血管生成素樣蛋白6、瘦素與糖尿病腎病的關系

常?，?劉晶 吳文昊 牛樂樂 李興

1山西醫(yī)科大學，太原 030001; 2山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院內分泌科，太原 030009

糖尿病腎病(DN)是糖尿病微血管并發(fā)癥之一，是終末期腎臟疾病的最主要病因[1]。糖代謝紊亂、高血壓、高血脂、年齡等均是DN的危險因素[2]。DN發(fā)生的分子機制可能為高糖誘導腎小球系膜細胞外基質產生、增加Ⅳ型膠原纖維和纖維連接蛋白的表達，導致腎小球硬化和間質損傷，但具體機制仍不清楚[3]。血管生成素樣蛋白6(ANGPTL6)主要在肝臟、脂肪組織中表達，可抑制肝細胞中的糖異生，此外，ANGPTL6可誘導內皮細胞損傷，導致微血管缺血、缺氧的發(fā)生[4-5]。瘦素是由脂肪細胞分泌的調節(jié)機體能量平衡的多肽類激素，在促進腎臟病理生理變化中有直接作用[6-7]。有研究顯示，瘦素可調節(jié)血清ANGPTL6的表達[8]。因此，ANGPTL6與瘦素可能起協(xié)同作用，并與DN相關。

1 對象與方法

1.1 研究對象與分組 選取2018年12月—2019年12月在山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院內分泌科住院治療的2型糖尿病患者97例，根據尿白蛋白排泄率(UAER)分為兩組：單純2型糖尿病組50例(UAER<30 mg/24 h)，男34例，女16例，平均年齡為(54.46±13.02)歲，平均病程為(3.37±5.89)年；DN組47例(UAER≥30 mg/24 h)，男27例，女20例，平均年齡為(60.47±13.87)歲，平均病程為(9.56±22.49)年；同時選取該院同期58名體檢正常者作為對照組，其中男32名，女26名，平均年齡為(46.26±12.87)歲。2型糖尿病根據1999年世界衛(wèi)生組織(WHO)的診斷標準。DN組：收集的患者數據中并無活動性尿沉渣異常，無短期內估算的腎小球濾過率(eGFR)迅速下降、短期內UAER迅速升高或腎病綜合征，故未行腎臟穿刺，故根據UAER升高而做出臨床診斷。糖尿病組治療情況：住院期間平均空腹血糖水平(6.78～10.54 mmol/L),合并高血壓者服用降壓藥(氯沙坦鉀片)后監(jiān)測血壓波動于129/76～154/94 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，合并高脂血癥者給予降脂藥(阿托伐他汀鈣片)，期間未復查血脂，未隨訪；DN組治療情況：住院期間平均空腹血糖水平8.56～15.46 mmol/L，合并高血壓者服用降壓藥(氯沙坦鉀片聯合苯磺酸左旋氨氯地平片)后監(jiān)測血壓波動于148/98～167/108 mmHg，合并高脂血癥者給予降脂藥(阿托伐他汀鈣片)，期間未復查血脂，未隨訪。排除標準:(1)糖尿病急性并發(fā)癥。(2)1型糖尿病及其他類型糖尿病患者。(3)尿路感染及其他嚴重感染者。(4)痛風。(5)合并其他系統(tǒng)疾病等。(6)除外影響尿蛋白的各種生理病理疾病。(7)合并原發(fā)性、繼發(fā)性腎臟疾病及藥物導致的UAER升高。本研究獲得山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院倫理委員會的批準，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 標本留取及生化指標測定 所有研究對象空腹8 h，次日晨7：00抽取靜脈血，離心、分離血清后80℃冰箱儲存，用于測定血清ANGPTL6、瘦素水平；同時抽取靜脈血用于測定空腹血糖、HbA1c、空腹胰島素(FINS)、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白-膽固醇(HDL-C)等指標；留取尿標本，測定尿微量白蛋白及尿肌酐值；穩(wěn)態(tài)模型評估-胰島素抵抗指數(HOMA-IR)=空腹血糖×FINS/22.5；同時進行身高、體重的測量，并計算體重指數=體重/身高2(m2)。

1.2.2 ANGPTL6、瘦素水平的測定 采用酶聯免疫吸附(ELISA)法測定血清ANGPTL6、瘦素水平。過程如下：實驗前標準品、試劑及樣本準備；加樣(標準品或樣本)100 μl，37℃孵育60 min，不洗；甩干，加檢測溶液A 100 μl，37℃孵育60 min；重復洗板3次；加檢測溶液B 100 μl，37℃孵育30 min；洗板5次；加TMB底物90 μl，37℃反應10～20 min；加終止液50 μl，用酶標儀在450 nm測定OD值，做出標準曲線，將OD值帶入方程，求出樣品濃度(ANGPTL6的檢測范圍：3.12～200 μg/L，瘦素檢測范圍：0.156～10 μg/L)，試劑盒購自武漢云克隆科技股份有限公司。

表1 3組間一般資料及生化指標的比較

2 結果

2.1 各組間一般資料及生化指標的比較 各組間性別、體重指數、舒張壓、LDL-C、HDL-C、總膽固醇、甘油三酯比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。單純2型糖尿病組年齡、空腹血糖、FINS、HOMA-IR、HbA1c均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。DN組收縮壓、ANGPTL6、瘦素均高于對照組(P均<0.05)。DN組年齡、空腹血糖、FINS、HOMA-IR、HbA1c均高于單純2型糖尿病組(P均<0.05)，見表1。

2.2 ANGPTL6、瘦素水平與各指標的相關性分析 分別以ANGPTL6、瘦素為因變量，與其他臨床指標進行Pearson相關性分析。AFNGPTL6與年齡、收縮壓、HOMA-IR、HbA1c、UAER、瘦素呈正相關(P均<0.05)。瘦素與年齡、體重指數、收縮壓、HOMA-IR、HbA1c、UAER、ANGPTL6呈正相關(P均<0.05)，見表2。

表2 ANGPTL6、瘦素水平與各臨床指標的相關性分析

2.3 UAER影響因素的多元線性回歸分析 以UAER為自變量，空腹血糖、FINS、收縮壓、HbA1c、HOMA-IR、ANGPTL6、瘦素為因變量進行多元線性回歸分析，經過變量篩選后結果示空腹血糖、ANGPTL6、瘦素為DN的危險因素，見表3。

表3 UAER影響因素的多元線性回歸分析

3 討論

據2017年國際糖尿病聯盟公布的數據顯示，中國2型糖尿病患者2045年將達1.2億，位居世界第一[9]。其中，DN為最常見的微血管并發(fā)癥。研究認為糖脂代謝紊亂、氧化應激、炎性反應、纖維化及細胞因子等多因素參與了DN的發(fā)病環(huán)節(jié)[10]。然而，在疾病早期DN患者的臨床表現常不明顯，直至發(fā)展為大量白蛋白尿才引起重視，此時腎功能嚴重受損，最終需靠透析來維持生命，造成沉重的財政和保健負擔。因此，尋找新的生物學標志物輔助提高DN患者的發(fā)現率、診斷率刻不容緩。

瘦素是由脂肪細胞分泌的一種多肽類激素，參與機體能量代謝[6]。瘦素主要經腎臟代謝，研究發(fā)現，腎小球內皮細胞、系膜細胞可表達高親和力的瘦素受體，瘦素與其受體結合可誘導炎性反應發(fā)生，被認為在腎臟病理生理變化中有直接作用[7]。本研究結果顯示，DN組瘦素水平顯著升高，且與UAER呈正相關，可能的機制為瘦素與其受體結合，使腎小球內皮功能紊亂，增加腎小球內皮細胞轉化生長因子-β1的表達，刺激系膜細胞Ⅰ型膠原纖維和腎小球內皮細胞Ⅳ型膠原纖維的合成，使內皮細胞受損；同時瘦素可激活腎小球內腎素-血管緊張素系統(tǒng)，促使腎小球肥大，腎小球濾過率下降，加速尿白蛋白排泄，共同參與了DN的發(fā)生、發(fā)展[11-12]。

ANGPTL6主要在調節(jié)糖脂代謝、胰島素抵抗、誘導內皮細胞損傷等方面發(fā)揮作用[5，13]。體外實驗表明，ANGPTL6通過激活細胞外信號調節(jié)激酶1/2-內皮型一氧化氮合酶信號通路，增加一氧化氮的產生，誘導小鼠腎小球內皮細胞損傷，內皮細胞損傷后通過分泌炎性介質和單核細胞趨化蛋白誘發(fā)炎性反應，參與DN的發(fā)生、發(fā)展[5]。ANGPTL2、ANGPTL4、ANGPTL6均屬血管生成素樣蛋白家族，在糖脂代謝方面起協(xié)同作用。最新研究表明，ANGPTL2、ANGPTL4通過不同途徑參與DN的發(fā)展。有證據支持轉錄因子核因子-κB在系膜細胞中的基本作用參與了DN進展[14-15]。ANGPTL4基因敲除小鼠通過抑制高糖誘導的小鼠腎小球系膜細胞中核因子-κB的產生，降低了腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1、白細胞介素-6的產生，延緩DN的進程[16]。據報道ANGPTL-4在DN大鼠腎組織中表達上調，其水平與尿白蛋白、肌酐呈正相關[17]。近年來研究發(fā)現，Toll樣受體4(TLR4)通過炎性反應、纖維化途徑與DN的發(fā)展密切相關[18]。Yang等[19]研究表明，DN大鼠中ANGPTL2和TLR4的表達上調，而ANGPTL2基因敲除大鼠TLR4受到抑制，大鼠腎損傷、炎性反應、腎纖維化和系膜外基質積累得到緩解。Morinaga等[20]也證明了小鼠體內缺乏ANGPTL2可以通過抑制轉化生長因子-β1信號通路來減輕腎間質組織損傷。本研究表明，DN組ANGPTL6水平較對照組升高，多元線性回歸分析顯示ANGPTL6是DN的危險因素。鑒于ANGPTL6與DN的研究較少，ANGPTL6可能通過上述促炎途徑、內皮細胞損傷、纖維化等機制促進DN的發(fā)生，但尚需大量研究證實。

研究發(fā)現，ANGPTL6基因敲除小鼠在正常飲食下也會出現明顯的胰島素抵抗，表現為血清膽固醇和游離脂肪酸水平顯著升高，骨骼肌和肝臟出現脂質積累[4]。研究表明，脂蛋白在腎間質中積累可通過多元醇途徑促進巨噬細胞聚集及促炎細胞因子的表達，增加血液黏度，引起腎血管缺氧，加速DN的發(fā)展[21]。本研究發(fā)現，ANGPTL6與HOMA-IR呈正相關，多元線性回歸分析顯示HOMA-IR為UAER的影響因素，推測ANGPTL6通過影響胰島素敏感性，促進DN的進展。另外，ANGPTL6與LDL-C、HDL-C、甘油三酯、總膽固醇無關，可能與樣本量小、口服降脂藥物等因素有關，尚需大樣本研究明確ANGPTL是否通過調節(jié)血脂影響DN的發(fā)展。

本實驗發(fā)現ANGPTL6與瘦素水平呈正相關。研究顯示高劑量瘦素處理小鼠原代肝細胞，導致ANGPTL6基因、蛋白質水平上調[8]。因此，ANGPTL6的表達可能直接依賴于肝臟瘦素信號轉導，但具體機制仍不清楚。ANGPTL6、瘦素可能均與炎性反應、纖維化有關，通過誘導內皮細胞損傷、系膜細胞基質沉積等，在DN的發(fā)展中起協(xié)同作用。綜上所述，DN患者血清ANGPTL6、瘦素水平升高，且二者為DN的危險因素。同時，瘦素可能影響DN患者的ANGPTL6水平，ANGPTL6、瘦素可能成為DN診斷和治療新的靶點，但相關機制仍需大量研究證實。