紫蘇籽蛋白對免疫力低下小鼠免疫調(diào)節(jié)功能的研究

朱 艷,姜 盛,李明亮,董 哲,王雨晴,郭 穎,*,谷瑞增,*

(1.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司,北京 100015; 2.華狐生物科技(中國)有限公司,遼寧沈陽 110000)

紫蘇是我國種植歷史悠久的一種藥食同源植物,具有潤肺止咳、下氣消痰、寬腸、止痛、安胎的功效[1]。紫蘇籽出油率40%～50%,且α-亞麻酸的含量高達(dá)60～70%左右,居所有植物之首[2]。因此,對紫蘇籽的研究主要集中在對紫蘇油的開發(fā)和利用方面。紫蘇油提取后的副產(chǎn)物紫蘇籽粕中蛋白質(zhì)含量高達(dá)28%～33%,富含人體必需的8種氨基酸以及兒童必需的10種氨基酸,是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白[3-4]。目前對紫蘇籽粕的研究主要集中在紫蘇分離蛋白的提取、蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的檢測以及酶解紫蘇蛋白制備活性肽等方面[5-8]。但是對紫蘇蛋白的生物功能方面的研究并不多見,深入探索紫蘇蛋白的生物功能,對紫蘇蛋白商業(yè)價值的提高具有重要意義。

現(xiàn)代研究表明,多種疾病的發(fā)生都與免疫系統(tǒng)紊亂密切相關(guān),比如衰老、癌癥、抑郁癥等[9-11],因此增強(qiáng)機(jī)體免疫力對預(yù)防疾病的發(fā)生具有重要作用。然而目前存在的免疫調(diào)節(jié)化學(xué)藥物具有用藥時間長、藥物殘留、環(huán)境污染等缺點(diǎn)[12],而植物蛋白是一類潛在的天然免疫調(diào)節(jié)劑,對機(jī)體毒害小[13],是近年來國內(nèi)外學(xué)者研究的重點(diǎn)。研究表明,紫蘇籽蛋白具有消炎止痛的功效,經(jīng)常食用含紫蘇籽蛋白的產(chǎn)品,能夠提高機(jī)體抗氧化能力,增強(qiáng)體質(zhì)并延緩衰老[14],因此,紫蘇籽蛋白具有很好的調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力的潛力。因此,本實(shí)驗以環(huán)磷酰胺(CTX)建立免疫低下小鼠模型,探討紫蘇籽蛋白其免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)作用,以期對未來相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)以及其它生物活性的研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

健康Balb/c雌性小鼠(動物許可證:SCXK(京)2016-0006) 6～8周齡,16～18 g,購自北京維通利華實(shí)驗動物技術(shù)有限公司,飼料和墊料也由該公司提供,小鼠飼養(yǎng)于SPF級動物房內(nèi),實(shí)驗期間維持環(huán)境溫度為(22～24) ℃,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗;紫蘇籽蛋白 實(shí)驗室自制;左旋咪唑 北京索萊寶生物技術(shù)有限公司;小鼠淋巴瘤細(xì)胞YAC-1 上海冠導(dǎo)生物工程有限公司;RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、磷酸鹽緩沖液(PBS) Hyclon公司;青霉素/鏈霉素、胰酶、紅細(xì)胞裂解液、CCK-8 碧云天生物技術(shù)研究所;補(bǔ)體、15%綿陽紅細(xì)胞(SRBC)、0.33%中性紅染色液、0.4%臺盼藍(lán)染色液 北京索萊寶生物工程有限公司;MTT、刀豆蛋白Con A、脂多糖LPS Sigma Aldrich公司;TNF-α、IL-2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒 北京百智生物科技有限公司。

BD C6流式細(xì)胞儀、240i直熱式二氧化碳培養(yǎng)箱 美國Thermofisher公司;CKX-4倒置相差顯微鏡 日本奧里巴斯有限公司;Spectra MR多功能酶標(biāo)儀 美國Dynex公司;721型紫外分光光度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 紫蘇籽蛋白的制備 紫蘇籽粕→破碎→一次堿溶(50 ℃、pH=10)→離心→二次堿溶(50 ℃、pH=9)→離心→酸沉(用HCl調(diào)pH至4.4)→離心→解碎、調(diào)漿中和(pH調(diào)至7.2)→過濾→均質(zhì)→滅菌→噴霧干燥→紫蘇籽蛋白

1.2.2 實(shí)驗動物分組和給藥 健康Balb/c雌性小鼠54只,隨機(jī)分為空白組、模型組、陽性對照組(左旋咪唑30 mg/kg)、紫蘇籽蛋白低、中、高劑量組,成人(按照60 kg體質(zhì)量計算)每日推薦攝入量為3 g,試驗采取人體推薦攝入量的2倍、1倍、0.5倍分別作為高(1200 mg/kg)、中(600 mg/kg)、低(300 mg/kg)劑量對小鼠進(jìn)行灌胃。每組6只,每天一次灌胃給藥,空白組和模型組給予等體積的生理鹽水,持續(xù)28 d。除空白組外,每組每天按照40 mg/kg腹腔注射CTX,連續(xù)3 d,后每隔一周注射一次,注射劑量為80 mg/kg,空白組腹腔注射等體積生理鹽水,建立免疫力低下小鼠模型[15]。末次給藥后,小鼠禁食不禁水12 h,處死小鼠,進(jìn)行各項免疫指標(biāo)的檢測。

1.2.3 小鼠體重和免疫器官重量的測定 給藥期間每隔3 d稱量一次體重,28 d后,小鼠斷食不斷水12 h,稱重后將小鼠斷頸處死,解剖取其胸腺和脾,稱重,計算胸腺系數(shù)和脾臟系數(shù)。

1.2.4 小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力的檢測 參考張瑞雪等[16]的實(shí)驗方法制備小鼠脾細(xì)胞懸液:小鼠斷頸處死后浸泡于75%酒精中5 min,隨后在無菌條件下分離脾,用剪刀將脾剪碎并研磨,研磨過程中不斷用滅菌的PBS沖洗,過200目尼龍篩網(wǎng),收集濾液,1200 r/min離心5 min,棄上清,加入2 mL紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞,室溫裂解2～3 min,離心棄上清,用RPMI-1640不完全培養(yǎng)基清洗1～2次,將其重懸于含10% FBS、1%青霉素/鏈霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中,得到脾細(xì)胞懸液,臺盼藍(lán)染色確定細(xì)胞存活率大于95%方可用于實(shí)驗。用RPMI-1640完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為5×106個/mL接種于96孔板,每孔90 μL,再向每孔添加10 μL Con A/LPS,使其終濃度為15 μg/mL,每組6個復(fù)孔,于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)培養(yǎng)72 h,向每孔添加10 μL CCK-8,繼續(xù)孵育2 h,用酶標(biāo)儀于490 nm處測OD值,空白組為灌胃生理鹽水小鼠淋巴細(xì)胞,小鼠淋巴細(xì)胞的增殖能力用刺激指數(shù)(SI)表示:

1.2.5 小鼠血清溶血素的測定 小鼠持續(xù)灌胃24 d后,腹腔注射0.2 mL體積分?jǐn)?shù)為2%的SRBC致敏,4 d后摘眼球取血,4 ℃過夜放置,分離血清。實(shí)驗時,用生理鹽水將血清稀釋200倍后取血清樣品1 mL、10% SRBC 0.5 mL、10%補(bǔ)體1 mL于離心管中,用生理鹽水代替血清作為對照,37 ℃水浴30 min,冰浴終止反應(yīng),3500 r/min離心10 min取上清,用紫外分光光度計測定540 nm處的吸光度值,以生理鹽水作為空白調(diào)零[17]。

1.2.6 小鼠NK細(xì)胞殺傷力的測定

1.2.6.1 靶細(xì)胞的準(zhǔn)備 選取小鼠淋巴瘤細(xì)胞(YAC-1細(xì)胞)作為靶細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)在含10% FBS、1% 青霉素/鏈霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中,每2 d換一次液,待細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶的80%左右,按照1∶3進(jìn)行傳代培養(yǎng)。實(shí)驗時,對細(xì)胞進(jìn)行臺盼藍(lán)染色,確定細(xì)胞活性大于95%即為靶細(xì)胞。實(shí)驗時,用RPMI-1640完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個/mL。

1.2.6.2 NK細(xì)胞殺傷力的測定 用RPMI-1640完全培養(yǎng)基調(diào)整脾細(xì)胞懸液密度為5×106個/mL,作為效應(yīng)細(xì)胞。實(shí)驗組向U型96孔板中加入效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞各100 μL,保證效靶比為50∶1,設(shè)置靶細(xì)胞YAC-1對照孔,添加100 μL YAC-1細(xì)胞懸液和100 μL RPMI-1640完全培養(yǎng)基,另設(shè)效應(yīng)細(xì)胞對照孔,添加100 μL 效應(yīng)細(xì)胞懸液和100 μL RPMI-1640完全培養(yǎng)基。37 ℃孵育4 h后向每孔添加10 μL CCK-8,37 ℃繼續(xù)孵育2 h,用酶標(biāo)儀于490 nm處測OD值[18],按照下面方法計算NK細(xì)胞殺傷率:

1.2.7 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力的測定

表1 紫蘇籽蛋白對小鼠體重的影響Table 1 Effect of Perilla frutescens seed protein on mice

1.2.7.1 巨噬細(xì)胞的制備 小鼠持續(xù)灌胃25 d后,給小鼠腹腔注射1 mL 4%淀粉肉湯溶液,3 d后斷頸處死小鼠[19],并在75%酒精中浸泡5 min,于無菌工作臺上剝離腹部皮膚,注意不要剪破腹腔膜,用一次性注射器向其腹腔內(nèi)注射3 mL無菌PBS,輕輕按摩腹部2～3 min,收集腹腔液,1200 r/min離心5 min,棄上清,用不完全RPMI-1640培養(yǎng)基清洗2次,收集沉淀,并重懸于RPMI-1640完全培養(yǎng)基中,臺盼藍(lán)染色確定細(xì)胞活性大于95%,調(diào)整細(xì)胞密度為5×106個/mL,取96孔板,每孔加入100 μL細(xì)胞懸液,37 ℃培養(yǎng)2.5 h,吸棄培養(yǎng)基,并洗去未貼壁細(xì)胞,再向每孔加入100 μL完全培養(yǎng)基,即得到單層巨噬細(xì)胞。

1.2.7.2 巨噬細(xì)胞吞噬能力測定 得到的單層巨噬細(xì)胞在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h,吸棄培養(yǎng)液,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/mL,繼續(xù)培養(yǎng)2.5 h使其貼壁,再每孔加入100 μL 0.1%中性紅溶液,繼續(xù)培養(yǎng)1 h,用PBS洗去未被吞噬的中性紅,每孔加入100 μL細(xì)胞裂解液(含體積分?jǐn)?shù)1%的乙酸和50%的乙醇),室溫放置2～3 h,待細(xì)胞溶解后,用酶標(biāo)儀測定559 nm處吸光度值,空白組為灌胃生理鹽水小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,并計算吞噬指數(shù)(PI):

1.2.8 小鼠血清IgG、IL-2含量的測定 小鼠禁食12 h后,用乙醚麻醉,摘眼球采血,分離血清,用酶聯(lián)免疫檢測試劑盒測定血清中IgG和IL-2含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 紫蘇籽蛋白對小鼠體重和免疫器官重量的影響

胸腺和脾臟是機(jī)體兩大重要免疫器官,胸腺是T淋巴細(xì)胞分化、發(fā)育和成熟的場所,脾臟是T、B淋巴細(xì)胞儲存和發(fā)揮作用的場所[20],因此它們的增重往往代表著淋巴細(xì)胞的增殖,從而直接體現(xiàn)了免疫應(yīng)答的強(qiáng)弱[21]。表1為灌胃期間小鼠體重、胸腺系數(shù)和脾臟系數(shù)的變化,由數(shù)據(jù)可知,28 d后,模型組小鼠體重與空白組相比增加不明顯,不同劑量的紫蘇蛋白均能增加小鼠體重。與空白組相比,模型組小鼠脾臟系數(shù)和胸腺系數(shù)極顯著降低(P<0.01),與模型組相比，中劑量的紫蘇籽蛋白顯著增加免疫低下小鼠的脾臟系數(shù)(P<0.05),并極顯著的增加了胸腺指數(shù)(P<0.01),可見紫蘇籽蛋白很好的延緩CTX引起的免疫器官縮減。

2.2 紫蘇籽蛋白對T/B淋巴細(xì)胞增殖能力的影響

淋巴細(xì)胞是免疫系統(tǒng)中主要的免疫細(xì)胞,其中T/B淋巴細(xì)胞承擔(dān)著機(jī)體內(nèi)的體液免疫和細(xì)胞免疫,它們可分別由刀豆蛋白(Con A)和脂多糖(LPS)誘導(dǎo)活化,其增殖活化決定了淋巴細(xì)胞的數(shù)量,影響著免疫水平的強(qiáng)弱,為常見的免疫檢測指標(biāo)[22-23]。

如圖1所示為紫蘇籽蛋白對免疫低下小鼠T/B淋巴細(xì)胞增殖的影響。與空白組相比,CXT導(dǎo)致小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖極顯著降低(P<0.01),模型建立成功。與模型組相比,低劑量的紫蘇籽蛋白顯著促進(jìn)了B淋巴細(xì)胞的增殖(P<0.05),隨著濃度的增加,紫蘇籽蛋白對T/B淋巴細(xì)胞的增殖呈現(xiàn)先增加后降低趨勢,其中,中劑量的紫蘇籽蛋白對免疫力低下小鼠T/B淋巴細(xì)胞的增殖效果較模型組均具有極為顯著的差異(P<0.01),所以適量攝入紫蘇籽蛋白對細(xì)胞免疫和體液免疫均能起到增強(qiáng)效果,而過量蛋白的攝入可能增加了小鼠的代謝負(fù)荷,反而影響免疫功能的發(fā)揮[24]。

圖1 紫蘇籽蛋白對小鼠T/B淋巴細(xì)胞增殖影響Fig.1 Effect of Perilla frutescens seed proteinon T/B lymphocyte proliferation in mice

2.3 紫蘇籽蛋白對血清溶血素含量的影響

血清溶血素是B淋巴細(xì)胞接觸到特異性抗原,即綿陽紅細(xì)胞SRBC后產(chǎn)生的特異性抗體,其含量多少體現(xiàn)了機(jī)體釋放特異性抗體的能力[25]。小鼠經(jīng)SRBC免疫后產(chǎn)生的特異性抗體主要存在血清中,它與SRBC和補(bǔ)體在一定條件下會引起SRBC發(fā)生溶血,溶血程度與分泌的抗體量相關(guān)[26],因此血清溶血素的含量是反應(yīng)機(jī)體體液免疫強(qiáng)弱的一個重要指標(biāo)。

如圖2所示,紫蘇籽蛋白能很好地提高免疫力低下小鼠血清溶血素水平,中劑量的紫蘇籽蛋白極其顯著提高了免疫力低下小鼠血清半數(shù)溶血值(P<0.01),且相比于陽性藥物左旋咪唑的效果無明顯差異(P>0.05)。因此,中劑量紫蘇籽蛋白具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用,且效果與左旋咪唑相當(dāng)。

圖2 紫蘇籽蛋白對小鼠血清血溶素含量的影響Fig.2 Effect of Perilla frutescens seed proteinon serum lysin content in mice

2.4 紫蘇籽蛋白對小鼠NK細(xì)胞殺傷力的影響

NK細(xì)胞(自然殺傷力細(xì)胞)是淋巴細(xì)胞的一種,是天然存在于生物體內(nèi)非特異性的免疫細(xì)胞,在無抗原刺激和抗體存在的情況下能夠直接溶解和清除些腫瘤細(xì)胞和病毒感染的細(xì)胞[27],目前NK細(xì)胞被認(rèn)為是免疫監(jiān)視細(xì)胞中最理想的效應(yīng)細(xì)胞。

圖3為紫蘇籽蛋白和對免疫低下小鼠NK細(xì)胞殺傷力的影響,可以看出,正常小鼠腹腔注射CTX后,NK細(xì)胞殺傷力降低,免疫力極顯著降低(P<0.01)。紫蘇籽蛋白能較好的提高免疫低下小鼠NK細(xì)胞殺傷力,且在低劑量組下就能顯著地提高NK細(xì)胞殺傷力(P<0.05),中劑量組下極顯著地提高了NK細(xì)胞殺傷力(P<0.01),繼續(xù)增加蛋白濃度,效果變?nèi)?但仍顯著提高了免疫低下小鼠NK細(xì)胞的殺傷力能力。相比而言,左旋咪唑?qū)K細(xì)胞殺傷力的影響較弱,中劑量的紫蘇籽蛋白提高NK細(xì)胞殺傷力的功效較之增加了9.4%。

圖3 紫蘇籽蛋白對小鼠NK細(xì)胞殺傷力的影響Fig.3 Effect of Perilla frutescens seed proteinon NK cell lethality in mice

2.5 紫蘇籽蛋白對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響

非特異性免疫是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分,巨噬細(xì)胞能夠識別外來異物并能通過吞噬作用起到清除效果[28],其吞噬能力的強(qiáng)弱不僅代表著吞噬細(xì)胞的活性,而且在機(jī)體低于外來病原體入侵和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)等生命活動中占據(jù)重要作用[29]。吞噬中性紅的定量測定常用來評價吞噬細(xì)胞的吞噬能力。

如圖4所示,正常小鼠注射CTX后吞噬細(xì)胞吞噬指數(shù)極顯著降低(P<0.01),對免疫低下小鼠灌胃紫蘇籽蛋白后,小鼠內(nèi)吞噬細(xì)胞吞噬異物能力提高,低劑量的紫蘇籽蛋白較模型組顯著提高了免疫低下小鼠腹腔吞噬細(xì)胞吞噬指數(shù)(P<0.05),隨灌胃濃度增加,效果減弱。但是低劑量和中劑量的紫蘇蛋白在增強(qiáng)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力方面并無顯著差異。因此,紫蘇籽蛋白能夠增強(qiáng)免疫低下小鼠非特異性免疫,但劑量不易過高。

圖4 紫蘇籽蛋白對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響Fig.4 Effect of Perilla frutescens seed protein onphagocytosis of peritoneal macrophages in mice

2.6 紫蘇籽蛋白對小鼠血清IL-2、IgG含量的影響

IL-2即白細(xì)胞介素-2是由T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的一種糖蛋白,它的生物學(xué)功能主要是促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖和分化,介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答[30],它也能夠促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的增殖，但不是B淋巴細(xì)胞增殖所必須的,增強(qiáng)NK細(xì)胞殺傷力,激活體內(nèi)巨噬細(xì)胞,是評價細(xì)胞免疫功能的重要指標(biāo)[31]。IgG是體液免疫應(yīng)答中產(chǎn)生的主要的抗體,由B淋巴細(xì)胞分泌產(chǎn)生,約占全部抗體的80%,是反映體液免疫的常見指標(biāo)[32]。

結(jié)果如表2所示,經(jīng)CTX誘導(dǎo)后,正常小鼠體內(nèi)IL-2和IgG含量均極顯著降低(P<0.01),說明CTX誘導(dǎo)免疫力低下小鼠模型建立成功。三個劑量下紫蘇籽蛋白對IL-2的分泌均起到了良好的促進(jìn)效果,與模型組相比具有極為顯著差異(P<0.01),中劑量的紫蘇蛋白效果最強(qiáng)。高劑量的紫蘇蛋白對促進(jìn)IL-2分泌的效果與陽性藥物左旋咪唑相當(dāng),但對B淋巴細(xì)胞的增殖與模型組相比并沒有表現(xiàn)出顯著的差異(P>0.05),這可能與IL-2主要是介導(dǎo)細(xì)胞免疫的生物學(xué)功能相關(guān)[30],免疫力低下小鼠過量攝入蛋白質(zhì),可能會增加小鼠代謝負(fù)荷,不利于免疫系統(tǒng)的恢復(fù)[24]。三個劑量組的紫蘇籽蛋白雖增加了免疫低下小鼠血清中IgG含量,但與模型組相比無差異,可見,紫蘇籽蛋白對小鼠細(xì)胞免疫具有更好的調(diào)節(jié)作用。

表2 紫蘇籽蛋白對小鼠血清中IL-2和IgG含量的影響Table 2 Effect of Perilla frutescens seed proteinon IL-2 and IgG levels in serum of mice

3 結(jié)論

本實(shí)驗探究了紫蘇籽蛋白對CTX誘導(dǎo)的免疫力低下小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用,研究表明,連續(xù)28 d的灌胃紫蘇籽蛋白后,小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均增加,有效遏制了CTX引起的免疫器官的衰減。在細(xì)胞免疫中,隨著紫蘇籽蛋白濃度的增加,T/B淋巴細(xì)胞增殖率均呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢,中劑量的紫蘇籽蛋白對促進(jìn)T/B淋巴細(xì)胞的增殖效果最好,同時顯著促進(jìn)T淋巴細(xì)胞分泌IL-2,又反過來刺激細(xì)胞免疫和體液免疫的發(fā)生。中劑量的紫蘇籽蛋白對體液免疫也具有很好的調(diào)節(jié)效果,大量增加了免疫低下小鼠血清溶血素含量,但對促進(jìn)B淋巴細(xì)胞分泌IgG效果不明顯,因此對體液免疫的調(diào)節(jié)功效也具有一定的調(diào)節(jié)作用。在非特異性免疫中,紫蘇籽蛋白對NK細(xì)胞殺傷力以及吞噬細(xì)胞吞噬能力均有一定程度的影響,相比于高劑量的紫蘇籽蛋白,低劑量和中劑量的效果更強(qiáng)。綜上所述,適量攝入紫蘇籽蛋白能夠很好的起到增強(qiáng)免疫力的效果,但是過量攝入則會帶來相反的結(jié)果。而關(guān)于紫蘇籽蛋白免疫調(diào)節(jié)的作用機(jī)制還需進(jìn)一步實(shí)驗探究,為未來相關(guān)產(chǎn)品和保健品的開發(fā)提供新的思路。