種子抗氧化酶活性的影響

2.4.1SOD活性

鹽脅迫顯著影響了陰山胡枝子種子萌發(fā)期的SOD活性(p<0.05)。由圖4可知，除Na2CO30.3%濃度處理顯著高于對(duì)照、復(fù)鹽0.9%濃度處理與對(duì)照差異不顯著外，3種鹽溶液處理的陰山胡枝子萌發(fā)期種子的SOD活性均較對(duì)照顯著降低。Na2CO3脅迫下，隨著濃度的增加，陰山胡枝子的SOD活性呈先上升后下降的趨勢(shì)。

2.4.2POD活性

鹽脅迫顯著影響了陰山胡枝子種子萌發(fā)期POD活性(p<0.01)。由圖5可知，Na2CO3、NaCl、復(fù)鹽溶液處理的陰山胡枝子種子的POD活性均隨鹽溶液濃度增加而顯著降低，對(duì)照組與各濃度處理之間，以及各濃度處理之間的POD活性均有顯著差異。同一濃度下，不同鹽分之間也有顯著差異，復(fù)鹽的抑制作用更強(qiáng)，POD活性在0.3%和0.6%濃度處理下顯著低于其它2種鹽溶液處理的POD活性。

圖4 鹽脅迫對(duì)陰山胡枝子SOD活性的影響

圖5 鹽脅迫對(duì)陰山胡枝子POD活性的影響

2.4.3CAT活性

鹽脅迫顯著影響了陰山胡枝子種子萌發(fā)期的CAT活性(p<0.05)。由圖6可知，除Na2CO30.3%濃度處理顯著高于對(duì)照外，3種鹽溶液處理的陰山胡枝子萌發(fā)期種子的CAT活性均顯著低于對(duì)照。Na2CO3溶液處理的陰山胡枝子種子的CAT活性隨濃度升高呈先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)濃度為0.3%時(shí)，陰山胡枝子的CAT活性最高；當(dāng)濃度為0.6%時(shí)，CAT活性最低。復(fù)鹽溶液處理的陰山胡枝子種子CAT活性隨濃度升高呈先下降后上升的趨勢(shì)；當(dāng)濃度為0.3%時(shí)，CAT活性最低，當(dāng)濃度從0.6%到0.9%時(shí)，CAT活性逐漸上升，但仍低于對(duì)照組的CAT活性。同一濃度處理下，3種鹽脅迫處理之間的差異均顯著，陰山胡枝子種子的CAT活性最低的均為NaCl溶液。

2.5 可溶性蛋白含量

鹽脅迫顯著影響了陰山胡枝子的可溶性蛋白含量(p<0.01)。由圖7可知，隨著鹽溶液濃度的增加，可溶性蛋白含量增加；0.3%的Na2CO3溶液處理的陰山胡枝子種子可溶性蛋白含量低于對(duì)照組處理，但差異不顯著。3種鹽溶液均對(duì)種子的可溶性蛋白含量有促進(jìn)作用。復(fù)鹽在濃度為0.3%時(shí)，可溶性蛋白含量最高，較對(duì)照提高了70.6%；Na2CO3和NaCl在0.9%濃度下可溶性含量最高，分別較對(duì)照提高了143.1%和157.1%。Na2CO3溶液處理的陰山胡枝子種子可溶性蛋白含量隨濃度升高先降低后升高；NaCl溶液處理的陰山胡枝子種子的可溶性蛋白含量隨濃度升高而升高。

圖6 鹽脅迫對(duì)陰山胡枝子CAT活性的影響

圖7 鹽脅迫對(duì)陰山胡枝子可溶性蛋白含量的影響

2.6 鹽脅迫下陰山胡枝子的耐鹽性

從表1可知，同種鹽脅迫下陰山胡枝子的耐鹽指數(shù)之隨濃度升高而下降；Na2CO3和復(fù)鹽在0.3%～0.6%濃度間減幅較大；從耐鹽指數(shù)和鹽堿害指數(shù)綜合看，陰山胡枝子對(duì)NaCl和復(fù)鹽脅迫在0.3%濃度下均表現(xiàn)出高耐受性；0.6%濃度下，對(duì)NaCl表現(xiàn)出耐受性；0.6%及更高濃度下，對(duì)復(fù)鹽脅迫表現(xiàn)為中敏和敏感，對(duì)Na2CO3表現(xiàn)為敏感。

表1 鹽脅迫下陰山胡枝子的耐鹽性

3 討論與結(jié)論

3.1 討 論

陰山胡枝子種子的發(fā)芽率、胚根的長(zhǎng)度可直接反映其生長(zhǎng)情況。發(fā)芽率是種子活力的重要指標(biāo)。不同種類的鹽溶液對(duì)陰山胡枝子種子發(fā)芽率存在顯著的抑制作用， NaCl處理的降低幅度相對(duì)較小，Na2CO3處理和復(fù)鹽處理的抑制作用強(qiáng)于NaCl處理，其中抑制陰山胡枝子種子發(fā)芽率程度最強(qiáng)的是Na2CO3溶液。說(shuō)明陰山胡枝子對(duì)NaCl脅迫的耐受性較強(qiáng)，這與張桂榮等[3]的研究結(jié)果相似，他們研究發(fā)現(xiàn)，陰山胡枝子在0.4% NaCl溶液脅迫下發(fā)芽率為86%，表現(xiàn)出較好的耐受性。但本試驗(yàn)同時(shí)說(shuō)明，同種植物對(duì)不同的鹽脅迫的耐受性不同；鹽脅迫對(duì)胚根生長(zhǎng)的抑制作用與發(fā)芽率類似的趨勢(shì)，3種鹽的脅迫也是Na2CO3處理和復(fù)鹽處理的抑制作用強(qiáng)于NaCl處理。

葉綠素也是對(duì)鹽脅迫最敏感的細(xì)胞器，其含量直接影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育[9]。孟富宣等研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫達(dá)到一定濃度后降低了葉綠素含量，進(jìn)而使光合速率下降[10]。3種鹽溶液處理陰山胡枝子后，幼苗的相對(duì)葉綠素含量均顯著降低,說(shuō)明鹽脅迫會(huì)通過(guò)降低葉綠素含量進(jìn)而抑制植物生長(zhǎng)。

SOD活性下降說(shuō)明植物體內(nèi)的超氧陰離子自由基、羥自由基和過(guò)氧化氫等不斷產(chǎn)生，促使陰山胡枝子幼苗啟動(dòng)了相應(yīng)的適應(yīng)性反應(yīng)，但隨著鹽濃度增加和脅迫繼續(xù)加深，活性氧的積累超出了陰山胡枝子幼苗的抗氧化酶系統(tǒng)可能清除的范圍，從而整個(gè)抗氧化酶系統(tǒng)功能降低，這與孟富宣等[10]、李龍興等[16]的研究結(jié)果一致。0.3%Na2CO3脅迫時(shí)，SOD活性和CAT活性相應(yīng)增強(qiáng)，可能是堿性鹽(Na2CO3)對(duì)陰山胡枝子種子萌發(fā)抑制較強(qiáng)，使得SOD活性升高以清除體內(nèi)脅迫產(chǎn)生的超氧陰離子自由基、羥自由基和過(guò)氧化氫等，進(jìn)而減輕對(duì)細(xì)胞的傷害。

可溶性蛋白質(zhì)大部分是與植物的新陳代謝活動(dòng)相關(guān)的酶類，因此其含量能反映出植物組織的代謝能力[17]。本試驗(yàn)表明，Na2CO3、NaCl和復(fù)鹽脅迫時(shí)陰山胡枝子可溶性蛋白均隨脅迫濃度增加而顯著增加，說(shuō)明鹽脅迫誘導(dǎo)細(xì)胞合成了新的蛋白質(zhì)，陰山胡枝子靠增加新抗性蛋白合成提高蛋白含量改變胞內(nèi)滲透勢(shì)，而0.3%Na2CO3脅迫時(shí)，可能陰山胡枝子種子通過(guò)抑制蛋白合成、加速儲(chǔ)藏蛋白水解提高抗鹽性，所以在不同鹽脅迫時(shí)有不同反應(yīng)機(jī)制。鹽脅迫時(shí)，可溶性蛋白含量顯著上升，既能以合成抗氧化酶方式保持細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)穩(wěn)定[16]，也能以結(jié)構(gòu)物質(zhì)的形式參與細(xì)結(jié)構(gòu)傷害的修復(fù)過(guò)程[18]。隨著脅迫濃度的增加,抗氧化酶含量升高，但鹽濃度達(dá)到一定高度后，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，抗氧化酶活性降低，酶系統(tǒng)受損，可溶性蛋白調(diào)節(jié)作用變小，增加的脯氨酸的滲透調(diào)節(jié)作用不足以應(yīng)對(duì)鹽脅迫，細(xì)胞受損甚至危及植物生命[10,16]。

陰山胡枝子酶活性的變化與耐鹽等級(jí)和耐鹽指數(shù)表現(xiàn)的耐鹽性相符合，說(shuō)明陰山胡枝子對(duì)中性鹽(NaCl)的耐受性較強(qiáng)，對(duì)堿性鹽和復(fù)鹽較敏感；鹽脅迫下，通過(guò)應(yīng)激反應(yīng)合成新的蛋白質(zhì)，參與抗氧化酶和細(xì)胞結(jié)構(gòu)修復(fù)以降低或減少對(duì)細(xì)胞的傷害，但這種調(diào)節(jié)能力在高鹽分脅迫時(shí)可能超出了其可能清除的范圍，整個(gè)抗氧化酶系統(tǒng)功能降低，這與發(fā)芽率和胚根長(zhǎng)等的耐鹽性指標(biāo)相符。

3.2 結(jié) 論

3種鹽處理的發(fā)芽率、胚根長(zhǎng)均隨濃度升高而顯著降低，NaCl溶液處理對(duì)發(fā)芽率、胚根長(zhǎng)的抑制作用弱于Na2CO3和復(fù)鹽，0.6%的NaCl處理較對(duì)照降低了30.7%。各種鹽溶液處理的陰山胡枝子幼苗的相對(duì)葉綠素含量均顯著低于對(duì)照。

除Na2CO30.3%濃度顯著高于對(duì)照外，3種鹽溶液處理的陰山胡枝子萌發(fā)期種子的SOD和CAT活性均較對(duì)照顯著降低。同一濃度處理下，陰山胡枝子種子的CAT活性最低的均為NaCl溶液。POD活性均隨鹽溶液濃度增加而顯著降低。復(fù)鹽的抑制作用更強(qiáng)，POD活性在0.3%和0.6%濃度下顯著低于其它2種鹽溶液的POD活性。

隨著鹽溶液濃度的增加，可溶性蛋白含量增加；3種溶液均對(duì)種子的可溶性蛋白含量有促進(jìn)作用。Na2CO3溶液處理的陰山胡枝子種子可溶性蛋白含量隨濃度升高先降低后升高；NaCl溶液處理的陰山胡枝子種子的可溶性蛋白含量隨濃度升高而升高。

從耐鹽指數(shù)和鹽堿害指數(shù)綜合看，陰山胡枝子對(duì)Na2CO3和復(fù)鹽脅迫在0.3%濃度下均表現(xiàn)出高耐受性；0.3%和0.6%濃度下，對(duì)NaCl表現(xiàn)出高耐受性和耐受性；0.6%及更高濃度下，對(duì)復(fù)鹽脅迫表現(xiàn)為中敏和敏感，對(duì)Na2CO3表現(xiàn)為敏感。

因此，陰山胡枝子有一定的耐鹽性和相應(yīng)的耐鹽機(jī)制，對(duì)0.6%NaCl、0.3% Na2CO3和復(fù)鹽有一定的抗性，陰山胡枝子可以在適宜濃度的鹽堿地種植。