響應(yīng)面法優(yōu)化游離細(xì)胞法生產(chǎn)雄烯二酮初探

李世闖,蔡 帥,郭秋爽,張銘楷,李 華,劉宇鵬

(河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物工程研究所,河南開封 475004)

雄烯二酮是一類內(nèi)源性類固醇激素,可由人體性腺及腎上腺分泌,是體內(nèi)雄性激素合成途徑中睪酮的直接前體,也是雌性激素合成途徑中雌激素的前體。它在合理控制雄激素和雌激素的平衡中起到至關(guān)重要的作用[1-2]。雄烯二酮可調(diào)節(jié)男性體內(nèi)的睪酮含量,使得男性雄激素的含量增加,從而使得性能力增加。雄烯二酮能夠?qū)⒙殉箔h(huán)境中的雄激素水平提高到正常范圍,從而促進(jìn)卵巢內(nèi)卵泡的生長并且修復(fù)卵巢組織,增加妊娠的機(jī)率。另外,雄烯二酮還是甾體藥物合成的重要中間體,通過雄烯二酮幾乎可以合成所有的甾體藥物[3-4]。

目前我國生產(chǎn)雄烯二酮主要是從野生中藥材“穿地龍”等植物中提取薯蕷皂素經(jīng)化學(xué)合成而成,不僅工藝復(fù)雜、消耗成本高,而且污染環(huán)境。自從Sih等發(fā)現(xiàn)利用微生物可以切除甾醇的飽和側(cè)鏈后,以自然界的動(dòng)植物甾醇為原料生產(chǎn)甾體類藥物的研究進(jìn)展迅速。姜紹通等[5]進(jìn)行了兩相系統(tǒng)轉(zhuǎn)化植物甾醇為雄烯二酮的研究,結(jié)果表明,當(dāng)有機(jī)相為大豆油,有機(jī)相所占比例為22%,發(fā)酵7 d,投料量為4 g/L時(shí),植物甾醇的轉(zhuǎn)化率最高,達(dá)到85.7%。但是底物濃度太低,發(fā)酵時(shí)間長、易染菌,同時(shí)含有有機(jī)相,分離提取比較困難。王艷婷[6]利用雙水相體系進(jìn)行了降解植物甾醇側(cè)鏈和制備雄烯二酮的研究,在吐溫40添加量1%(V/V)、轉(zhuǎn)速240 r/min的條件下,植物甾醇投料濃度提高到10 g/L,發(fā)酵96 h后雄烯二酮的濃度達(dá)到1.1 g/L。傳統(tǒng)發(fā)酵方法生產(chǎn)雄烯二酮主要的限制因素是植物甾醇不溶于水,導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率低,同時(shí)提取也比較麻煩。游離細(xì)胞法比傳統(tǒng)的發(fā)酵法生產(chǎn)有不怕染菌、反應(yīng)時(shí)間短、反應(yīng)條件溫和、分離提取簡單等優(yōu)點(diǎn)[7-8]。王志龍等利用游離細(xì)胞法在濁點(diǎn)體系中降解植物甾醇生成雄二烯二酮[9],在轉(zhuǎn)化4 d時(shí)雄二烯二酮濃度達(dá)到12 g/L。申雁冰等發(fā)現(xiàn)β-環(huán)糊精可以提高植物甾醇的水溶性[10]。如果把游離細(xì)胞法和環(huán)糊精結(jié)合起來,可能會(huì)得到比較好的結(jié)果。

因此,本論文使用PB設(shè)計(jì)法[11]、最陡爬坡路徑法和響應(yīng)面中的Box-Behnken設(shè)計(jì)相結(jié)合對(duì)雄烯二酮的轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行優(yōu)化,提高轉(zhuǎn)化率,以期為工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雄甾-4-烯-3,17-二酮標(biāo)品(純度99.99%) Sigma公司;植物甾醇(純度95%) 西安岳達(dá)生物科技股份有限公司;羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD) 山東新大精細(xì)化工有限公司;其它試劑 均為市售分析純;菌種:分枝桿菌Mycobacteriumsp. NRRL B-3683 由河南大學(xué)生物工程研究所保存;種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20,檸檬酸2,檸檬酸鐵銨0.05,K2HPO4·3H2O 0.5,MgSO40.5,玉米漿10,植物甾醇 0.1～1,pH8.0。初始游離細(xì)胞轉(zhuǎn)化培養(yǎng)體系組成:0.02 mmol/L pH為8.0磷酸緩沖液100 mL,植物甾醇1 g,羥丙基-β-環(huán)糊精4 g,菌體5 g。

Scout SE電子天平 奧豪斯儀器有限公司;STARTER2100 pH計(jì) 奧豪斯儀器(上海)有限公司;SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;QHZ-98A全溫振蕩培養(yǎng)箱 太倉市華美生化儀器廠;BioFLO4000BIOREACTOR 7 L發(fā)酵罐 NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC公司;H1850R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司;氣相色譜GC-2014C 日本島津制作所。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 收集菌體 一級(jí)種子培養(yǎng),配制1瓶50 mL種子培養(yǎng)基,121 ℃滅菌30 min。將甘油管接種到培養(yǎng)基里,然后放入搖床中,30 ℃、200 r/min培養(yǎng)3 d。二級(jí)種子培養(yǎng),配制3瓶90 mL種子培養(yǎng)基,121 ℃滅菌30 min,然后接種一級(jí)種子,接種量10%(V/V),然后放入搖床中,30 ℃、200 r/min培養(yǎng)3 d。7 L發(fā)酵罐:配制2.7 L種子培養(yǎng)基,121 ℃滅菌30 min,冷卻后接種二級(jí)種子,接種量10%(V/V)。300 r/min,30 ℃培養(yǎng)1.5 d。然后把種子液用離心機(jī)離心,8000 r/min,4 ℃,離心3 min,離心完后倒掉上清液,菌體收集完后,再加入0.02 mmol/L pH為8.0的30 mL磷酸緩沖液潤洗3次,離心收集菌體細(xì)胞(菌體濃度為21.6 g/L,濕重),然后放置備用。

1.2.2 游離細(xì)胞法生產(chǎn)雄烯二酮工藝優(yōu)化 在500 mL搖瓶里加入1 g甾醇、4 g羥丙基-β-環(huán)糊精和5 g菌體,然后加入0.02 mmol/L pH為8.0的100 mL磷酸緩沖液,在搖床中以180 r/min、30 ℃振蕩培養(yǎng),轉(zhuǎn)化4 d后取樣測(cè)定,測(cè)得雄烯二酮轉(zhuǎn)化率為47.51%。為了提高雄烯二酮的轉(zhuǎn)化率,設(shè)計(jì)如下實(shí)驗(yàn)。

1.2.2.1 Plackett-Burman試驗(yàn) 將初始反應(yīng)體系的8個(gè)組分作為影響因素進(jìn)行全面考察,選擇11因子及實(shí)驗(yàn)次數(shù)N=12的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),以X3、X6、X9作為空項(xiàng)以估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差,以X1、X2、X4、X5、X7、X8、X10、X11分別代表羥丙基-β-環(huán)糊精濃度、反應(yīng)時(shí)間、磷酸緩沖液濃度、磷酸緩沖液pH、搖床轉(zhuǎn)速、搖床溫度、植物甾醇濃度、菌體量,每個(gè)因素取高低2個(gè)水平(表1)。

表1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)各因素與水平Table 1 Plackett-Burman experimental factors and levels

1.2.2.2 最陡爬坡試驗(yàn) 根據(jù)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的結(jié)果,做最陡爬坡實(shí)驗(yàn)。以植物甾醇、羥丙基-β-環(huán)糊精、菌體量為考察因素,以轉(zhuǎn)化率高低為指標(biāo),確定合適的范圍。

1.2.2.3 Box-Behnken中心組合試驗(yàn) 用爬坡設(shè)計(jì)得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì)(表2),用SAS 8.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行回歸分析并求得最優(yōu)值,得出響應(yīng)面分析結(jié)果,確定最佳轉(zhuǎn)化體系,最后依據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)面分析圖。

表2 Box-Beehnken設(shè)計(jì)因子及水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken design

表3 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 3 Plackett-Burman experimental design

1.2.3 雄烯二酮轉(zhuǎn)化率測(cè)定

1.2.3.1 樣品處理 取10 mL乙酸乙酯加入1 mL轉(zhuǎn)化液萃取,在搖床中振蕩30 min,轉(zhuǎn)速為200 r/min。然后再取9 mL乙酸乙酯加入1 mL萃取后的轉(zhuǎn)化液(稀釋100倍)。

1.2.3.2 檢測(cè)方法 用薄板層析法對(duì)雄烯二酮進(jìn)行定性測(cè)量。點(diǎn)樣,剪裁合適大小的硅膠板,在硅膠板底邊1.5～2 cm處畫線,用毛細(xì)管吸取試劑在直線上每隔1 cm左右點(diǎn)樣。層析:將展層劑(乙酸乙酯∶正己烷=7∶3)加入層析缸中均勻混合,待硅膠板的樣點(diǎn)涼干后,放置層析缸內(nèi),靜止大約30 min左右,直至展開劑上升到薄板上沿0.5～1.0 cm左右,停止層析。顯色:取出硅膠板,用吹風(fēng)機(jī)吹干,用50%濃硫酸作為顯色劑,放置于105 ℃的烘箱,加熱5～10 min。取出觀察,硅膠板上各物質(zhì)的顯色情況和斑點(diǎn)大小。植物甾醇顯紫色、雄烯二酮顯淺藍(lán)色、顯淺黃色的是轉(zhuǎn)化液樣品,成分比較復(fù)雜。

采用氣相色譜法進(jìn)行定量測(cè)定[12]。氣相色譜使用裝備有DB-1柱(30 m×0.53 mm×0.25 μm)的Shimadzu GC-2014C,以高純度氮?dú)庾鳛榱鲃?dòng)相,速率為1.0 mL/min。初始柱溫為220 ℃,保持3 min,然后以20 ℃/min升溫至280 ℃,保持14 min。進(jìn)樣口和檢測(cè)器FID分別為280和310 ℃。進(jìn)樣量為2 μL。

式中,C1:轉(zhuǎn)化結(jié)束后雄烯二酮的濃度;100:稀釋倍數(shù);C2:初始植物甾醇的濃度;0.95:植物甾醇的純度;0.70:雄烯二酮與植物甾醇的相對(duì)分子質(zhì)量之比(MAD=286.6,M甾醇=406.8)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)做3次,取其平均值作為實(shí)際轉(zhuǎn)化率。運(yùn)用SAS 8.0軟件進(jìn)行方差分析,采用Origin 8.5軟件做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法是一種近飽和的2水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。它可以用很少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)估出因素的主效應(yīng),從大量的考察因素中選出最重要的幾個(gè)以供進(jìn)一步研究[13]。Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表3,分析結(jié)果見表4。從表4的P值大小可以看出,對(duì)雄烯二酮轉(zhuǎn)化率具有顯著影響的因子分別是植物甾醇濃度、菌體量以及羥丙基-β-環(huán)糊精濃度,從表4中的t值可以看出,植物甾醇濃度、菌體量對(duì)雄烯二酮轉(zhuǎn)化率為正效應(yīng),羥丙基-β-環(huán)糊精濃度為負(fù)效應(yīng)。確定這3個(gè)因素作為下一步實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵因素。

表4 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果Table 4 Analytic result of Plackett-Burman experiment

2.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)

最陡爬坡法以實(shí)驗(yàn)值變化的梯度方向?yàn)榕榔路较?根據(jù)各因素效應(yīng)值的大小確定變化步長,能快速、經(jīng)濟(jì)地逼近最佳值區(qū)域[14]。從表5可以看出,隨著植物甾醇濃度、菌體量依次增大,羥丙基-β-環(huán)糊精濃度依次減小,雄烯二酮的轉(zhuǎn)化率先增大后減小。當(dāng)植物甾醇濃度為20 g/L,羥丙基-β-環(huán)糊精濃度為80 g/L,菌體量為100 g/L,雄烯二酮轉(zhuǎn)化率(65.71%)最大。所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)的中心點(diǎn)按照編號(hào)3情況下每個(gè)因素的量進(jìn)行。

表5 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Table 5 Experimental design of steepestascent and corresponding results

2.3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果與分析

3個(gè)重要因子的最適濃度范圍確定后,以植物甾醇濃度20 g/L、羥丙基-β-環(huán)糊精濃度80 g/L、菌體量100 g/L為中心點(diǎn)實(shí)施響應(yīng)面分析,設(shè)計(jì)和結(jié)果分析見表6和表7。用SAS 8.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

表6 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 6 Design of Box-Benhnken experiment

表7 Box-Behnken設(shè)計(jì)回歸分析Table 7 Regression analysis of Box-Behnken design

圖1～圖3為根據(jù)擬合方程做出的響應(yīng)面分析圖。從響應(yīng)面圖可以看出,隨著植物甾醇濃度、羥丙基-β-環(huán)糊精濃度、菌體量的增加,雄烯二酮的轉(zhuǎn)化率是增加的,但不是持續(xù)增大,當(dāng)這三個(gè)因子的濃度到一定值時(shí),雄烯二酮的轉(zhuǎn)化率開始下降?？衫肧AS軟件進(jìn)行脊嶺分析找到這3個(gè)因子的最佳值,來得到最大轉(zhuǎn)化率。由SAS 8.0軟件求出,當(dāng)植物甾醇

圖1 植物甾醇濃度和羥丙基-β-環(huán)糊精濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率影響的響應(yīng)面圖Fig.1 Response surface graph of the effectphytosterol concentration and hydroxypropyl-β-cyclodextrin concentration on conversion rate

濃度為19.41 g/L,羥丙基-β-環(huán)糊精濃度為80.14 g/L,菌體量為110.55 g/L,得到雄烯二酮預(yù)測(cè)最大轉(zhuǎn)化率為67.69%。

圖2 植物甾醇濃度和菌體量對(duì)轉(zhuǎn)化率影響的響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface graph of the effect of phytosterolconcentration and bacterial cell amount on conversion rate

圖3 羥丙基-β-環(huán)糊精和菌體量對(duì)轉(zhuǎn)化率影響的響應(yīng)面圖Fig.3 Response surface graph of the effect ofhydroxypropyl-β-cyclodextrin concentrationand bacterial cell amount on conversion rate

2.4 模型驗(yàn)證

為證實(shí)預(yù)測(cè)結(jié)果,在植物甾醇濃度為19.41 g/L,羥丙基-β-環(huán)糊精濃度為80.14 g/L,菌體濃度為110.55 g/L條件下重復(fù)3次搖瓶實(shí)驗(yàn),結(jié)果分別為66.54%、67.35%、67.86%,平均值為67.25%,與預(yù)測(cè)值接近,二者的良好擬合性證實(shí)了模型的有效性。優(yōu)化后的轉(zhuǎn)化體系為磷酸緩沖液濃度0.02 mmol/L,磷酸緩沖液pH6.5,搖床轉(zhuǎn)速180 r/min,搖床溫度28 ℃。

圖4為最優(yōu)條件下的雄烯二酮轉(zhuǎn)化率隨時(shí)間變化,從圖4中可以看出,第4 d時(shí)雄烯二酮轉(zhuǎn)化率最高,達(dá)到67.25%,此時(shí)雄烯二酮產(chǎn)量為8.68 g/L,生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)2.17 g/(L·d)。

圖4 雄烯二酮轉(zhuǎn)化曲線圖Fig.4 The conversion curve of androstenedione

3 結(jié)論

本文利用游離細(xì)胞法生產(chǎn)雄烯二酮進(jìn)行了研究,先通過Plackett-Burman設(shè)計(jì)快速有效地從8個(gè)影響游離細(xì)胞轉(zhuǎn)化植物甾醇生產(chǎn)雄烯二酮的因素中篩選出3個(gè)顯著性影響因素:植物甾醇濃度、羥丙基-β-環(huán)糊精濃度、菌體濃度;然后利用最陡爬坡法逼近最大響應(yīng)值區(qū)域并用Box-Beehnken設(shè)計(jì)對(duì)轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行優(yōu)化,建立了各因素與雄烯二酮轉(zhuǎn)化率之間的數(shù)學(xué)模型,取得了良好的試驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果表明:當(dāng)植物甾醇19.41 g/L,羥丙基-β-環(huán)糊精80.14 g/L,菌體量110.55 g/L時(shí),雄烯二酮轉(zhuǎn)化率達(dá)到67.25%,比優(yōu)化前提高了41.55%。相比于化學(xué)法生產(chǎn)雄烯二酮,本論文采用的方法生態(tài)環(huán)保,同時(shí)原料來源廣泛,轉(zhuǎn)化率高。游離細(xì)胞法生產(chǎn)雄烯二酮的轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)強(qiáng)度均高于發(fā)酵法,具有較大的優(yōu)勢(shì)。今后,將進(jìn)一步優(yōu)化產(chǎn)品的提取純化工藝,提高雄烯二酮的提取收率,為工業(yè)化應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。