管花肉蓯蓉苯乙醇苷的巨噬細(xì)胞激活作用及其與當(dāng)歸、黃芪在調(diào)節(jié)免疫方面的協(xié)同作用

駱紫燕,卿德剛,孫 宇,徐曉琴,張 娟,*,王子榮

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830052; 2.新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所,新疆烏魯木齊 830002)

列當(dāng)科植物管花肉蓯蓉(Cistanchetubulosa(Schrenk)Wight)是《中國(guó)藥典》收載的肉蓯蓉品種之一[1],主產(chǎn)于新疆南疆地區(qū),是著名的補(bǔ)益中藥,“主五勞七傷,補(bǔ)中,除莖中寒熱痛,養(yǎng)五臟,強(qiáng)陰,益精氣,多子,婦人癥瘕,久服輕身”?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,肉蓯蓉具有抗疲勞[2-3]、抗衰老[4]、保護(hù)神經(jīng)[5]、增強(qiáng)免疫力[6]、潤(rùn)腸通便[7]等多種生物活性,在保健食品開(kāi)發(fā)方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

苯乙醇苷和多糖被認(rèn)為是肉蓯蓉中的主要活性成分,其中,多糖的調(diào)節(jié)免疫活性已得到較多研究證實(shí),它可通過(guò)免疫球蛋白受體Fcγ依賴的吞噬作用、TNF-αNF-κB通路、糖酵解/糖原異生以及三羧酸循環(huán)和呼吸電子運(yùn)輸?shù)葘?shí)現(xiàn)對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7的激活作用[8-10],并可能通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)鈣釋放促進(jìn)小鼠胸腺淋巴細(xì)胞的增殖,通過(guò)促進(jìn)IL-2分泌提高正常小鼠的脾指數(shù)[10-11]。松果菊苷、毛蕊花糖苷等為代表的苯乙醇苷是肉蓯蓉發(fā)揮藥理活性的核心物質(zhì)基礎(chǔ),但在調(diào)節(jié)免疫方面的研究則較少。文獻(xiàn)報(bào)道,肉蓯蓉苯乙醇苷能明顯增加小鼠血中Mφ的吞噬能力及免疫器官的重量[12],松果菊苷為主要成分的肉蓯蓉提取物可通過(guò)免疫調(diào)節(jié)等作用拮抗結(jié)腸炎,毛蕊花糖苷對(duì)免疫器官、免疫細(xì)胞和免疫因子均有明顯的調(diào)節(jié)作用,對(duì)D-氨基半乳糖和脂多糖致肝功能衰竭小鼠的細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)也都有明顯的抑制作用[6,13-14],說(shuō)明肉蓯蓉中的苯乙醇苷類(lèi)同樣是很有潛力的免疫調(diào)節(jié)劑。

本文首先研究了管花肉蓯蓉苯乙醇苷對(duì)巨噬細(xì)胞的激活作用,其次,基于傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論將其與當(dāng)歸、黃芪配伍,通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明3者對(duì)巨噬細(xì)胞激活的協(xié)同作用,并以此為依據(jù)制備復(fù)方片劑,通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)考察復(fù)方片劑對(duì)正常小鼠的細(xì)胞免疫、體液免疫、單核-巨噬細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用,以期為管花肉蓯蓉苯乙醇苷在調(diào)節(jié)免疫產(chǎn)品方面的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Hank’s液、RPMI1640培養(yǎng)液、DMEM培養(yǎng)基、MTT、PBS 購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司;DNFB 購(gòu)自吳江市青云精細(xì)化工廠;SRBC、豚鼠血清 購(gòu)自廣州蕊特生物科技有限公司;ConA、大腸桿菌脂多糖(LPS) 購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;NO試劑盒、iNOS試劑盒 購(gòu)自南京建成生物工程研究所;ELISA試劑盒(Mouse TNF-α、Mouse IL-6) 購(gòu)自武漢艾美捷科技有限公司;巨噬細(xì)胞RAW264.7 購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞中心;SPF級(jí)CI/F1代健康雌性小鼠(生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(滬)2013-0016) 購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司;管花肉蓯蓉 購(gòu)自和田秋永霞管花肉蓯蓉有限責(zé)任公司;當(dāng)歸、黃芪 購(gòu)自新疆九州通醫(yī)藥有限公司。

JA2003電子天平 上海上天精密儀器有限公司;JJ-100電子天平 美國(guó)雙杰公司;SG-603生物安全柜 美國(guó)Baker公司;Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀 Thermo Fisher Scientific公司;QP80二氧化碳培養(yǎng)箱 山東博科科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 各提取物及復(fù)方片劑的制備 管花肉蓯蓉苯乙醇苷提取物:管花肉蓯蓉以75%乙醇溶液提取2次,濃縮干燥,即得(松果菊苷+毛蕊花糖苷:21.3%,總苷:41%);當(dāng)歸提取物:當(dāng)歸以水提取2次,濃縮后80%醇沉,濃縮干燥,即得(阿魏酸:0.3%);黃芪提取物:黃芪以水提取2次,濃縮后70%醇沉,干燥沉淀,即得(多糖:32.3%)。

復(fù)方片劑:管花肉蓯蓉苯乙醇苷提取物、當(dāng)歸提取物、黃芪提取物按15∶18∶12的比例,輔以10%微晶纖維素、9%羧甲基淀粉鈉、1%硬脂酸鎂混合均勻,濕法制粒、壓片(0.6 g/片),即得。

1.2.2 苯乙醇苷提取物的巨噬細(xì)胞激活作用

1.2.2.1 對(duì)RAW264.7細(xì)胞吞噬活性的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAW264.7細(xì)胞,胰酶消化后調(diào)整細(xì)胞數(shù)至5×106個(gè)/mL,接種于48孔板(100 μL/孔),37 ℃,5% CO2條件下培養(yǎng),待細(xì)胞貼壁后,PBS清洗。分別加入DMEM 培養(yǎng)基(空白對(duì)照組)、LPS(20 mg/L)和樣品(苯乙醇苷提取物25、50、75、100、125 g/L)培養(yǎng)24 h,棄上清,加0.075%中性紅溶液(100 μL/孔),繼續(xù)培養(yǎng)1 h,棄上清,PBS清洗2～3遍,加細(xì)胞裂解液(100 μL/孔),4 ℃下放置2 h,酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度(540 nm),計(jì)算相對(duì)細(xì)胞吞噬活性。相對(duì)細(xì)胞吞噬活性(%)=處理組吸光度/空白對(duì)照組吸光度×100。

1.2.2.2 對(duì)RAW264.7細(xì)胞NO、iNOS、TNF-α、IL-6的影響 按上述方法培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞,分別加入DMEM 培養(yǎng)基(空白對(duì)照組)、LPS(20 mg/L)和樣品(苯乙醇苷提取物25、50、75、100、125 g/L)培養(yǎng)24 h,收集上清液,根據(jù)試劑盒說(shuō)明測(cè)定NO、iNOS,Elisa法測(cè)定TNF-α、IL-6含量。

1.2.3 苯乙醇苷提取物及其與當(dāng)歸和黃芪提取物的組合物對(duì)巨噬細(xì)胞激活的作用比較

1.2.3.1 對(duì)RAW264.7細(xì)胞吞噬活性的影響 以苯乙醇苷提取物和當(dāng)歸提取物按15∶18的比例混合得到組合物B,以苯乙醇苷提取物、當(dāng)歸提取物和黃芪提取物以15∶18∶12的比例混合得到組合物C(組合物配比依據(jù)《中國(guó)藥典》中各藥材的推薦服用量[1]和各提取物的得率折算)。參照“1.2.2.1”方法,對(duì)比苯乙醇苷提取物(A)、組合物B和C(50、75 g/L)對(duì)RAW264.7細(xì)胞吞噬活性的影響。

1.2.3.2 對(duì)RAW264.7細(xì)胞NO釋放量的影響 參照“1.2.2.2”方法,對(duì)比苯乙醇苷提取物(A)、組合物B和C(50、75 g/L)對(duì)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO的影響。

1.2.4 復(fù)方片劑對(duì)正常小鼠的免疫力的影響 參考文獻(xiàn)[15]的操作研究復(fù)方片劑對(duì)正常小鼠淋巴細(xì)胞等的影響。

1.2.4.1 分組及處理 SPF級(jí)CI/F1代健康雌性小鼠200只,體重19.0～21.7 g,隨機(jī)分五大組,每大組40只,Ⅰ組進(jìn)行ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn),Ⅱ組進(jìn)行耳腫脹試驗(yàn),Ⅲ組進(jìn)行抗體生成細(xì)胞檢測(cè),Ⅳ組進(jìn)行小鼠碳廓清試驗(yàn),Ⅴ組進(jìn)行小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)。每大組分別設(shè)復(fù)方片劑低、中、高劑量組0.2、0.4、1.2 g/kg·bw/d(分別相當(dāng)于受試樣品人體推薦攝入量的5倍、10倍、30倍;折算人體推薦攝入量,各藥材服用量均小于《中國(guó)藥典》規(guī)定的用藥量)和空白對(duì)照組,灌胃體積0.1 mL/10 g·bw,空白對(duì)照組給予等體積蒸餾水,1次/d,連續(xù)灌胃30 d。

1.2.4.2 ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn) 灌胃30 d后,處死小鼠,無(wú)菌取脾,制細(xì)胞懸液,用RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為3×106個(gè)/mL。將細(xì)胞懸液分兩孔加入24孔培養(yǎng)板,每孔1 mL,一孔加75 μL ConA液(100 μg/mL),另一孔作對(duì)照,置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束后,用酶標(biāo)儀按 MTT法在 570 nm測(cè)定OD 值。淋巴細(xì)胞增殖能力=加ConA孔的OD值-不加ConA孔的OD值

1.2.4.3 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng) 灌胃30 d后,每鼠腹部剃毛(3 cm×3 cm),以10 mg/mL DNFB溶液50 μL均勻涂抹致敏。5 d后以10 mg/mL DNFB溶液10 μL均勻涂抹于小鼠右耳(兩面)攻擊,攻擊24 h后處死小鼠,分別以打孔器取左右耳片(d=8 mm),稱(chēng)重。耳重差(mg)=右耳重(mg)-左耳重(mg)。

1.2.4.4 抗體生成細(xì)胞檢測(cè) 灌胃30 d后,每鼠腹腔注射0.2 mL 2%(v/v)SRBC懸液免疫,4 d后處死小鼠,取脾,制細(xì)胞懸液,按Jerne改良玻片法檢測(cè)溶血空斑數(shù)。溶血空斑數(shù)=溶血空斑計(jì)數(shù)×320。

1.2.4.5 小鼠碳廓清試驗(yàn) 灌胃30 d后,每鼠尾靜脈注入4倍稀釋的印度墨汁(0.1 mL/10 g·bw),注入后2 min及10 min時(shí)分別從眼內(nèi)眥靜脈叢取血20 μL,加入2 mL 0.1% Na2CO3溶液中,用酶標(biāo)儀在600 nm處測(cè)OD值,并取胸腺、肝、脾稱(chēng)重,計(jì)算胸腺/體比、脾/體比和吞噬指數(shù)a。

K=(lgOD1-lgOD2)/(t2-t1),a=體重/(肝重+脾重)×K1/3。

1.2.4.6 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn) 試驗(yàn)前4 d給每鼠腹腔注射2%壓積羊血紅細(xì)胞0.2 mL。處死小鼠,腹腔注射加小牛血清的Hank’s液(4 mL/只),輕輕按揉腹部20次,然后將腹壁剪開(kāi)一個(gè)小口,吸取腹腔洗液2 mL于試管內(nèi)。吸取0.5 mL腹腔洗液加入盛有0.5 mL 1%雞血紅細(xì)胞懸液的試管內(nèi),混勻。取混合液加入玻片瓊脂圈內(nèi),37 ℃孵育15～20 min。孵育后將未貼壁細(xì)胞洗掉,固定,Giemsa染色,洗片,晾干,顯微鏡計(jì)數(shù),計(jì)算吞噬率和吞噬指數(shù)。吞噬百分率(%)=吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)的吞噬細(xì)胞數(shù)×100,吞噬指數(shù)=被吞噬的雞紅細(xì)胞總數(shù)/計(jì)數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 苯乙醇苷提取物的巨噬細(xì)胞激活作用

2.1.1 苯乙醇苷提取物對(duì)RAW264.7細(xì)胞吞噬活性的影響 本實(shí)驗(yàn)首先研究了25、50、75、100、125 g/L苯乙醇苷提取物對(duì)RAW264.7細(xì)胞吞噬活性的影響。結(jié)果表明,LPS組細(xì)胞吞噬活性相比空白對(duì)照組具有極顯著差異(P<0.01),75、100 g/L組樣品可極顯著提高細(xì)胞吞噬活性(P<0.01),125 g/L組可顯著增強(qiáng)細(xì)胞吞噬活性(P<0.05),提示苯乙醇苷提取物具有激活巨噬細(xì)胞的作用,見(jiàn)圖1。

圖1 苯乙醇苷提取物對(duì)細(xì)胞吞噬活性的影響Fig.1 Effect of the phenylethyl glycosidesextract on phagocytic activity of cells注:與空白對(duì)照組比較**表示差異極顯著(P<0.01),*表示差異顯著(P<0.05);圖2～圖7同。

2.1.2 苯乙醇苷提取物對(duì)RAW264.7細(xì)胞NO、iNOS、TNF-α和IL-6釋放的影響 為了進(jìn)一步明確苯乙醇苷提取物對(duì)巨噬細(xì)胞的激活作用,分別檢測(cè)了巨噬細(xì)胞經(jīng)不同濃度樣品刺激后,細(xì)胞上清液中NO、iNOS、TNF-α和IL-6的含量。結(jié)果表明,LPS組NO、iNOS、TNF-α和IL-6相比空白對(duì)照組均具有極顯著差異(P<0.01),75、100、125 g/L苯乙醇苷提取物組均能改善RAW264.7細(xì)胞NO生成量、iNOS活性和TNF-α分泌水平,50、75、100、125 g/L苯乙醇苷提取物組還能提高RAW264.7細(xì)胞IL-6分泌水平,其中,100、125 g/L組樣品的作用具有極顯著差異(P<0.01),這也提示苯乙醇苷提取物可能通過(guò)促進(jìn)巨噬細(xì)胞表達(dá)TNF-α、IL-6從而激活免疫吞噬功能,見(jiàn)圖2～圖5。

圖2 苯乙醇苷提取物對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生NO的影響Fig.2 Effect of the phenylethyl glycosidesextract on NO release from cells

圖3 苯乙醇苷提取物對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生iNOS的影響Fig.3 Effect of the phenylethyl glycosidesextract on iNOS release from cells

圖4 苯乙醇苷提取物對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的影響Fig.4 Effect of the phenylethyl glycosides extracton TNF-α release from cells

圖5 苯乙醇苷提取物對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生IL-6的影響Fig.5 Effect of the phenylethyl glycosides extracton IL-6 release from cells

2.2 苯乙醇苷提取物及其與當(dāng)歸和黃芪提取物的組合物對(duì)巨噬細(xì)胞激活作用的比較

通過(guò)對(duì)比苯乙醇苷提取物A、苯乙醇苷提取物:當(dāng)歸提取物(15∶18)的組合物B、苯乙醇苷提取物：當(dāng)歸提取物：當(dāng)歸提取物(15∶18∶22)的組合物C對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬活性和NO釋放的影響,考察3者是否具有協(xié)同增效的作用,為下一步復(fù)方片劑的制備提供依據(jù)。結(jié)果表明,LPS組細(xì)胞吞噬活性和NO釋放量相比空白對(duì)照組均具有極顯著差異(P<0.01),A、B僅有高劑量組能提高巨噬細(xì)胞吞噬活性和NO釋放量(P<0.05),而以3種提取物共同制備的組合物C低、高劑量組均能提高巨噬細(xì)胞吞噬活性和NO釋放量,并且,C高劑量組對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬活性和NO分泌的影響具有極顯著差異(P<0.01),即苯乙醇苷提取物、當(dāng)歸提取物、黃芪提取物在激活巨噬細(xì)胞方面具有協(xié)同作用,故以組合物C的配比為依據(jù)制備復(fù)方片劑繼續(xù)考察其對(duì)正常小鼠的免疫調(diào)節(jié)活性,見(jiàn)圖6～圖7。

圖6 各樣品對(duì)細(xì)胞吞噬活性的影響Fig.6 Effects of the sampleson phagocytic activity of cells

圖7 各樣品對(duì)細(xì)胞NO釋放量的影響Fig.7 Effects of the samples on NO release from cells

2.3 復(fù)方片劑對(duì)正常小鼠的免疫調(diào)節(jié)活性

為了進(jìn)一步證明苯乙醇苷提取物、當(dāng)歸提取物和黃芪提取物配伍在增強(qiáng)免疫力方面的實(shí)際效果,通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn),綜合考察以3者制備的復(fù)方片劑對(duì)正常小鼠細(xì)胞免疫、體液免疫、單核-巨噬細(xì)胞功能和NK細(xì)胞活性的影響。

2.3.1 ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn) 淋巴細(xì)胞的增殖和分化是機(jī)體免疫反應(yīng)中的重要階段,淋巴細(xì)胞受到抗原或者促有絲分裂原刺激時(shí)增殖能力的大小,可以反映機(jī)體的免疫功能狀態(tài)[16]。0.4、1.2 g/kg·bw/d組小鼠淋巴細(xì)胞中加 ConA 孔與不加ConA孔的OD值差值顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05),說(shuō)明樣品可以增強(qiáng)ConA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖能力,即其可以促進(jìn)機(jī)體的免疫反應(yīng),見(jiàn)表1。

表1 ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)結(jié)果(n=10)Table 1 Result of ConA induced mice spleenlymphocyte transformation test(n=10)

2.3.2 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng) 1.2 g/kg·bw/d組小鼠耳殼增重顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05),說(shuō)明抗原攻擊局部引起了炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的腫脹[17-18],并且樣品可以增強(qiáng)這一作用,即樣品能夠增強(qiáng)DNFB誘發(fā)的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng),綜合“2.3.1”結(jié)果,可以判定樣品能夠促進(jìn)小鼠的細(xì)胞免疫功能,見(jiàn)表2。

表2 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果(n=10)Table 2 Result of delayed-type hypersensitivity test(n=10)

2.3.3 抗體生成細(xì)胞檢測(cè) 抗原特異性抗體的產(chǎn)生可以裂解抗原致敏后的綿羊紅細(xì)胞,從而在抗體形成細(xì)胞周?chē)纬扇苎瞻摺?.4 g/kg·bw/d組小鼠溶血空斑數(shù)顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05),說(shuō)明樣品可以促進(jìn)抗體生成,即其對(duì)小鼠特異性體液免疫有積極影響,見(jiàn)表3。

表3 抗體生成細(xì)胞檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果(n=10)Table 3 Result of antibody-forming cell test(n=10)

2.3.4 小鼠碳廓清試驗(yàn) 單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)能夠快速吞噬廓清異體顆粒和某些可溶性異物,并可迅速清除自體產(chǎn)生的某些有害物質(zhì),是機(jī)體最重要的防御系統(tǒng)[19]。1.2 g/kg·bw/d組小鼠碳廓清吞噬指數(shù)a顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05),表明樣品可以提高小鼠碳廓清能力,增強(qiáng)單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)吞噬功能,并且,“2.2”結(jié)果也顯示混合物在體外可以激活巨噬細(xì)胞,提高其吞噬活性,說(shuō)明樣品可以增強(qiáng)機(jī)體的非特異性免疫功能[20],見(jiàn)表4。

表4 小鼠碳廓清試驗(yàn)結(jié)果(n=10)Table 4 Result of mice carbon clearance test(n=10)

2.3.5 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn) 雞紅細(xì)胞對(duì)于小鼠是一種較強(qiáng)的抗原,其與小鼠腹腔巨噬細(xì)胞共孵育一定時(shí)間后,會(huì)被吞噬,吞噬百分率和吞噬指數(shù)可以反映小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力[21]。1.2 g/kg·bw/d組吞噬百分率及吞噬指數(shù)均顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05),表明樣品可以提高巨噬細(xì)胞的吞噬能力,綜合“2.3.4”結(jié)果可以判定樣品可以通過(guò)影響正常小鼠單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的吞噬功能發(fā)揮增強(qiáng)免疫力的作用,見(jiàn)表5。

表5 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果(n=10)Table 5 Result of mice peritoneal macrophagesphagocytosis of chicken red blood cells test(n=10)

3 結(jié)論

巨噬細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)不僅起呈遞抗原的作用,還可通過(guò)非特異性吞噬病原微生物和腫瘤細(xì)胞等維持機(jī)體穩(wěn)態(tài),在宿主防御系統(tǒng)中占重要地位[22]。NO是殺傷病原微生物和腫瘤細(xì)胞的主要物質(zhì),激活的巨噬細(xì)胞可以合成大量NO,從而殺傷微生物、寄生蟲(chóng)和腫瘤細(xì)胞[22]。iNOS則是其合成的關(guān)鍵酶之一,當(dāng)巨噬細(xì)胞被激活時(shí)會(huì)大量表達(dá)iNOS,進(jìn)而誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生NO,可發(fā)揮防御作用[22]。TNF-α和IL-6則是巨噬細(xì)胞分泌的2種主要炎性因子,不僅參與機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng),而且對(duì)機(jī)體的免疫反應(yīng)有重要調(diào)節(jié)作用[23]。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇這些指標(biāo)研究管花肉蓯蓉苯乙醇苷的巨噬細(xì)胞激活作用,并考察其與當(dāng)歸和黃芪提取物的協(xié)同作用。結(jié)果表明,75、100、125 g/L的管花肉蓯蓉苯乙醇苷提取物可顯著提高細(xì)胞對(duì)中性紅的吞噬能力,說(shuō)明其可提高機(jī)體的非特異性免疫,并且可能是通過(guò)誘導(dǎo)iNOS表達(dá)提高刺激巨噬細(xì)胞合成NO,同時(shí)刺激巨噬細(xì)胞釋放TNF-α和IL-6,激活細(xì)胞免疫吞噬功能。此外,當(dāng)歸提取物、黃芪提取物可明顯提升苯乙醇苷提取物對(duì)巨噬細(xì)胞的激活作用,即三者在巨噬細(xì)胞激活方面具有協(xié)同增效作用。

肉蓯蓉補(bǔ)腎氣、益精血[24],當(dāng)歸補(bǔ)血活血[25],黃芪補(bǔ)諸虛不足、益元?dú)?、壯脾胃[26],三者合用,平補(bǔ)陰陽(yáng),調(diào)養(yǎng)五臟,溫而不燥,補(bǔ)而不膩,性味平和,無(wú)陰陽(yáng)偏盛之弊,全方共奏補(bǔ)腎填精養(yǎng)血活血之功效,因而能夠發(fā)揮增強(qiáng)機(jī)體免疫力的功效。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證明,以3者作為原料制備的復(fù)方片劑,可以提高正常小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力、促進(jìn)抗原攻擊下的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)、提高小鼠體內(nèi)碳顆粒被清除的速率、巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的能力和脾細(xì)胞抗體生成能力,但是,對(duì)溶血素水平、NK細(xì)胞活性沒(méi)有積極影響(數(shù)據(jù)未列出)。根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》之標(biāo)準(zhǔn)[15],受試樣品在細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能、單核-巨噬細(xì)胞功能、NK細(xì)胞活性4個(gè)方面任2個(gè)方面結(jié)果為陽(yáng)性,即具有增強(qiáng)免疫力功能。因此,可以判定本復(fù)方片劑具有增強(qiáng)免疫力功能,且主要是通過(guò)調(diào)節(jié)正常小鼠細(xì)胞免疫、單核-巨噬細(xì)胞功能發(fā)揮增強(qiáng)免疫力作用的。