皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai)不同部位肌肉的蛋白分布特性

尹蕾麗,周 紛,姚林燕,王錫昌,*

(1.上海海洋大學食品學院,上海 201306; 2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心,上海 201306; 3.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風險評估實驗室(上海),上海 201306)

鮑魚又稱鰒魚、海耳等,屬軟體動物門(Mollusca),腹足綱(Gastropoda)、鮑科(Haliotidae),是我國名貴的海產(chǎn)品,由于其營養(yǎng)含量豐富、味道鮮美及口感獨特,深受全世界人們的喜愛[1-3]。我國是世界第一養(yǎng)鮑大國,隨著經(jīng)濟的發(fā)展及市場需求的提高,鮑魚的養(yǎng)殖產(chǎn)量呈逐年上升趨勢,據(jù)2018中國漁業(yè)年鑒統(tǒng)計,總產(chǎn)量約為16.3萬噸,相比2017年增長了9.85%[4],鮑魚現(xiàn)已成為家庭餐桌上的常見食材。我國現(xiàn)共有七大經(jīng)濟鮑類,其中皺紋盤鮑(Haliotisdiscushannai)是個頭最大、品質(zhì)最好、銷量最高的。

目前國內(nèi)外對鮑魚的研究主要集中在養(yǎng)殖[5-6]、生長特性[7]、副產(chǎn)物開發(fā)[8-10]及加工特性[11-12]等方面,而對鮑魚原料學屬性的關(guān)注較少。除活品外,鮑魚常見的銷售形式還有冷凍、干制及罐裝等,在日本,鮑魚也常常被制作成刺身后進行銷售和食用[2-3]。不同的加工方式,對肌肉的滋味、口感及營養(yǎng)等方面均會帶來不同的程度影響,而這與肌肉本身特性息息相關(guān)。雖然已有學者[13-15]對鮑魚肌肉質(zhì)地方面進行過相關(guān)性研究,但我國對鮑魚肌肉性質(zhì)的基礎(chǔ)性研究依然薄弱。

肌原纖維蛋白與膠原蛋白是構(gòu)成鮑魚肌肉的主要蛋白,其相對含量、相互作用等對于肌肉質(zhì)地的影響較大[16]。肌原纖維蛋白可以維持肌肉細胞骨架的完整性,而膠原蛋白的含量與肌肉的嫩度顯著相關(guān)[17]。另外,值得注意的是鮑魚肌原纖維蛋白中副肌球蛋白含量較高,這對鮑魚在加工過程中肌肉質(zhì)地的變化有著重要影響[16]。因此,本研究從食品原料學角度出發(fā),對皺紋盤鮑不同部位肌肉的營養(yǎng)、蛋白組成、分布及微觀組織展開初步研究,為后續(xù)加工方式對肌肉特性影響的研究提供理論依據(jù),完善我國鮑類肌肉特性的基礎(chǔ)性研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

皺紋盤鮑(Haliotisdiscushannai) 上海蘆潮港海鮮市場;CuSO4、K2SO4優(yōu)級純,上海麥克林生化科技有限公司;二甲苯 分析純,上海生工生物有限公司;十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑 美國Sigma公司;Van Gieson試劑盒 上海源葉生物科技有限公司。

H2050R高速冷凍離心機 長沙湘儀有限公司;FOSS8400凱氏定氮儀 福斯分析儀器公司;RM2245石蠟切片機 德國萊卡公司;ECLIPSE 80i高級研究級顯微鏡 上海尼康儀器有限公司;MesoMR23-060H.I低場核磁共振成像分析儀 上海紐邁科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料處理 2019年11月上旬,從上海市蘆潮港海鮮市場某海鮮批發(fā)店購入同一捕撈地點、時間及批次的皺紋盤鮑,活體運輸至上海海洋大學研究室,個體平均質(zhì)量為(34.96±2.78) g。將活品鮑魚清洗后去殼、去內(nèi)臟等,后進行分離。

1.2.2 腹足肌肉組成 按照圖1所示,將腹足肌肉分成閉殼肌(A)、過渡區(qū)(B)及裙邊(C)三部分進行后續(xù)測定。

圖1 皺紋盤鮑腹足肌肉的劃分Fig.1 Division of H. discus hannai muscle

1.2.3 基本營養(yǎng)成分測定

1.2.3.1 水分的測定 參照GB 5009.3-2016《食品中水分的測定》。

1.2.3.2 粗蛋白的測定 參照GB 5009.5-2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》凱氏定氮法。

1.2.3.3 粗脂肪的測定 參照GB 5009.6-2016索氏抽提法。

1.2.3.4 灰分的測定 參照GB/T 5009.4-2016高溫灼燒法。

1.2.3.5 總糖的測定 參照GB 9695.31-2008分光光度法。

1.2.4 蛋白的分離 含氮物的分離參照張龍[18]的方法,并略有修改。具體操作:取2.5 g樣品于離心管中,加入6倍體積0.1 mol/L的NaCl,20 mmol/L Tris-HCl(pH=7.5)緩沖液,均質(zhì)90 s后,以300 r/min的轉(zhuǎn)速攪拌30 min,然后在12000×g的轉(zhuǎn)速下離心10 min,保留上清液,在沉淀中繼續(xù)加入6倍體積0.1 mol/L的NaCl,20 mmol/L Tris-HCl(pH=7.5)緩沖液攪拌、離心(同上),此過程重復2遍,合并上清液即為水溶性蛋白。隨后在沉淀中加入6倍體積0.6 mol/L的NaCl,20 mmol/L Tris-HCl(pH=7.5)緩沖液攪拌、離心(同上),重復4次,合并上清液即為鹽溶性蛋白。在沉淀中加入6倍體積0.1 mol/L的NaOH溶液攪拌,過夜攪拌,離心(同上)取得的上清液即為堿溶性蛋白,沉淀為基質(zhì)蛋白,所有操作均在4 ℃下進行。

1.2.5 蛋白分布測定 將蛋白溶液與電泳上樣液以4∶1的比例混合,于100 ℃煮沸5 min制得電泳樣品。采用SDS-PAGE法進行蛋白組分分析,參照張龍[18]的方法,其中濃縮膠質(zhì)量分數(shù)為5%,分離膠質(zhì)量分數(shù)為7.5%。

1.2.6 顯微結(jié)構(gòu)觀察 將鮑魚切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的正方體浸入10%福爾馬林中固定24 h,接著用70%、85%、90%、95%、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ逐級脫水4 h、2 h、2 h、1 h、30 min及30 min,后將樣品置于乙醇與二甲苯混合液(1∶1)中浸泡5 min,取出置于二甲苯I溶液(100%)中浸泡10 min,取出后立即放入二甲苯II溶液(100%)中浸泡10 min左右,待樣品呈現(xiàn)透明狀態(tài)時結(jié)束浸泡,然后將樣品浸入65 ℃石蠟中包埋3 h后,切片、烤片、采用Van Gieson染色后在光學顯微鏡下觀察。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有實驗組測定3平行,數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示,使用SPSS 17.0軟件和Microsoft Excel 2019進行數(shù)據(jù)處理,采用Duncan法進行顯著性差異分析處理,顯著水平P<0.05。

表2 皺紋盤鮑腹足不同部位肌肉的基本營養(yǎng)成分分析Table 2 Analysis of the basic nutrient composition of muscles in different parts of H. discus

2 結(jié)果與分析

2.1 腹足肌肉組成

表1為鮑魚腹足不同部位肌肉的一般質(zhì)量組成。鮑魚屬于單殼貝類,與以貝柱為主的扇貝不同的是,鮑魚的整個腹足肌肉部分是其可食部位,主要由肌原纖維蛋白和膠原蛋白所構(gòu)成。研究表明,鮑魚的閉殼肌主要由肌原纖維蛋白構(gòu)成,而裙邊部分主要是膠原蛋白,從中心到邊緣部分,肌原纖維蛋白的含量逐漸減少,膠原蛋白的含量逐漸增多[15,17]。另外,膠原蛋白的含量與肌肉的韌性存在相關(guān)性,含量越高,肌肉質(zhì)地越緊實[17],因此對腹足肌肉部分進行細分和研究是有必要的。從表1中可以看出,鮑魚肌肉中閉殼肌部位質(zhì)量占比最多,高達38.99%,其次為過渡區(qū)及裙邊部分,整個腹足肌肉占總重量約35%左右。與菲律賓蛤仔(3.00%)、蝦夷扇貝(12.41%)、海灣扇貝(11.24%)、櫛孔扇貝(14.08%)等[18-19]相比,其可食部分所占比例較大。

表1 鮑魚不同部位肌肉占腹足及整貝的質(zhì)量比(%)Table 1 The general weight compositionsof H. discus hannai(%)

2.2 基本營養(yǎng)成分分析

皺紋盤鮑不同部位肌肉的基本營養(yǎng)成分分析結(jié)果如表2所示。從肌肉的中心到邊緣部位,水分含量呈顯著遞增趨勢(P<0.05),而粗脂肪含量呈顯著遞減趨勢(P<0.05),這與郝林娟等[13]對鮑魚不同部位肌肉研究的結(jié)果相似。與其他貝類相比,皺紋盤鮑的蛋白含量較高,其含量高于菲律賓蛤仔(6.91%～10.39%)[18]、華貴櫛孔扇貝(14.30%)[20]、長江口河蜆(9.29%)[21]及翡翠貽貝(10.60%)[22]等,而脂肪含量又遠低于麗文蛤(3.52%)、海灣扇貝(2.21%)[23]及蝦夷扇貝(1.24%)[24]等,是一種高蛋白低脂肪的貝類。三個部位的肌肉在灰分含量方面不存在顯著性差異(P>0.05),裙邊部分的總糖含量顯著低于閉殼肌及過渡區(qū)部分(P<0.05),這與肖桂華等[14]的研究結(jié)果相似。一般來說,貝類中作為主要能量貯藏形式的糖原含量較為豐富,其含量會隨季節(jié)、產(chǎn)地的不同而有所不同[25]。另外,糖原的濃度與水分呈負相關(guān),當糖原濃度最高時,鮑魚的滋味最鮮美[26]。

2.3 蛋白組成分析

鮑魚肌肉中蛋白組成如表3所示?？诟小⒆涛?、營養(yǎng)等特性是鮑魚作為名貴水產(chǎn)品深受人們的喜愛原因。從部位來看,閉殼肌、過渡區(qū)及裙邊中非蛋白氮含量不存在顯著性差異(P>0.05)。非蛋白氮中包含了一些小分子多肽、游離氨基酸、核苷酸等物質(zhì),它們對呈味起重要作用[25]。在鹽溶性蛋白、堿溶性蛋白和基質(zhì)蛋白含量上三個部位存在顯著性差異(P<0.05),表現(xiàn)為從邊緣到中間鹽溶性蛋白與堿溶性蛋白含量依次增加,而肌基質(zhì)蛋白含量逐漸減少。堿溶性蛋白主要是一些變性蛋白,如交聯(lián)的肌原纖維蛋白,其含量的變化與蛋白質(zhì)中氫鍵、離子鍵、二硫鍵等的形成相關(guān)[27-28]。鹽溶性蛋白和膠原蛋白是維持肉細胞結(jié)構(gòu)完整的兩種主要的蛋白[16],含量的變化在一定程度上可以反映蛋白質(zhì)變性情況。另外,可以發(fā)現(xiàn)裙邊部分基質(zhì)蛋白含量約為過渡區(qū)的兩倍,閉殼肌部分的三倍?；|(zhì)蛋白中主要成分為膠原蛋白,含量隨部位的變化與Olaechea[17]、郝林娟[13]、肖桂華[14]等的研究一致。膠原蛋白是結(jié)締組織的主要成分,也是肌肉中另一種重要作用的蛋白質(zhì)。膠原蛋白不僅可以作為蛋白質(zhì)與多糖相互作用網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分,還可以影響細胞骨架的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),介導細胞粘附及細胞遷移[29]。研究表明鮑魚腹足肌肉中肌原纖維蛋白含量約占總蛋白的40%～50%,膠原蛋白約占20%～35%[30],與本實驗研究結(jié)果相似,但樣品及蛋白分離方法的不同也會產(chǎn)生不一樣的結(jié)果[31]。

從蛋白含量來看,各組織中鹽溶性蛋白(30.59%～42.22%)與非蛋白氮(33.68%～35.16%)含量相對較高,水溶性蛋白(2.39%～2.85%)含量相對較低。水溶性蛋白的存在對肌原纖維蛋白凝膠性有一定影響,據(jù)報道,將肌漿蛋白加入富含肌原纖維蛋白的魚糜中可增強魚糜的強度、彈性、硬度等,改善其質(zhì)地特性[32-33]。另外,肌漿蛋白對肌肉的色澤、保水性也有影響。Mcloughlin等[34]發(fā)現(xiàn)肌漿蛋白沉淀會掩蓋肌漿的紅色,導致豬肉色澤發(fā)白。閉殼肌與過渡區(qū)的蛋白組成相似,含量依次為鹽溶性蛋白>非蛋白氮>堿溶性蛋白>基質(zhì)蛋白>水溶性蛋白。裙邊略有不同,含量最高的為非蛋白氮,達34.19%,剩下的依次為鹽溶性蛋白、基質(zhì)蛋白、堿溶性蛋白和水溶性蛋白。一般來說,非蛋白氮的含量越高,肌肉的風味越好[35-37]。

表3 皺紋盤鮑腹足不同部位肌肉蛋白組成分析Table 3 Analysis of muscle protein composition in different parts of H. discus hannai

圖2 皺紋盤鮑腹足不同部位肌肉的SDS-PAGE圖Fig.2 SDS-PAGE patterns of proteins in different parts of H. discus hannai注:M. 標準蛋白;1. 閉殼肌;2. 過渡區(qū);3. 裙邊。

2.4 蛋白分布分析

圖2顯示了鮑魚不同部位肌肉的蛋白的SDS-PAGE圖。從圖2中可以看出,鮑魚的全蛋白分子量分布在25～245 kDa范圍內(nèi),蛋白分布模式相似,種類豐富,主要以肌球蛋白重鏈(220 kDa)、副肌球蛋白(100 kDa)和肌動蛋白(48 kDa)為主。由中心到邊緣部位,在135～245 kDa和25～35 kDa之間的蛋白條帶變淺或消失,這可能與上面所測的蛋白含量相符合。另外,可以發(fā)現(xiàn)在245 kDa附近有明顯條帶,推測可能為肌球蛋白重鏈多聚體、膠原蛋白等[18]。

水溶性蛋白中主要含有一些與糖酵解有關(guān)的酶類,AMP-脫氨酶、小清蛋白和細胞色素C等水溶性物質(zhì)[38]。由水溶性蛋白的SDS-PAGE圖中可以看出,三個部位的蛋白條帶較多,分布相似,無明顯新的條帶產(chǎn)生。但裙邊在135～180及<48 kDa 范圍內(nèi)的蛋白條帶少于其他兩部位。

肌原纖維蛋白由粗絲和細絲構(gòu)成,粗絲主要包括肌球蛋白與副肌球蛋白,細絲主要包括肌動蛋白、原肌球蛋白和肌鈣蛋白。由鹽溶性蛋白的SDS-PAGE圖可以看出,肌原纖維蛋白也是主要以肌球蛋白重鏈、副肌球蛋白、肌動蛋白為主,這與郝林娟等[13]報道的南日鮑蛋白組成類似。軟體動物與脊椎動物最大的不同點在于副肌球蛋白含量特別高,在鮑魚肌原纖維蛋白中的含量可達35.8%[16]。少量的副肌球蛋白有助于肌肉凝膠的形成,賦予凝膠制品更好的彈性,但過量則會使凝膠制品變得堅硬[39-40]。裙邊在<35 kDa部分條帶基本不可見,且主要的蛋白條帶較細,說明其所含的蛋白含量較低,這與上述所測的蛋白分布結(jié)果一致。

堿溶性蛋白中所含條帶較少,蛋白組成較簡單。可以發(fā)現(xiàn),裙邊部分只在100及42 kDa附近看到明顯條帶,可能是因為這部分所含的變性蛋白較少。膠原蛋白是基質(zhì)蛋白的主要組成成分,其含量與肌肉的韌性緊密相關(guān)[16-17]。無脊椎動物中膠原蛋白主要為I型和V型,其中I型廣泛存在于間質(zhì)結(jié)締組織中,V型廣泛存在于細胞周圍結(jié)締組織中[29,41]，圖中在>245 kDa以上有蛋白條帶存在,推測為交聯(lián)結(jié)締組織。三部分肌肉在100～135 kDa存在條帶,推測為膠原蛋白的α鏈。膠原蛋白有α、β、γ三種構(gòu)象,兩條α鏈可組成一條β鏈,三條α鏈可組成一條γ鏈[42]。袁起新[42]對鮑魚膠原蛋白性質(zhì)的研究中發(fā)現(xiàn),鮑魚可能存在兩種或多種類型的膠原,其中主要的結(jié)構(gòu)類型為(α1)3,另外的結(jié)構(gòu)需要通過免疫印跡鑒定。

2.5 顯微結(jié)構(gòu)觀察

圖3 皺紋盤鮑不同部位肌肉的光學顯微結(jié)構(gòu)圖Fig.3 Light microscopical feature of muscles in different parts of H. discus hannai注:A、B、C分別表示閉殼肌、過渡區(qū)及裙邊三部分;1、2分別表示肌肉的橫切面與縱切面。

圖3所示為皺紋盤鮑不同部位肌肉在光學顯微鏡(200倍)下的橫切與縱切圖片。根據(jù)Van Gieson染色原理,肌纖維呈現(xiàn)黃色,而膠原纖維呈現(xiàn)紅色。從圖中可以看到從閉殼肌到裙邊部分,黃色逐漸減少,而紅色逐漸增多,表明肌原纖維呈遞減趨勢而膠原纖維呈遞增趨勢,這與圖2的測定結(jié)果相一致,且與肖桂華等[14]、?iseth等[43]的研究結(jié)果相同。另外,可以發(fā)現(xiàn)相同部位肌肉的橫切面與縱切面存在差異性。在橫切面中纖維主要呈點狀,少量條狀存在,而縱切面中纖維主要呈條狀,膠原隨機分布在肌纖維中間。閉殼肌部分的纖維粗短,分布存在一定的方向性,纖維間間隙較小,而裙邊部分纖維細長排列呈雜亂無序,纖維間間隙較大。對于海洋軟體動物來說,纖維束的直徑、粗細及纖維與纖維間的距離等都會影響鮑魚肌肉的質(zhì)地,纖維束越小,肌肉越緊實[43]。這些形態(tài)上的差異與后續(xù)加工中肌肉的品質(zhì)同樣密切相關(guān)。

3 結(jié)論

皺紋盤鮑不同部位肌肉在營養(yǎng)成分、蛋白含量及分布、組織結(jié)構(gòu)都存在一定的差異,這將會對肌肉質(zhì)地產(chǎn)生不同程度的影響。研究結(jié)果表明三個部位中閉殼肌部分在營養(yǎng)含量方面優(yōu)于其他兩部分。此部分肌肉中肌原纖維蛋白含量較高且肌肉組織緊密、纖維間隙較小,而裙邊部分膠原蛋白含量較高且肌纖維間間隙較大。本實驗通過對肌肉中幾種不同蛋白特性的研究以探索蛋白特性與其食用品質(zhì)之間的關(guān)聯(lián)性,豐富我國水產(chǎn)品基礎(chǔ)性研究數(shù)據(jù),為今后鮑魚的深加工提供相關(guān)的理論支撐和實踐依據(jù)。由于不同部位肌肉的差異性,今后工業(yè)上可以針對其不同位置肌肉硬度、韌性的不同,針對不同人群(老人、兒童、年輕人)的食用習慣開發(fā)出新的產(chǎn)品。此外,針對不同位置的蛋白差異性,本研究還可為今后凍品加工中保鮮劑的使用(位置、方式)提供新的思路。