庫爾勒香梨黑斑病病原鑒定

任美佳，張華平，鐘聰慧，張世卿，黃家風*

(1 石河子大學農(nóng)學院/新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲害治理與植保資源利用重點實驗室，新疆 石河子 832003;2 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團第一師農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，新疆 阿拉爾 843300)

庫爾勒香梨栽培歷史悠久、香甜可口、脆爽多汁，具有很高的商品價值與很大的市場競爭優(yōu)勢，在新疆水果產(chǎn)業(yè)中占據(jù)重要地位。但近幾年黑斑病的發(fā)生使庫爾勒香梨生產(chǎn)遭受嚴重危害，尤其是2018年梨黑斑病導致阿拉爾市庫爾勒香梨大面積掉果、爛果，導致近20 hm2果園幾乎絕收，對果農(nóng)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。

研究表明，梨黑斑病主要由鏈格孢屬(Alternaria)真菌引起，目前，全世界從梨上分離并命名的鏈格孢有9個種[1-3]，中國在梨上發(fā)現(xiàn)的鏈格孢有6個種，分別為交鏈格孢(A.alternata)、細極鏈格孢(A.tenuissima)、梨黑斑鏈格孢(A.gaisen)、侵染鏈格孢(A.infectoria)[3-4]、鴨梨侵染鏈格孢(A.yaliinficiens)和A.ventricosa[1-2]。鏈格孢屬真菌種類繁多，兼具寄生性與腐生性，在作物生長期或貯藏期均能侵染植物造成危害，如A.mali在蘋果上[5]、A.brassicae在生菜和胡蘿卜上[6-7]、A.viniferae在葡萄上[8]、A.cucumerina在南瓜、甜瓜、西葫蘆等瓜類作物上[9]引起黑斑病或葉枯病，導致品質(zhì)下降、產(chǎn)量降低，因此鏈格孢屬真菌是引起植物病害的重要類群之一。

鏈格孢屬真菌分類是一個很有爭議的問題，形態(tài)特征一直是鏈格孢屬分類的主要依據(jù)，如梨黑斑鏈格孢(A.gaisen)相對于交鏈格孢(A.alternata)，孢子更大，孢子鏈更短、幾乎沒有分支，因此可以依據(jù)孢子大小與產(chǎn)孢方式將其進行有效區(qū)分[10]。然而對于大多數(shù)小孢子種，因物種之間的高度相似性以及存在一些具有中間性狀的菌株，僅憑形態(tài)學特征很難進行種類鑒定[11]。因此，越來越多的種類鑒定增加了基因進化關(guān)系作為分類依據(jù)，如基于β-微管蛋白基因(tub)、過敏原基因(Alt-a1)、組蛋白基因(His)、翻譯延長因子基因(tef1)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(gpd)、內(nèi)切半乳糖醛酸酶基因(endoPG)構(gòu)建單基因系統(tǒng)發(fā)育樹，通過系統(tǒng)進化關(guān)系對鏈格孢進行種類鑒定，有力促進了鏈格孢分類[11-15]。但是該方法依然存在局限，因為分別以不同的單基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹對同一個菌株進行種類鑒定時，得到的結(jié)果往往不一致[16]。近年發(fā)展的多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育分析法，在一定程度上克服了單基因存在的橫向基因轉(zhuǎn)移和不同基因間進化速率差異對系統(tǒng)發(fā)育樹的影響，得到的結(jié)果比單基因系統(tǒng)發(fā)育分析更為準確，在原核和真核生物的系統(tǒng)發(fā)育研究中得到了廣泛應(yīng)用[17]。如Somma等基于翻譯延長因子基因(tef)、β-微管蛋白基因(tub)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(gpd)和過敏原基因(Alt-a1)構(gòu)建多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹，對引起小麥黑斑病的164個鏈格孢菌菌株進行了鑒定，明確了菌株的種類及其進化關(guān)系[16]。

本研究為了明確新疆阿拉爾市庫爾勒香梨發(fā)生的黑斑病病原，對病株中分離到的鏈格孢菌進行了致病性測定，在形態(tài)學基礎(chǔ)上結(jié)合多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育分析，基于過敏原alt-a1基因(Alt-a1)、鈣調(diào)蛋白基因(Cal)和翻譯延長因子基因(tef1)構(gòu)建多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹，對病原菌進行了種類鑒定，為科學防治梨黑斑病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2018年9月于新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團第一師八團梨園隨機采集表現(xiàn)明顯黑斑的庫爾勒香梨病果41個，4 ℃冰箱保存用于病原菌分離。致病性鑒定所需梨果為同一地區(qū)采集和市售的健康庫爾勒香梨。

1.2 梨黑斑病病原菌的分離與純化

對具有典型黑斑癥狀的果實，采用常規(guī)組織分離法在病健交界處切取0.5 cm×0.5 cm組織塊，依次用0.1%的升汞消毒20 s，75%乙醇消毒10 s，滅菌水清洗3次。然后將組織塊用滅菌濾紙吸干置于PDA培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)5 d；對分離得到的真菌再通過單孢分離獲得純培養(yǎng)菌株。將分離純化的菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d，根據(jù)菌落形態(tài)和分生孢子的形態(tài)將初步確定為鏈格孢的菌株用20%甘油保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 分離菌株的致病力測定

將分離純化的鏈格孢菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d，用滅菌打孔器打取直徑為1 cm菌餅；再用75%乙醇對庫爾勒香梨健康果實進行表面消毒；然后分別通過無傷和有傷接種對分離純化的菌株進行致病性鑒定。無傷接種是將菌塊直接貼于健康梨果表面，用封口膜固定，于25 ℃保濕培養(yǎng)[18]。有傷接種是先用滅菌針在健康果面刺約3 mm深的小孔，再將菌塊貼于健康梨果表面，用封口膜固定，于25 ℃保濕培養(yǎng)。每24 h觀察接種發(fā)病情況，待發(fā)病揭去菌餅。每個菌株設(shè)3個重復，以未接菌的PDA貼塊作為空白對照。

1.4 梨黑斑病病原菌的形態(tài)學鑒定

將有致病力的鏈格孢菌株根據(jù)其在PDA上的培養(yǎng)特征各選取1個代表菌株(P8和P21菌株)進行形態(tài)學鑒定。將菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d，用滅菌刀片在菌落邊緣切取大小為3 mm×3 mm×2 mm的菌塊，置于滅菌載玻片中央，用蓋玻片壓住菌塊邊緣，在25 ℃明暗交替條件下繼續(xù)培養(yǎng)7 d，在光學顯微鏡下觀察蓋玻片下病原菌的產(chǎn)孢方式；對PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的菌株，用滅菌牙簽挑取平板上的孢子，在光學顯微鏡下觀察病原菌分生孢子的形態(tài)、顏色及隔膜數(shù)，至少測量100個分生孢子大小并進行統(tǒng)計。根據(jù)相關(guān)文獻[19]進行病原菌形態(tài)學鑒定。

1.5 梨黑斑病病原菌的分子鑒定

將代表菌株P(guān)8和P21分別在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d，用滅菌載玻片輕輕刮取培養(yǎng)基表面的真菌菌絲和分生孢子，利用真菌DNA提取試劑盒(BioFlux)提取代表菌株的DNA。分別用過敏原基因(Alt-a1)的引物AltaF(5′-ATGCAGTTCACCACCATCGC-3′)和AltaR(5′-ACGAGGGTGAYGTAGGCGTC-3′)[13]、鈣調(diào)蛋白基因(Cal)的引物CalF(5′-AGCAAGTCATCTCCGAGTTCAAGG-3′)和CalR(5′-CTTCTGCATCAYCTGGACG-3′)[20]、翻譯延長因子基因(tef1)的引物EF-1(5′-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3′)和EF-1R(5′-TACTTGAAGGAACCCTTACC-3′)[21]從各菌株基因組DNA中擴增相應(yīng)的基因片段并測序。將測序結(jié)果在NCBI(National Center for Biotechnology Information)上通過BLAST比對；在GenBank中下載相關(guān)參考序列，分別按照Alt-a1和tef1的順序、Alt-a1和Cal的順序進行基因序列整合；以匍柄霉(StemphyliumVesicarium)相應(yīng)的基因序列為外緣[16]，在MEGA 7.0.20軟件中按照BIC標準選擇最佳模型，通過最大似然法Maximum Likelihood(ML)構(gòu)建多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹，對鏈格孢代表菌株進行進化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離與致病性測定

對庫爾勒香梨上表現(xiàn)明顯黑斑的病組織進行真菌分離，共獲得36個純培養(yǎng)菌株，根據(jù)菌落特征和分生孢子形態(tài)，其中34個菌株可初步確定為鏈格孢屬(Alternaria)真菌，占分離菌株總數(shù)的94.4%。如圖1所示，以P8為代表的菌株在PDA上形成的菌落外圈具白色邊緣、中間棕綠色、最內(nèi)圈深褐色，有角狀花紋，占鏈格孢菌株的23%；以P21為代表的菌株菌落最外圈白色邊緣、中間棕綠色、深褐色內(nèi)圈與P8菌株相比明顯變小，無明顯角狀花紋，占鏈格孢菌株的61.5%。對34個鏈格孢菌株進行無傷和有傷接種，結(jié)果均能在健康果面造成與田間相似的癥狀(圖1)：田間自然發(fā)病的病斑初期為黑褐色圓形小點，隨梨果生長病斑逐漸變大，且稍有凹陷，部分病斑為同心輪紋斑。對健康梨果進行有傷接種，3 d即可在接種部位觀察到黑褐色壞死斑點，隨著接種時間的延長，病斑逐漸變大并略有凹陷；無傷接種5～7 d時才能在接種部位產(chǎn)生黑褐色壞死斑點，病斑形狀與有傷接種相似。上述結(jié)果表明，從庫爾勒香梨上分離獲得的鏈格孢是導致黑斑病的致病菌。

圖1 庫爾勒香梨黑斑病的癥狀及病原菌培養(yǎng)性狀

2.2 病原菌的形態(tài)學鑒定

從上述致病的鏈格孢中選取P8和P21菌株作為代表菌株進行形態(tài)學鑒定。如圖2所示，P8菌株的分生孢子梗為褐色，具分枝。分生孢子短鏈生，孢子鏈一般由10個以內(nèi)孢子構(gòu)成；孢子鏈的中間孢子與頂端孢子基部以合軸式延伸產(chǎn)孢，形成樹狀短分支的分生孢子鏈。分生孢子為倒棍棒形、卵形或長橢圓形；淡褐色至褐色，表面光滑或具微刺；具2～5個橫膈膜，0～3個縱隔膜；大小為(6.0～12.5) μm×(11.2～34.5) μm，平均大小為9.3 μm×20.3 μm；無喙或具短喙，部分喙可轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)孢假喙，喙及假喙長0～17.7 μm。根據(jù)這些形態(tài)學特征，初步將P8菌株的種類鑒定為交鏈孢(Alternariaalternata)。

A至C為產(chǎn)孢梗及產(chǎn)孢方式；D至F為分生孢子。

如圖3所示，P21菌株的分生孢子梗淡褐色，偶分枝。分生孢子鏈生，一般由10個以上孢子構(gòu)成；因多數(shù)孢子只在假喙頂端次生產(chǎn)孢，所以分生孢子長鏈多不分枝。分生孢子倒棍棒形或倒梨形，淡褐色至中褐色，表面光滑或具微刺；成熟分生孢子具4～7個橫隔膜，0 ～2個縱隔膜，孢子中部有2～3個主橫隔膜，明顯較粗，略隘縮；大小為(8.6～16.2)μm×(15.9～41.2)μm，平均值為 12.7 μm×25.9 μm，喙及假喙柱狀，長0～44.1 μm。根據(jù)這些形態(tài)學特征，初步將P21菌株的種類鑒定為細極鏈格孢(Alternariatenuissima)。

A至B為分生孢子鏈；C為產(chǎn)孢梗；D至F為分生孢子。

2.3 病原菌的分子生物學鑒定

對P8菌株和P21菌株的基因組DNA進行過敏原基因(Alt-a1)、翻譯延長因子基因(tef1)、鈣調(diào)蛋白基因(Cal)的PCR擴增，P8菌株獲得3個基因長度分別為472、240、787 bp，P21菌株獲得3個基因長度分別為472、240、786 bp。將所有測序結(jié)果在NCBI進行比對，結(jié)果顯示，2個菌株的Alt-a1基因均與交鏈孢(A.alternata)和A.citri具有最高序列相似性(100%)；P8菌株的tef1基因與交鏈孢具有最高序列相似性(98.3%)，P21菌株的tef1基因與交鏈孢、細極鏈格孢(A.tenuissima)和A.citri均具有100%序列相似性；P8和P21菌株的Cal基因均與A.malvae具有最高的序列相似性，分別為100%和99.6%。因此從單個基因的測序結(jié)果無法對2個菌株的種類進行確定。

基于Alt-a1和tef1基因序列構(gòu)建多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)，P8菌株單獨與交鏈孢的2個菌株(LH-4菌株和HMCH-9菌株)聚類在一個小的進化分支上；基于Alt-a1和Cal基因序列構(gòu)建基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5)，P21菌株與細極鏈格孢的3個菌株(EGS38.029、EGS34.015和X1147菌株)聚類在一個進化分支上。因此系統(tǒng)發(fā)育分析進一步支持了上述形態(tài)學鑒定結(jié)果，明確P8菌株的種類是交鏈孢(A.alternata)，P21菌株的種類是細極鏈格孢(A.tenuissima)。

圖4 基于過敏原基因和翻譯延長因子基因構(gòu)建的P8菌株與其他鏈格孢菌的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖5 基于過敏原基因和鈣調(diào)蛋白基因構(gòu)建的P21菌株與其他鏈格孢菌的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論與討論

(1)本研究結(jié)果表明，庫爾勒香梨黑斑病的主要病原種類是交鏈孢(A.alternata)和細極鏈格孢(A.tenuissima)，分離比例分別為23.0%和61.5%。這與我國其他地區(qū)報道的梨黑斑病病原種類的研究結(jié)果基本一致，嚴進等[4]從河北和山東鴨梨黑斑病上分離鑒定的病原種類是交鏈孢、細極鏈格孢和侵染鏈格孢(A.infectoria)，其比例分別是41%、54.8%和1.6%；朱紅艷[3]從湖北地區(qū)的梨黑斑病上分離鑒定的主要病原種類是交鏈孢和細極鏈格孢，梨黑斑鏈格孢(A.gaisen)所占比例較少(4.9%)。鏈格孢屬真菌大多數(shù)種類兼性寄生于植物上，引起包括禾谷類作物、油料作物、果蔬作物及觀賞植物在內(nèi)的多種經(jīng)濟植物病害，造成田間和產(chǎn)后損失，是經(jīng)濟上非常重要的病原真菌[22]，其中交鏈孢和細極鏈格孢寄主范圍廣泛，除引起梨樹黑斑病外，在我國還侵染危害蘋果、棗、藍莓、菠蘿、枸杞等果樹[23-27]，因此交鏈孢和細極鏈格孢是引起我國果樹黑斑病的主要病原種類。

(2)盡管形態(tài)學特征在鏈格孢屬真菌一些種的鑒定上存在難以界定的困難，但依然是種類鑒定不可替代的重要依據(jù)。本研究依據(jù)產(chǎn)孢方式和分生孢子形態(tài)將引起庫爾勒香梨黑斑病的鏈格孢鑒定為交鏈孢和細極鏈格孢。在產(chǎn)孢方式上，交鏈孢以合軸式方式產(chǎn)孢，形成樹狀短分支的分生孢子鏈，孢子鏈一般由10個以內(nèi)的孢子構(gòu)成；細極鏈格孢的孢子鏈多為不分支的長鏈，一般由10個以上孢子構(gòu)成。分生孢子形態(tài)差異表現(xiàn)在細極鏈格孢的成熟孢子中部有2～3個主橫隔膜，明顯較粗；且細極鏈格孢的分生孢子略大于交鏈格孢的分生孢子。因此形態(tài)學特征對交鏈孢和細極鏈格孢的種類鑒定非常重要。

(3)基于不同的單基因?qū)ν粋€鏈格孢菌株進行系統(tǒng)發(fā)育分析時，由于所獲結(jié)果往往不一致，因此越來越多的鏈格孢種類鑒定采用了多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育分析，如基于ITS，Alt-a1和gpd序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，王彩霞[8]將引起葡萄葉斑病的鏈格孢鑒定為3個種；基于ITS、gapdh、rpb2、tef1、Alt-a1和endoPG序列，日本學者[10]將造成草莓黑斑病的鏈格孢鑒定為梨黑斑鏈格孢(A．gaisen)。本研究分別基于Alt-a1和Cal基因、Alt-a1和tef1基因構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，將庫爾勒香梨鏈格孢P8和P21菌株分別鑒定為交鏈孢和細極鏈格孢，并與形態(tài)學鑒定結(jié)果一致。利用基因序列對鏈格孢進行系統(tǒng)進化分析時發(fā)現(xiàn)，在NCBI上檢索單個基因時可以獲得很多相關(guān)參考基因，但對多個目標基因進行檢索時，因不同的菌株可利用的參考基因不同，導致基于3～4個基因構(gòu)建系統(tǒng)進化樹時可利用的參考菌株很少，如本研究采用Alt-a1、Cal和tef13個基因構(gòu)建系統(tǒng)進化樹時，因具有相同目標基因的參考菌株很少，只能針對P8菌株基于Alt-a1和tef1基因搜索具有相應(yīng)基因的參考菌株、針對P21菌株基于Alt-a1和Cal基因搜索具有相應(yīng)基因的參考菌株，構(gòu)建了2個系統(tǒng)進化樹對2個菌株分別進行了系統(tǒng)發(fā)育分析，因此目前利用多基因進行系統(tǒng)發(fā)育分析還存在局限，隨著今后有關(guān)鏈格孢的深度測序?qū)⒂兄摲椒ǖ膹V泛應(yīng)用。