基于MiSeq高通量測序技術(shù)宣恩地區(qū)米酒微生物多樣性解析

向凡舒,劉雪婷,代程洋,張振東,郭 壯,2,*

(1.湖北文理學(xué)院食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所,湖北襄陽 441053; 2.恩施市公共檢驗(yàn)檢測中心,湖北恩施 445000)

湖北地區(qū)居民自古就有制作和飲用米酒的習(xí)俗,其中最具名氣的當(dāng)屬孝感米酒,孝感米酒現(xiàn)已較好地實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化發(fā)展,產(chǎn)品更是遠(yuǎn)銷海內(nèi)外[1]。

表1 PCR擴(kuò)增引物序列信息Table 1 The information of PCR amplification primer sequence

除孝感米酒外,湖北其他地區(qū)的居民尤其是少數(shù)民族居民亦有制作米酒的習(xí)俗。米酒是以糯米或秈米為基質(zhì),接入米酒曲自然發(fā)酵而成,微生物群系對(duì)其產(chǎn)品品質(zhì)的形成具有重要的作用[2]。

國內(nèi)學(xué)者對(duì)不同地區(qū)產(chǎn)米酒的微生物多樣性進(jìn)行了解析,王艷萍等[3]采用傳統(tǒng)的微生物學(xué)手段對(duì)米酒醪中的微生物進(jìn)行了分離鑒定,確定了毛霉屬是米酒發(fā)酵過程中主要的優(yōu)勢菌屬,寧亞麗等[4]研究發(fā)現(xiàn)吉林延邊朝鮮族地區(qū)米酒中的優(yōu)勢菌隸屬于乳桿菌屬(Lactobacillus)和腸桿菌屬(Enterobacter),但是傳統(tǒng)的微生物學(xué)技術(shù)主要依賴純培養(yǎng)的技術(shù),難以獲得食品中微生物種群的完整信息。作為第二代測序技術(shù),MiSeq高通量測序不僅測序結(jié)果可信度高,且能夠?qū)δ骋晃⑸锶郝浣Y(jié)構(gòu)進(jìn)行全面和客觀的分析[5]。采用該技術(shù),本研究團(tuán)隊(duì)前期對(duì)孝感米酒曲的微生物多樣性進(jìn)行了解析,研究發(fā)現(xiàn),乳球菌屬和魏斯氏菌屬為孝感米酒曲中的優(yōu)勢細(xì)菌[6],而其真菌類群主要由隸屬于毛霉亞門和子囊菌門的淀粉霉屬、小克銀漢霉屬、毛霉屬、復(fù)膜孢酵母屬、曲霉屬、念珠菌、擬威爾酵母和接合酵母屬的8個(gè)屬組成[7]。而宣恩縣侗族居民釀造米酒中微生物的多樣性尚待解析。

本研究采用MiSeq高通量測序技術(shù)對(duì)湖北省恩施土家族苗族自治州宣恩地區(qū)米酒的細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行揭示,通過本研究的實(shí)施進(jìn)一步豐富米酒微生物多樣性解析的數(shù)據(jù),進(jìn)而對(duì)后續(xù)米酒中微生物菌種資源收集、保藏和遺傳多樣性解析提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

QIAGEN DNeasymericon Food Kit 德國QIAGEN公司;dNTPs Mix、5×TransStartTM、FastPfu Buffer、FastPfu Fly DNA聚合酶(5 U/μL) 北京全式金生物技術(shù)有限公司;DNA1000試劑盒 美國Agilent公司。

DYY-12電泳儀 北京六一儀器廠;vetiri梯度基因擴(kuò)增儀 美國AB公司;PE 300 MiSeq高通量測序平臺(tái) 美國Illumina公司;R930機(jī)架式服務(wù)器 美國DELL公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的采集和DNA的提取 從湖北省恩施土家族苗族自治州宣恩縣李家河鎮(zhèn)的農(nóng)戶家中采集3個(gè)米酒樣品,將樣品采集后置于裝有冰袋的采樣箱中低溫運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。根據(jù)QIAGEN DNeasymericon Food Kit試劑盒中的方法對(duì)樣品進(jìn)行宏基因組的提取,并對(duì)DNA的濃度進(jìn)行測定,將檢測合格的樣品置于-20 ℃冰箱備用。

1.2.2 PCR擴(kuò)增及MiSeq高通量測序 參照Qiu等[8]的方法對(duì)細(xì)菌16S rRNA的V3～V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,參照Rousk等[9]的方法對(duì)18S rRNA的V5～V7區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,使用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測,檢測合格的產(chǎn)物寄至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測序。

1.2.3 序列質(zhì)控及生物信息學(xué)分析 參照Sun等[10]的方法對(duì)返回的序列進(jìn)行質(zhì)量控制并根據(jù)核苷酸標(biāo)簽(barcode)區(qū)分序列來源,從而得到高質(zhì)量的序列。參考Du等[11]的方法,通過使用QILME平臺(tái)[12]對(duì)3個(gè)米酒樣品進(jìn)行物種以及多樣性的分析:首先采用PyNAST[13]將序列對(duì)齊,然后用UCLUST[14]軟件先按照100%相似度得到無重復(fù)的單一的序列,隨后按照97%的相似度建立操作分類單元(Operational taxonomic units,OTU),從細(xì)菌OTU中選出代表性的序列和SILVE數(shù)據(jù)庫[15]、greengene數(shù)據(jù)庫[16]和RDP(Ribosomal Database Project,Release 11.5)數(shù)據(jù)庫[17]進(jìn)行比對(duì),并從真菌OTU中選出代表性的序列和SILVE數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì),從而確定細(xì)菌和真菌的各分類學(xué)地位,并對(duì)物種多樣性和香農(nóng)指數(shù)等α多樣性進(jìn)行研究。

1.2.4 核酸登錄號(hào) 本研究中所有序列數(shù)據(jù)已提交至MG-RAST數(shù)據(jù)庫[18],ID號(hào)為mgp91123。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用超1指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)對(duì)樣品細(xì)菌和真菌的豐富度和多樣性進(jìn)行評(píng)價(jià),使Origin 8.5完成稀疏曲線和香農(nóng)曲線的繪制,維恩(Venn)圖由在線軟件Venny 2.1(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)繪制,其他的圖均由R進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品測序數(shù)據(jù)

宣恩米酒細(xì)菌和真菌的測序情況和各門、綱、目、科及屬的分類地位如表2所示。

由表2可知,3個(gè)宣恩米酒樣品一共產(chǎn)生了89101條16S rRNA V3～V4區(qū)核苷酸序列,平均每個(gè)樣品產(chǎn)生29700條序列。根據(jù)100%的相似度對(duì)序列進(jìn)行劃分得到27645條代表性的序列,繼而根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行劃分共得到4422個(gè)OTU。當(dāng)測序深度在26010條序列時(shí),XEMJ1、XEMJ2和XEMJ3的超1指數(shù)分別為908、854和752,其香農(nóng)指數(shù)分別為5.60、4.31和4.19。由此可見,XEMJ1具有最高的細(xì)菌物種豐富度及群落種類多樣性。

表2 測序情況及各分類地位數(shù)量Table 2 Sequencing results and numbers at different taxonomical levels

由表2亦可知,XEMJ1、XEMJ2和XEMJ3產(chǎn)生的18S rRNA V5～V7區(qū)核苷酸序列分別為49704條、53105條和45712條,根據(jù)100%的相似度對(duì)序列進(jìn)行劃分得到21895條代表性的序列,繼而根據(jù)97%的相似度進(jìn)行劃分共得到1629個(gè)OTU。當(dāng)測序量在44010條序列時(shí),XEMJ2的超1指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)均最大,分別為2635和2.84,由此可見XEMJ2具有最高的真菌物種豐富度和群落種類多樣性。

由圖1(A)可知,隨著測序深度的增加,細(xì)菌和真菌的發(fā)現(xiàn)物種數(shù)在繼續(xù)增加。由圖1(B)可知,當(dāng)測序深度大于5000時(shí),細(xì)菌和真菌的香農(nóng)指數(shù)開始進(jìn)入平臺(tái)期,說明即使增加測序深度,此時(shí)的群落種類多樣性可能不會(huì)增加。因此本研究的測序深度滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。由圖1亦可知,XEMJ1的細(xì)菌豐度和多樣性最大,XEMJ2的真菌豐度和多樣性最大,與表2的結(jié)果一致。

圖1 稀疏曲線(A)和香農(nóng)指數(shù)曲線(B)Fig.1 Sparse curve(A)and shannon index curve(B)

2.2 基于門屬水平樣品細(xì)菌和真菌群落組成分析

進(jìn)一步在門屬水平上對(duì)宣恩米酒的細(xì)菌群落組成進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),平均相對(duì)含量大于1.0%的門有3個(gè),本研究將這3個(gè)門定義為優(yōu)勢細(xì)菌門,平均相對(duì)含量大于1.0%的屬有6個(gè),將其定義為優(yōu)勢細(xì)菌屬,其在每個(gè)樣品中相對(duì)含量如圖2所示。

圖2 優(yōu)勢細(xì)菌門(A)和屬(B)相對(duì)含量Fig.2 Relative abundances of domainbacterial phylum(A)and genera(B)

由圖2(A)可知,宣恩米酒中主要的細(xì)菌門分別為Firmicutes(硬壁菌門)、Proteobacteria(變形菌門)和Bacteroidetes(擬桿菌門),其平均相對(duì)含量分別為89.53%、8.72%和1.10%。由圖2(B)可知,宣恩米酒中優(yōu)勢細(xì)菌屬分別為Pediococcus(片球菌屬,74.10%)、Bacillus(芽孢桿菌屬,6.32%)、Pseudomonas(假單胞菌屬,3.58%)、Lactobacillus(乳桿菌屬,3.03%)、Acinetobacter(不動(dòng)桿菌屬,1.22%)和Enterobacter(腸桿菌屬,1.08%)。由此可見,宣恩米酒中的細(xì)菌主要由隸屬于硬壁菌門的片球菌構(gòu)成。片球菌是革蘭氏陽性菌,可以利用碳水化合物產(chǎn)生乳酸,不產(chǎn)氣,不能夠分解蛋白,但是可以促進(jìn)發(fā)酵食品產(chǎn)生一些特殊的風(fēng)味物質(zhì),已報(bào)道的片球菌不僅可以作為促酵物來參與肉類和蔬菜的發(fā)酵[19],而且可以降低發(fā)酵物種的含胺量[20],因此片球菌在米酒的發(fā)酵過程中起著非常重要的作用。向凡舒等[21]采用DGGE和Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)對(duì)恩施地區(qū)的米酒的細(xì)菌多樣性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),硬壁菌門、變形菌門和擬桿菌門為恩施地區(qū)米酒中的優(yōu)勢細(xì)菌門,與本研究的結(jié)果一致,但Pediococcus、Enterococcus、Weissella、Kosakonia和Prevotella為恩施地區(qū)米酒中的優(yōu)勢細(xì)菌屬。而本研究中宣恩米酒的細(xì)菌優(yōu)勢屬與恩施地區(qū)米酒中的微生物群系構(gòu)成不同,且宣恩米酒中的乳桿菌屬是細(xì)菌群系中的優(yōu)勢細(xì)菌屬,乳桿菌可在米酒的發(fā)酵過程中將糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化成乳酸,同時(shí)產(chǎn)生乙醇和乙酸等副產(chǎn)物,從而賦予米酒特有的風(fēng)味,并有效的抑制其他雜菌的生長。對(duì)宣恩米酒樣品中優(yōu)勢真菌門和屬相對(duì)含量的分析結(jié)果如圖3所示。

圖3 優(yōu)勢真菌門(A)和屬(B)相對(duì)含量Fig.3 Relative abundances of domainfungal phylum(A)and genera(B)

由圖3(A)可知,宣恩米酒中主要的真菌門是Ascomycota(子囊菌門)和Mucoromycotina(毛霉亞門),其相對(duì)含量分別為71.25%和27.52%。由圖3(B)可知,宣恩米酒中優(yōu)勢真菌屬分別是Wickerhamomyces(異常威克漢姆酵母屬,44.67%)、Amylomyces(淀粉菌,27.06%)、Saccharomycopsis(扣囊復(fù)膜酵母,23.10%)和Trichomonascus(1.20%)。異常威克漢姆酵母屬在食品的發(fā)酵過程中起著重要的作用,具有提高乙酸乙酯產(chǎn)量從而增加發(fā)酵食品的口感和風(fēng)味的作用[22]。

2.3 基于OTU水平樣品細(xì)菌和真菌群落組成分析

本研究進(jìn)一步在OTU水平上對(duì)米酒微生物類群進(jìn)行了揭示,若某個(gè)OTU僅在一個(gè)樣品中出現(xiàn),將其定義為該樣品中的特有序列,若在3個(gè)樣品中均存在則將其定義為核心OTU,結(jié)果圖4所示。

圖4 細(xì)菌(A)和真菌(B)OTU的veen圖Fig.4 Veen diagram of bacterial(A)and fungal(B)OTU

由圖4(A)可知,XEMJ1、XEMJ2和XEMJ3樣品中特有的細(xì)菌序列分別為2799條、1339條和819條。雖然細(xì)菌核心OTU僅有306個(gè),但序列條數(shù)有79824條,占所有序列的89.88%。由圖4(B)可知,XEMJ1、XEMJ2和XEMJ3樣品中特有的真菌序列分別為347條、433條和394條,雖然真菌的核心OTU有114個(gè),但所含序列數(shù)有145383條,占所有序列的98.8%,由此可見,雖然含有少量的特有微生物類群,但是宣恩米酒樣品中存在大量的核心細(xì)菌和真菌類群。

若某個(gè)核心OTU在3個(gè)宣恩米酒樣品中的相對(duì)含量大于1.0%,將其定義為核心優(yōu)勢OTU,其相對(duì)含量的熱圖如圖5所示。

圖5 細(xì)菌(A)和真菌(B)核心優(yōu)勢OTU相對(duì)含量的熱圖Fig.5 Heat map of relative abundances ofcore domainbacterial(A)and fungal(B)OTU

由圖5(A)可知,11個(gè)細(xì)菌核心優(yōu)勢OTU中有9個(gè)隸屬于Pediococcus(片球菌屬),1個(gè)隸屬于Bacillus(芽孢桿菌屬),1個(gè)隸屬于Pseudomonas(假單胞菌屬)。在9個(gè)核心優(yōu)勢OTU中,OTU2156在樣品中的相對(duì)含量均是最高的,其在3個(gè)宣恩米酒樣品中的相對(duì)含量分別為25.28%、41.80%和43.40%,該OTU隸屬于Pediococcus(片球菌屬)。由圖5(B)可知,在對(duì)真菌核心優(yōu)勢OTU進(jìn)行分析可知,6個(gè)核心優(yōu)勢OTU中,OTU770、OTU41、OTU917和OTU720均隸屬于Saccharomycopsis(復(fù)膜酵母菌屬),平均相對(duì)含量分別為1.17%、1.02%、13.51%和5.18%;OTU497隸屬于Wickerhamomyces(異常威克漢姆酵母屬),平均相對(duì)含量為44.67%,而OTU416隸屬于Amylomyces(淀粉霉屬),平均相對(duì)含量為26.94%。上述結(jié)果也進(jìn)一步證明宣恩米酒樣品中存在大量的核心細(xì)菌和真菌類群。

2.4 優(yōu)勢細(xì)菌和真菌屬的相關(guān)性分析

本研究發(fā)現(xiàn)了6個(gè)優(yōu)勢細(xì)菌屬和4個(gè)優(yōu)勢真菌屬,其相關(guān)性結(jié)果如圖6所示。

圖6 細(xì)菌和真菌優(yōu)勢屬相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖Fig.6 Network diagram of domainbacterial(A)andfungal(B)genera based on correlation coefficient注:實(shí)線表示正相關(guān),虛線表示負(fù)相關(guān),線越粗表示相關(guān)性越強(qiáng);***表示P<0.001。

由圖6可知,Trichomonascus和Acinetobacter(不動(dòng)桿菌屬)之間呈極顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.998,P<0.001),Bacillus(芽孢桿菌屬)和Pediococcus(片球菌屬)之間呈極顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.999,P<0.001),Pediococcus(片球菌屬)和Pseudomonas(假單胞菌屬)之間呈極顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.999,P<0.001),其他優(yōu)勢菌屬之間的相關(guān)性差異并不顯著(P>0.05)。微生物構(gòu)成是發(fā)酵食品品質(zhì)形成的重要因素,不同的微生物在食品發(fā)酵過程中也具有不同的作用。崔夢(mèng)君等[23]對(duì)豆瓣醬中的優(yōu)勢細(xì)菌屬與COGs功能進(jìn)行分析知,碳水化合物的運(yùn)輸和代謝與片球菌屬呈顯著正相關(guān)。由此可見,片球菌屬對(duì)食品的發(fā)酵過程具有促進(jìn)作用。

3 結(jié)論

本研究采用Illumina MiSeq測序技術(shù)對(duì)宣恩米酒微生物多樣性進(jìn)行了解析,結(jié)果顯示優(yōu)勢細(xì)菌門分別為Firmicutes(硬壁菌門)、Proteobacteria(變形菌門)和Bacteroidetes(擬桿菌門),優(yōu)勢細(xì)菌屬分別為Pediococcus(片球菌屬)、Bacillus(芽孢桿菌屬)、Pseudomonas(假單胞菌屬)、Lactobacillus(乳桿菌屬)、Acinetobacter(不動(dòng)桿菌屬)和Enterobacter(腸桿菌屬),優(yōu)勢真菌門為Ascomycota(子囊菌門)和Mucoromycotina(毛霉亞門),優(yōu)勢真菌屬分別為Wickerhamomyces(異常威克漢姆酵母屬)、Amylomyces(淀粉菌)、Saccharomycopsis(復(fù)膜酵母菌屬)和Trichomonascus。雖然含有少量的特有微生物種群,但樣品中存在大量的核心細(xì)菌和真菌類群。