大氣壓冷等離子體處理對果蔬表面E. coli O157∶H7生物膜的清除作用

林 琳,陳文慶,方厚智,高 杰,崔海英

(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江 212013)

大腸桿菌O157∶H7(E.coliO157∶H7)為一種腸道病原體,可引發(fā)多種嚴(yán)重疾病,相關(guān)研究表明,一些果蔬易被大腸桿菌O157∶H7污染,且能在各種食品加工材料表面以及果蔬表面形成生物膜,威脅食用者健康[1-3]。生物膜是細(xì)菌利用其自身分泌的多糖類基質(zhì),將細(xì)菌小菌落連接到惰性表面,同時將其它碎屑,包括營養(yǎng)物質(zhì)和細(xì)菌也截留在其中,最終形成一層堅固的薄膜,難以清除。傳統(tǒng)的化學(xué)殺菌雖能在一定程度上滅菌,但同時也破壞了果蔬內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì),且果蔬表面會有化學(xué)試劑殘留,不能達(dá)到保證果蔬感官品質(zhì)和營養(yǎng)品質(zhì)的同時有效殺滅細(xì)菌的目的[4]。

目前,等離子體處理作為一種物理殺菌保鮮技術(shù),已被歐美等發(fā)達(dá)國家所普遍接受[5-8]。其中,冷等離子體不僅能夠殺死果蔬表面的致病微生物[9-12],還可以降解農(nóng)藥殘留,且無次生污染物,十分符合果蔬采后貯藏保鮮的需要[13-14]。大氣壓冷等離子體(atmospheric cold plasma,ACP)是等離子體家族的新秀,是在一個大氣壓條件下通過給被介質(zhì)隔開的電極施加高能量產(chǎn)生[15-16]。由于ACP是在大氣壓條件下產(chǎn)生,不需昂貴的真空設(shè)備和復(fù)雜耗時的操作程序,與傳統(tǒng)的低氣壓等離子體技術(shù)相比可降低成本,提高殺菌效率,具有明顯的優(yōu)勢[17-19]。任翠榮等[20]研究了ACP處理對草莓保鮮效果的影響,結(jié)果表明在140 V下處理60 s時,草莓的保鮮效果最好;張志偉[21]研究了ACP對鮮切胡蘿卜表面金黃色葡萄球菌的殺菌效果及品質(zhì)影響,結(jié)果表明在170 V下,處理5 min時,殺菌率達(dá)到92.35%,同時保持了胡蘿卜的理化品質(zhì);Misra等[22]研究了ACP處理對草莓表面微生物的滅活作用,發(fā)現(xiàn)ACP處理5 min后,在未影響草莓感官品質(zhì)的同時,草莓表面菌落數(shù)減少了兩個數(shù)量級。但目前國內(nèi)外對ACP冷殺菌技術(shù)在果蔬表面生物膜的清除及其抗菌機(jī)制方面研究甚少。

本文探究了ACP清除E.coliO157∶H7生物膜的最佳處理功率和處理時間,觀察了E.coliO157∶H7生物膜在ACP處理前和處理后的形態(tài)變化,同時研究了ACP處理對E.coliO157∶H7生物膜的抗菌機(jī)制,最后以戶太葡萄、圣女果、維多利亞青提、生菜為研究對象,將ACP處理應(yīng)用到這四種果蔬表面E.coliO157∶H7生物膜的清除,以期探究ACP的抗菌機(jī)制及應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

E.coliO157∶H7(CICC 21530) 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)提供;胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(Trypticase soy broth medium,TSB) 杭州微生物試劑有限公司;魚粉蛋白胨、瓊脂 青島海博生物科技有限公司;牛肉浸膏 北京奧博星有限公司;氯化鈉、無水磷酸二氫鉀、無水磷酸氫二鈉、硫酸、氯仿 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;苯酚、異戊醇、乙醇、醋酸鈉 上海阿拉丁有限公司;新鮮戶太葡萄、維多利亞青提、圣女果、生菜 購于江蘇大學(xué)凱源超市。

APLM-SP-YB-D1KW-3232328-2-5大氣壓冷等離子體裝置 南京愛特維電子科技有限公司;TGL-16K高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀有限公司;Scizntz-D超聲波細(xì)胞破碎儀 寧波新芝有限公司;Infinite 200 PRO酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司;UV2550紫外分光光度計 日本島津公司;Color Quest XE分光測色儀 美國HunterLab公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 ACP處理對E.coliO157∶H7生物膜的清除作用測定 將無菌不銹鋼片(2 cm×2 cm)加入到接有E.coliO157∶H7菌液(105～106CFU/mL)的TSB培養(yǎng)基中,25 ℃下培養(yǎng)5 d,期間每天更換一次滅過菌的TSB培養(yǎng)基,5 d后將不銹鋼片取出至無菌培養(yǎng)皿中,用無菌PBS浸泡清洗30 min,以除去游離的E.coliO157∶H7。然后送至大氣壓冷等離子體裝置的載物臺進(jìn)行ACP處理,控制處理時間為2 min,處理功率分別為0、200、300、400、500、600 W以確定最佳處理功率;控制處理功率為400 W,處理時間分別為0、1、2、3、4、5 min以確定最佳處理時間,未經(jīng)ACP處理的不銹鋼片作為空白。處理結(jié)束后將不銹鋼片置于含有20 mL無菌PBS的離心管中,超聲10 min以使不銹鋼片表面的生物膜分離形成浮游細(xì)菌。然后將所得菌懸液十倍梯度稀釋,涂布于NA瓊脂培養(yǎng)基,24 h后測定殘存菌數(shù)[23]。ACP處理對E.coliO157∶H7生物膜的清除率的計算公式:

1.2.2 場發(fā)射掃描電鏡觀察E.coliO157∶H7生物膜 將尼龍片(1 cm×1 cm)用無水乙醇浸泡,超聲清洗4 h,121 ℃滅菌30 min。將無菌尼龍片加入接有E.coliO157∶H7菌液(105～106CFU/mL)的TSB培養(yǎng)基中,25 ℃下培養(yǎng)5 d,期間每隔24 h用移液槍吸走全部TSB培養(yǎng)基,并加入等量全新的滅過菌的TSB培養(yǎng)基,5 d后將不銹鋼片取出,用無菌PBS清洗三次后晾干,隨后用ACP處理,未經(jīng)ACP處理的尼龍片作為空白。最后用場發(fā)射掃描電鏡觀察處理組與空白組的生物膜變化情況[23]。

1.2.3 ACP處理對E.coliO157∶H7生物膜的抑制機(jī)制研究 胞外聚合物中多糖、蛋白質(zhì)及DNA含量測定參考柏梅[24]山蒼子精油對胞外聚合物中多糖、蛋白質(zhì)及DNA影響的實驗方法,將山蒼子精油處理改為ACP處理。

1.2.4 ACP處理對四種果蔬表面E.coliO157∶H7生物膜的清除作用評價 取約大小為1 cm×1 cm的葡萄皮浸泡在100 ppm的次氯酸鈉溶液中,超聲1 h后,置于超凈臺中,紫外滅菌1 h以除去葡萄皮表面原有微生物,然后將葡萄皮加入到接有E.coliO157∶H7菌液(105～106CFU/mL)的TSB培養(yǎng)基中,25 ℃下培養(yǎng)3 d,期間每隔24 h用移液槍吸走全部TSB培養(yǎng)基,并加入等量全新的滅過菌的TSB培養(yǎng)基,3 d后將葡萄皮取出至無菌培養(yǎng)皿中,用無菌PBS浸泡清洗30 min,以除去游離的E.coliO157∶H7。待葡萄皮自然晾干后,取六片葡萄皮在最佳處理功率和處理時間條件下進(jìn)行ACP處理,每次只處理一片葡萄皮,未經(jīng)ACP處理的葡萄皮作為空白。

表1 葡萄感官評分表Table 1 Sensory evaluation standards of grape

取其中一片處理組葡萄皮和空白組葡萄皮置于兩個盛有PBS的無菌均質(zhì)袋中,拍打式均質(zhì)器均質(zhì)15～20 s,制成1∶5的樣品勻液,將所得樣品勻液十倍梯度稀釋,涂布于NA瓊脂培養(yǎng)基,24 h后測定殘存菌數(shù)。剩下五片處理組葡萄皮和五片空白組葡萄皮于12 ℃下貯藏,分別待1、2、3、4、5 d后按上述步驟均質(zhì)、稀釋、涂布、計數(shù)。另取12片培養(yǎng)有E.coliO157∶H7生物膜的葡萄皮均分為兩組,按上述步驟進(jìn)行兩次重復(fù)實驗。取新鮮的圣女果、維多利亞青提和生菜作為測試果蔬,按上述步驟處理樣品以評價ACP處理對其表面E.coliO157∶H7生物膜的清除作用[25]。

1.2.5 色澤測定 由于購買來的整粒葡萄顏色深淺不一,測色澤時會產(chǎn)生較大誤差,取顏色深淺較為均一的半粒葡萄作為測試樣品,在相同部位進(jìn)行ACP處理,處理結(jié)束后立即采用分光測色儀分析表面顏色變化,得出L*、a*、b*值,未經(jīng)ACP處理的葡萄作為空白組。

1.2.6 感官評定 在江蘇大學(xué)隨機(jī)選取30位師生對空白組和處理組的葡萄的感官性能(外觀、顏色、味道、總體接受性)作出評價打分,1～9分代表喜歡的不同程度[26]。另取新鮮的圣女果、維多利亞青提和生菜作為測試果蔬,按上述步驟評價各個果蔬的感官性能。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗重復(fù)三次,實驗結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差的形式,使用SPSS軟件(IBM 21.0版本)中的單因素方差分析對空白組和實驗組進(jìn)行顯著性分析(P<0.05表明有顯著性差異,圖中用*表示),Origin 8.5軟件進(jìn)行分析作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 ACP處理對E. coli O157∶H7生物膜的清除作用

2.1.1 ACP最佳處理功率的確定 如圖1所示,未經(jīng)ACP處理的不銹鋼片表面生物膜活菌數(shù)為1.05×105CFU/cm2,隨著處理功率增加至400 W,不銹鋼片表面生物膜活菌數(shù)逐漸降至3.50×103CFU/cm2,與未經(jīng)ACP處理的不銹鋼片表面生物膜活菌數(shù)相比差異顯著(P<0.05)。繼續(xù)增加處理功率,活菌數(shù)逐漸回升至6.55×104CFU/cm2,由此可見,在處理功率為400 W條件下,不銹鋼片表面生物膜殘存活菌數(shù)最低,對應(yīng)的生物膜清除率達(dá)到最高,可清除97.66%±0.28%的E.coliO157∶H7。可能是因為在此功率下冷等離子體釋放出的自由基、離子、受激分子等活性粒子作用于生物膜,使細(xì)胞膜通透性增加,導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)大量泄漏,促使細(xì)胞凋亡[20-21];另外冷等離子體釋放出的活性粒子可能也會降低胞外聚合物中多糖、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的含量,導(dǎo)致生物膜被離散、瓦解。因此選擇400 W作為ACP的最佳處理功率。

圖1 ACP最佳處理功率的確定Fig.1 Determination of optimal ACP processing power注:*表示與空白相比,差異顯著(P<0.05)。圖2、圖4、圖5同。

2.1.2 ACP最佳處理時間的確定 如圖2所示,未經(jīng)ACP處理的不銹鋼片表面生物膜活菌數(shù)約為1.23×106CFU/cm2,隨著處理時間增加至3 min,不銹鋼片表面生物膜活菌數(shù)逐漸降至3.02×103CFU/cm2,與未經(jīng)ACP處理的不銹鋼片表面生物膜活菌數(shù)相比差異顯著(P<0.05)。繼續(xù)增加處理時間至4 min,活菌數(shù)回升至1.78×104CFU/cm2,當(dāng)處理時間為5 min時,活菌數(shù)回落至7.08×103CFU/cm2,由此可見,處理時間在3、4、5 min時,殘存活菌數(shù)穩(wěn)定在104CFU/cm2上下,在處理時間為3 min條件下,不銹鋼片表面生物膜殘存活菌數(shù)最低,對應(yīng)的生物膜清除率達(dá)到最高,可清除99.75%±0.25%的E.coliO157∶H7,因此,選擇3 min作為ACP的最佳處理時間。

圖2 ACP最佳處理時間的確定Fig.2 Determination of optimal ACP processing time

圖4 ACP處理后E. coli O157∶H7生物膜胞外物質(zhì)游離程度變化Fig.4 Changes of biofilm extracellular materials after ACP treatment注:A:胞外聚合物中多糖含量變化;B:胞外聚合物中蛋白質(zhì)含量變化;C:胞外聚合物中DNA含量變化。

2.2 場發(fā)射掃描電鏡觀察生物膜

圖5 ACP處理對四種果蔬表面E. coli O157∶H7生物膜的清除作用評價Fig.5 Evaluation of clearance effect of ACP treatment on E. coli O157∶H7 biofilms on the surface of four fruits and vegetables注:A:戶太葡萄;B:圣女果;C:維多利亞青提;D:生菜。

如圖3所示,在場發(fā)射掃描電鏡下,樣品被放大至30000倍后,空白組中E.coliO157∶H7飽滿光滑,大部分E.coliO157∶H7相互聚集在一起,黏附在尼龍片表面,形成致密的生物膜,只有極少數(shù)的游離細(xì)菌存在;經(jīng)ACP處理后,已經(jīng)觀察不到致密的大范圍的生物膜結(jié)構(gòu),大部分的E.coliO157∶H7以游離的方式分散開來,且部分E.coliO157∶H7內(nèi)容物滲出,處于失活狀態(tài),E.coliO157∶H7生物膜基本被破壞,ACP處理達(dá)到了較佳的清除效果。

圖3 場發(fā)射掃描電鏡觀察E. coli O157∶H7生物膜(30000×)Fig.3 Scanning electron microscope images ofE. coli O157∶H7 biofilms(30000×)注:A:空白組;B:處理組。

2.3 ACP處理對E. coli O157∶H7生物膜的抑制機(jī)制

胞外聚合物中多糖在細(xì)菌生物膜形成過程中可通過靜電作用將細(xì)菌黏附在一起,由圖4A可知,與空白組相比,經(jīng)ACP處理后,E.coliO157∶H7的胞外聚合物中多糖含量顯著降低(P<0.05)。ACP處理可抑制胞外聚合物中多糖的合成與分泌,從而抑制生物膜的形成。另外圖4B反映了胞外聚合物中蛋白質(zhì)含量相對空白組也顯著降低(P<0.05),這也說明ACP處理可抑制E. coli O157∶H7胞外聚合物中蛋白質(zhì)的合成與分泌,但ACP處理并沒有影響胞外聚合物中DNA的含量,圖4C中空白組與處理組的胞外聚合物中DNA含量差異不顯著。

2.4 ACP處理對四種果蔬表面E. coli O157∶H7生物膜的清除作用評價

表2 ACP處理對四種果蔬色澤和感官品質(zhì)的影響Table 2 Effects of ACP treatment on color and sensory quality of four kinds of fruits and vegetables

圖5結(jié)果顯示,與空白組相比,在400 W下經(jīng)ACP處理3 min后的四種果蔬表面生物膜中殘存活菌數(shù)均大大降低,在處理當(dāng)天,戶太葡萄、圣女果、維多利亞青提及生菜表面殘存活菌數(shù)分別降低了98.99%±0.38%、99.92%±0.20%、96.84%±0.18%、99.80%±0.23%。戶太葡萄與維多利亞青提的表面殘存活菌數(shù)于ACP處理后2 d達(dá)到最低,圣女果表面的殘存活菌數(shù)則在1 d后即達(dá)到最低,之后殘存活菌數(shù)均先緩慢上升后緩慢下降,而生菜在ACP處理完后的2 d內(nèi)殘存活菌數(shù)緩慢上升,之后緩慢下降,但5 d內(nèi)四種果蔬表面的殘存活菌數(shù)仍在抑制范圍內(nèi)。四種果蔬表面的殘存活菌數(shù)第二次下降的原因可能是果蔬表皮的營養(yǎng)已經(jīng)不足,無法滿足E.coliO157∶H7的生長、代謝活動,導(dǎo)致殘存活菌數(shù)再次降低。另外,不同果蔬表面殘存的活菌數(shù)不同可能是因為果蔬表面的粗糙度不同,造成了E.coliO157∶H7生物膜形成的差異,其中,生菜表面殘存活菌數(shù)最多,由此可見,生菜表面較易適合E.coliO157∶H7生物膜的形成,這可能與生菜表面密集的氣孔有關(guān)。綜合四種果蔬空白組與處理組表面的殘存菌數(shù)變化來看,ACP處理可在1～2 d內(nèi)使戶太葡萄、圣女果、維多利亞青提表面殘存活菌數(shù)降至最低,而生菜在處理當(dāng)天表面殘存活菌數(shù)達(dá)到最低,但在5 d內(nèi)四種果蔬表面殘存活菌數(shù)均在抑制范圍內(nèi),達(dá)到了較佳的生物膜清除效果,延長了果蔬的貯藏期。

2.5 色澤測定和感官評定

由表2可知,在400 W的功率下,采用ACP處理3 min后,戶太葡萄的a*值有所上升,L*值、b*值略微降低,表明ACP處理后,戶太葡萄色澤略微不如新鮮的戶太葡萄,但影響不大;圣女果的L*值基本維持不變,a*值和b*值均有較大上升,表明ACP處理略微加深了圣女果的色澤;維多利亞青提的L*值和b*值有明顯下降,但a*值略微上升,表明ACP處理略微減淡了維多利亞青提的色澤;生菜的L*值和a*值略微下降,但b*值略微上升,表明ACP處理略微減淡了維多利亞青提的色澤。另外,四種果蔬的外觀、顏色、味道雖有所變化,但總體上也能被接受。綜上所述,ACP處理雖對四種果蔬的色澤和感官品質(zhì)略有影響,但仍能被大家所接受。

3 結(jié)論

大氣壓等離子體處理對E.coliO157∶H7生物膜表現(xiàn)出了較好的清除作用。在最佳處理功率400 W,最佳處理時間3 min條件下,ACP通過抑制胞外聚合物中多糖及蛋白質(zhì)的合成與分泌來抑制生物膜的形成,表現(xiàn)出了最佳的清除效果;另外,通過場發(fā)射掃描電鏡也能觀察到在經(jīng)ACP處理后E.coliO157∶H7生物膜大幅度被清除,大部分E.coliO157∶H7由聚集狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x狀態(tài)。當(dāng)ACP應(yīng)用于戶太葡萄、圣女果、維多利亞青提及生菜這四種果蔬表面的E.coliO157∶H7生物膜的清除時,在處理當(dāng)天及在5 d內(nèi)表現(xiàn)出了明顯的抑制效果,延長了四種果蔬的貯藏期。同時,感官評定結(jié)果表明,ACP處理基本不影響四種果蔬的感官品質(zhì),加之ACP是在大氣壓條件下產(chǎn)生,不需昂貴的真空設(shè)備和復(fù)雜耗時的操作程序,因此,在果蔬表面E.coliO157∶H7生物膜的清除過程中,可以引進(jìn)ACP處理,以減少果蔬表面E.coliO157∶H7生物膜的污染,提高果蔬的食用安全性。另外,可以進(jìn)一步研究ACP處理對其他細(xì)菌生物膜的清除效果及機(jī)制,為ACP處理更廣闊的應(yīng)用在果蔬貯藏保鮮領(lǐng)域奠定理論基礎(chǔ)。