豌豆分離蛋白-羧甲基纖維素納靜電復(fù)合物在乳液中的應(yīng)用研究

龐淑婕,李娜娜,任 思,劉麗婭,*,佟立濤,王麗麗,周閑容,周素梅,*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100193; 2.江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無錫 214122)

豌豆是重要的豆科作物,豌豆產(chǎn)值占豆類作物總產(chǎn)值的36%[1]。豌豆富含蛋白質(zhì)(20%～25%)[2-3],豌豆分離蛋白(Pea protein isolate,PPI)氨基酸組成平衡,且賴氨酸含量豐富[4],同時(shí)具有低致敏、非轉(zhuǎn)基因的特點(diǎn)[5],且有益于降低心腦血管等慢性疾病的發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[6]。因此近年來被作為優(yōu)質(zhì)的植物蛋白資源應(yīng)用于食品工業(yè)中,尤其是高濃度豌豆蛋白飲料和酸奶產(chǎn)品受到越來越多的關(guān)注。

與其它豆類蛋白相似,豌豆蛋白在飲料和酸奶體系中常作為乳化劑、起泡劑,其功能特性與pH、溫度、離子強(qiáng)度等環(huán)境因素和加工方式有關(guān)[7-8]。然而,酸性飲料和酸奶的pH一般在4.2左右,該pH正好接近豌豆蛋白的等電點(diǎn)(約為pH4.6)。因此豌豆蛋白在這類體系中應(yīng)用時(shí)溶解性和乳化性不佳[9],體系常通過多種機(jī)制發(fā)生失穩(wěn)[10],主要表現(xiàn)為脂肪上浮、蛋白絮凝沉淀等,嚴(yán)重影響了產(chǎn)品的食用品質(zhì)和貨架期[11]。

陰離子多糖常被添加到蛋白穩(wěn)定的酸性乳飲料中,提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。邱榮[12]研究表明陰離子多糖能夠附著在油滴包裹的蛋白質(zhì)表面,部分結(jié)構(gòu)深入兩相中,通過增強(qiáng)液滴間靜電排斥或空間位阻,提高乳液的穩(wěn)定性。然而,在一定條件下,少量的多糖則會(huì)導(dǎo)致蛋白乳液體系發(fā)生橋連絮凝作用,反而加速乳液失穩(wěn)[13]。羧甲基纖維素鈉(CMC)是 D-吡喃葡萄糖通過β-1,4-糖苷鍵鏈接而成的陰離子型線性高分子,由于價(jià)格低廉,應(yīng)用性能優(yōu)異,常作為酸性蛋白飲料的穩(wěn)定劑[14]。乳液體系的穩(wěn)定性與CMC濃度密切相關(guān)[15],CMC 濃度過低時(shí),蛋白結(jié)合部分CMC發(fā)生架橋絮凝而使體系失穩(wěn),當(dāng)CMC濃度適量時(shí),對酸性乳飲料的狀態(tài)具有改善作用。

本團(tuán)隊(duì)前期研究了PPI和CMC在水相溶液中的相互作用。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)CMC濃度為0.4%、體系pH為4.5條件下,CMC可以與PPI形成穩(wěn)定的靜電復(fù)合物(數(shù)據(jù)暫未發(fā)表)。然而,CMC與PPI在乳液體系中的相互作用及其對乳液穩(wěn)定性的影響尚不清楚?；诖?本研究擬從PPI與CMC在水相體系中的相互作用入手,研究二者所形成的靜電復(fù)合物物對乳液體系的影響。通過分析二者所形成的靜電復(fù)合物對乳液ζ-電位、粘度、粒徑、穩(wěn)定性及液滴聚集程度,以期了解CMC在高濃度PPI酸性乳液體系中的應(yīng)用特性,揭示CMC引起PPI乳液穩(wěn)定/失穩(wěn)的內(nèi)在機(jī)制,為豌豆蛋白在高蛋白植物基酸性乳品和飲料中的開發(fā)利用提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脫皮豌豆 淶水縣金谷糧油食品有限公司;羧甲基纖維素鈉 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分子量360 kDa,取代度DS 0.92;葵花籽油 多力葵花籽油;鹽酸、氫氧化鈉分析純 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司;磷酸鹽緩沖液、尼羅紅、尼羅藍(lán) 北京索萊寶生物科技有限公司。

F-4500型熒光分光光度計(jì) 日本日立公司;PB-10型pH計(jì) Satorius公司;TB-214型電子天平 美國Denver儀器公司;SC-15型數(shù)控超級恒溫槽 寧波新芝生物科技股份有限公司;LGJ-18S型凍干機(jī) 北京松源華興公司;DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 上海振捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;XHF-DY型高速分散器 寧波新芝生物科技股份有限公司;APV-2000型高壓均質(zhì)機(jī) 德國APV公司;MS3000型激光粒度分析儀 英國Malvern儀器公司;Zetasizer Nano ZS型ζ-電位分析儀 英國Malvern儀器公司;Physica MCR301型流變儀 奧地利Anton Paar有限公司;Turbiscan Lab? Expert apparatus穩(wěn)定性分析儀 法國Formulaction公司;880LSM T-PMT型Carl Zeiss蔡司激光共聚焦顯微鏡 德國Zeiss。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 豌豆分離蛋白的制備 參考Lan等[16]的方法并稍做修改。將脫皮豌豆研磨粉碎后,以質(zhì)量體積比為1∶15的比例分散在去離子水中,用1.0 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至9.5。在25 ℃,500 r/min攪拌速度下攪拌1 h后4500 r/min離心20 min。收集上清液后,用1.0 mol/L HCL調(diào)節(jié)pH至4.5,4000 r/min離心20 min,收集沉淀重新分散于去離子水中,調(diào)節(jié)pH至7.0。凍干72 h后取出,凍干物即為豌豆分離蛋白(PPI)。經(jīng)凱氏定氮法測得其蛋白含量為85.50%(N×6.25)。

1.2.2 不同CMC濃度的PPI-CMC混合溶液和乳液的制備 參考賈惜文等[17]的方法將PPI和CMC分別分散在10 mmol/L磷酸緩沖溶液(PBS)中,室溫下攪拌4 h后放置于4 ℃冰箱中過夜以確保完全水化,得到5%PPI和1%CMC母液。將PPI、CMC按照一定比例混合,添加去離子水,配制成PPI濃度為3%,CMC濃度分別為:0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%和0.5%的PPI-CMC混合溶液,充分?jǐn)嚢枞芙夂笕〔糠只旌先芤河肏Cl和NaOH緩慢調(diào)節(jié)pH,得到pH4.5的混合溶液。

取部分混合溶液添加葵花籽油,使葵花籽油濃度為3%。用高速分散器將混合液于10000 r/min下剪切1 min后,于常溫、400 Bar條件下高壓均質(zhì)兩次,制備成添加不同CMC濃度的PPI乳液。用HCl和NaOH緩慢調(diào)節(jié)pH,得到pH4.5的乳液,置于4 ℃條件下貯藏備用。

1.2.3 不同CMC濃度的PPI-CMC混合溶液蛋白溶解度及表面疏水性測定 測定混合溶液蛋白溶解度,參考Beck等[18]方法的基礎(chǔ)上做出細(xì)微修改。水相溶液12000 r/min離心20 min,為避免蛋白在離心過程中變性,離心溫度為4 ℃,去除沉淀取上清液。不同CMC濃度(0～0.5%)的混合溶液上清液分別稀釋10倍、10倍、10倍、20倍、30倍、40倍,用牛血清白蛋白檢測試劑盒(BCA)測定上清液中可溶性蛋白含量。溶解度計(jì)算方法如下:

采用F-2500熒光分光光度計(jì)測定水相溶液中蛋白表面疏水性(PSH),參考Reinkensmeier等[19]的方法稍作修改。測定前,混合溶液采用pH4.5的10 mmol/L的PBS稀釋150倍,注入比色皿中,25 ℃靜置平衡。連續(xù)滴入10滴濃度為8 mmol/L的熒光探針8-苯胺基-1-萘磺酸-鈉(ANS),每滴2 μL,滴入間隔時(shí)間2 min,靜置測其熒光強(qiáng)度。狹縫寬度是10.0 nm,激發(fā)波長為390 nm發(fā)射波長為470 nm。PSH反映了蛋白表面結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量和強(qiáng)度。表面疏水性計(jì)算公式如下:

式中:Fmax是ANS溶液的濃度,Kd是蛋白溶液最大熒光強(qiáng)度,L0是表觀結(jié)合解離常數(shù)。

1.2.4 ζ-電位測定 采用Zetasizer Nano-ZS90電位測定儀測定乳液液滴的ζ-電位,參考Liu等[20]的方法并稍作修改。測定前,樣品采用pH4.5的10 mmol/L的PBS稀釋5倍,測定溫度25 ℃。每個(gè)樣品重復(fù)測定3次,結(jié)果取平均值。

1.2.5 乳液粒徑分析 采用Mastersizer 2000粒度分布儀測定乳液液滴粒徑的大小,采用儀器配套軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用體積平均直徑(volume weighted average diameter)d43表征液滴粒度的大小。每個(gè)樣品重復(fù)測定3次,結(jié)果取平均值。參數(shù)設(shè)置為:分析模式:通用;進(jìn)樣器名:Hydro 2000MU(A);顆粒折射率:1.520;顆粒吸收率:0.10;分散劑:水;分散劑折射率:1.330;泵的轉(zhuǎn)速:2500 r/min;測定溫度:25 ℃。

1.2.6 乳液粘度的測定 根據(jù)Vélez-erazo等[21]的方法并稍做修改后,采用Physica MCR301流變儀測定乳液的粘度隨剪切速率的變化。測定選用不銹鋼平行板轉(zhuǎn)子(pp50Ti),設(shè)定間距為1 mm,測定溫度25 ℃,平衡時(shí)間3 min,剪切速率從0.1到100 s-1。加樣時(shí)吸取2.3 mL樣品在平板上,使其分布均勻并防止氣泡產(chǎn)生。每個(gè)樣品重復(fù)測定2次,結(jié)果取平均值。

1.2.7 乳液穩(wěn)定性分析 乳液穩(wěn)定性采用Turbiscan Lab穩(wěn)定性分析儀測定,乳液制備好后,立即取20 mL新制乳液加入圓柱形玻璃小瓶中,并置于穩(wěn)定性分析儀中,采用多次掃描模式進(jìn)行測量,測定溫度設(shè)為25 ℃,測定時(shí)長25 h,得到24條反射光強(qiáng)度(TS,BS,%)隨樣品高度變化的曲線。每隔1 h掃描一次,結(jié)果記錄為透射光、背散射光掃描圖和Turbiscan穩(wěn)定性指數(shù)(TSI),其中,TSI指數(shù)越小,乳液越穩(wěn)定[22]。

1.2.8 乳液的微觀結(jié)構(gòu)觀察 采用激光共聚焦顯微鏡觀測乳液的微觀結(jié)構(gòu),參考趙謀明等[13]的方法并略作修改。在1 mL樣品中加入40 μL混合染料(0.02% 尼羅紅和0.1% 尼羅藍(lán)),充分混合均勻。選用60×油鏡,在顯微鏡下初調(diào)焦,找到乳液液滴分散平面。選擇488 nm的Ar離子和633 nm的He/Ne 離子激光預(yù)掃描,采集熒光圖像。所有液滴熒光圖像按1024×1024像素,2×zoom進(jìn)行采集。然后用激光掃描共聚焦顯微鏡LAS AF Lite軟件進(jìn)行圖像分析與數(shù)據(jù)處理。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 CMC對PPI溶解度和表面疏水性的影響

由圖1可知,當(dāng)CMC濃度≤0.3%時(shí),3%PPI在pH4.5時(shí)溶解度僅為3.06%,PPI溶解度隨著多糖濃度的提高反而略有降低。這可能是因?yàn)樵诙嗵欠肿硬蛔銜r(shí),CMC分子與蛋白分子發(fā)生橋連絮凝作用有關(guān)[23]。同時(shí),在CMC濃度≤0.3%時(shí),蛋白的PSH也略有下降,表明多糖的存在可能對熒光探針與蛋白疏水結(jié)合位點(diǎn)有一定的屏蔽作用。Xu等[24]報(bào)道了由于直鏈淀粉與蛋白的疏水結(jié)合作用導(dǎo)致蛋白PSH降低。

圖1 CMC濃度對PPI溶解度性和表面疏水的影響(3% PPI,pH4.5,水相體系)Fig.1 Effects of CMC concentration on the solubilityand protein surface hydrophobicity(PSH)of PPI(3%)at pH4.5 in the aqueous solutions注:同一指標(biāo),字母不同表示差異顯著(P<0.05);圖2、圖3同。

CMC濃度≥0.4%時(shí),PPI在pH4.5下的溶解度和PSH均顯著(P<0.05)提高(當(dāng)CMC濃度>0.5%,由于其用量超出其在飲料體系中最大使用限量,故未做進(jìn)一步研究)。PPI溶解度的提高與體系形成PPI-CMC靜電復(fù)合物,PPI分子間的靜電排斥和/或空間位阻作用提高有關(guān)(未發(fā)表結(jié)果)。Moure等[25]的研究表明蛋白質(zhì)的溶解性取決于蛋白質(zhì)分子的親水性/疏水性的平衡,這種平衡取決于暴露于蛋白質(zhì)分子表面的氨基酸組成。PSH的提高也意味著PPI通過與CMC發(fā)生相互作用,使蛋白分子內(nèi)部更多的疏水性位點(diǎn)暴露出來，預(yù)示著經(jīng)CMC穩(wěn)定后PPI表面活性得到一定程度的改善。

2.2 CMC對PPI乳液ζ-電位的影響

由圖2可知,在pH4.5條件下,體系未添加CMC時(shí),單一的PPI穩(wěn)定的乳液ζ-電位絕對值較小,約為+6.72 mV,表明在PPI蛋白的等電點(diǎn)附近(～4.6),液滴表面由于蛋白的吸附,呈正電性。隨著CMC濃度逐漸的提高,界面吸附層上帶有正電荷的PPI與帶有負(fù)電荷的呈負(fù)電性的CMC分子量不斷增加,CMC分子吸附到PPI分子帶有正電荷的片段上,因此由PPI-CMC復(fù)合物所穩(wěn)定的蛋白乳液ζ-電位由正值轉(zhuǎn)變?yōu)樨?fù)值,且絕對值隨著CMC濃度的升高而明顯增加,表明乳液體系中油滴間的靜電排斥和空間位阻作用得到增強(qiáng)[15]。曾瑞琪等[26]報(bào)道了酸性條件下帶負(fù)電荷的高酯果膠吸附到帶正電荷的大豆蛋白表面,與本實(shí)驗(yàn)中ζ-電位變化結(jié)果相似。

圖2 CMC濃度對PPI乳液ζ-電位的影響(3% PPI,pH4.5)Fig.2 Effects of CMC concentration on theζ-potential of 3% PPI stabilized emulsions at pH4.5

2.3 CMC對PPI乳液平均粒徑的影響

由圖3可知,對于未添加CMC的乳液,其平均粒徑d43為38.5 μm(圖3)。當(dāng)CMC濃度≤0.2%時(shí),平均粒徑顯著升高(P<0.05)。尤其當(dāng)CMC濃度為0.2%時(shí),液滴粒徑增加到70.5 μm。根據(jù)pH4.5條件下CMC濃度對PPI乳液微觀結(jié)構(gòu)的影響(圖4)的研究結(jié)果可知,未添加CMC或CMC濃度≤0.3%的體系(圖4A～D),發(fā)生了嚴(yán)重的乳狀液滴絮凝。因此,低濃度CMC引起的液滴平均粒徑的增加主要是由于液滴的絮凝所致。這與較低濃度的CMC條件下,液滴表面吸附的蛋白多糖吸附層的絕對電荷量降低,靜電斥力無法克服液滴間的吸引力,從而引起液滴間橋連絮凝有關(guān)。當(dāng)CMC濃度≥0.4%時(shí),乳液平均粒徑隨著CMC濃度的增加而不斷減小,乳液絮凝得到明顯的抑制(圖4E～F)。當(dāng)CMC濃度增加到0.5%時(shí),乳液液滴粒徑可降低至11.2 μm。表明在此CMC濃度下形成的PPI-CMC靜電復(fù)合物可有效地穩(wěn)定乳狀液滴的界面層,液滴間的靜電排斥和空間位阻效應(yīng)增加有效抑制了液滴的絮凝[27]。

圖3 CMC濃度對PPI乳液粒徑的影響(3% PPI,pH4.5)Fig.3 Effects of CMC concentration on the particle size of3% PPI stabilized emulsions at pH4.5

圖4 CMC濃度對PPI乳液微觀結(jié)構(gòu)的影響(3% PPI,pH4.5)Fig.4 Effects of CMC concentration on themicrostructure of 3.0% PPI stabilized emulsions at pH4.5注:圖中A～F樣品CMC濃度依次為:0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%;紅色標(biāo)記為油脂,綠色標(biāo)記為蛋白。

2.4 CMC對PPI乳液粘度的影響

乳液連續(xù)相粘度是影響乳液穩(wěn)定性的重要因素。此外,多糖吸附到蛋白穩(wěn)定的水油界面上,形成粘彈性凝膠界面結(jié)構(gòu),也會(huì)影響蛋白乳液的穩(wěn)定性[28]。由圖5可知,在pH4.5條件下,PPI乳液粘度較高,這可能與體系發(fā)生嚴(yán)重的絮凝有關(guān)。隨著CMC濃度增加,體系的粘度首先呈現(xiàn)增加的趨勢,當(dāng)體系CMC濃度為0.3%時(shí),粘度達(dá)到最大值,這可能與多糖誘發(fā)的液滴間架橋絮凝造成乳液絮凝程度的增加有關(guān)[12]。當(dāng)CMC濃度達(dá)到0.4%時(shí),體系的粘度顯著下降(P<0.05),繼續(xù)提高CMC濃度,粘度有一定程度的提高,但仍顯著低于CMC濃度≤0.3%的體系(P<0.05)。添加0.5% CMC引起了體系粘度的增加,可能表明在此濃度下,界面相或連續(xù)相中存在的PPI所吸附的CMC均達(dá)到飽和,因此未被PPI吸附的CMC以游離態(tài)的形式存在于乳液的分散相中,引起體相粘度的升高有關(guān)[29]。這與CMC濃度≤0.3%時(shí)體系粘度增加的機(jī)理存在本質(zhì)不同,由此可得CMC的增稠作用對乳液穩(wěn)定的影響不顯著。

圖5 CMC濃度對PPI乳液粘度的影響(3% PPI,pH4.5)Fig.5 Effects of CMC concentration on the viscosity of3% PPI stabilized emulsions at pH4.5

2.5 CMC對PPI乳液穩(wěn)定性的影響

以樣品池的高度為橫坐標(biāo),以透射光和背散射光光強(qiáng)值變化值為縱坐標(biāo)表征其隨時(shí)間變化,結(jié)果見圖6?？梢?對于單一PPI制備的乳液(圖6A),樣品在放置1 h左右,樣品底部有澄清層出現(xiàn)(透射光強(qiáng)度增加)。隨著放置時(shí)間的增加,樣品頂部產(chǎn)生了澄清層(背散射光強(qiáng)度隨減小)而樣品池底部出現(xiàn)了沉淀層,體系非常不穩(wěn)定。當(dāng)CMC濃度≤0.3%(圖6B～D),體系的穩(wěn)定性未得到改善。隨著CMC濃度的增加到0.4%以上(圖6E～F),樣品的穩(wěn)定性顯著提高,由于乳液失穩(wěn)產(chǎn)生的蛋白沉淀、液滴絮凝、析水現(xiàn)象得到顯著抑制。

圖6 CMC濃度對PPI透射光和背射光強(qiáng)度的影響(3% PPI,pH4.5)Fig.6 Effects of CMC concentration on the transmission andbacklight intensity of 3% PPI stabilized emulsions at pH4.5 注:圖中A～F樣品CMC濃度為:0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%。

TSI指數(shù)是監(jiān)測乳液動(dòng)態(tài)穩(wěn)定性的有效指標(biāo),TSI指數(shù)越小,乳液越穩(wěn)定[30]。圖6中乳液穩(wěn)定性的變化也可以通過圖7中TSI指數(shù)的變化來定量分析。由圖7可知,在pH4.5條件下,PPI乳液體系TSI指數(shù)較高,放置時(shí)間較長時(shí),體系發(fā)生嚴(yán)重的失穩(wěn)現(xiàn)象。在一定儲(chǔ)存時(shí)間內(nèi),CMC濃度≤0.3%的PPI乳液發(fā)生嚴(yán)重的絮凝和聚結(jié),體系的TSI指數(shù)增加,乳液穩(wěn)定性下降,但放置較長時(shí)間時(shí),CMC對體系的穩(wěn)定性仍產(chǎn)生積極貢獻(xiàn)。當(dāng)CMC濃度≥0.4%時(shí),TSI指數(shù)明顯減小,表明由PPI-CMC穩(wěn)定的蛋白乳液由于液滴間靜電排斥、空間位阻相應(yīng)的增強(qiáng),乳液穩(wěn)定性明顯改善,液滴絮凝、析水現(xiàn)象得到抑制。這與Zhao等[31]的研究結(jié)果類似,當(dāng)乳鐵蛋白乳液中添加0.05%～0.15%大豆多糖或甜菜果膠時(shí),乳液發(fā)生橋連絮凝,濃度超過0.35%時(shí),乳液具有良好的穩(wěn)定性。

圖7 CMC濃度對乳液TSI指數(shù)的影響(3% PPI,pH4.5)Fig.7 Effects of CMC concentration on the TSI of3% PPI stabilized emulsions at pH4.5

3 結(jié)論

在pH4.5、CMC濃度≥0.4%條件下,帶負(fù)電性的CMC分子與呈正電性的PPI通過靜電吸附作用形成的復(fù)合物有效改善了PPI在等電點(diǎn)附件的變性沉淀,明顯提高3% PPI溶液在酸性條件下的溶解性。經(jīng)CMC穩(wěn)定的PPI分子,其蛋白內(nèi)部結(jié)構(gòu)中的部分被埋藏的疏水位點(diǎn)暴露出來,表面疏水性得到提高。對于PPI-CMC靜電復(fù)合物穩(wěn)定的乳液體系(3% PPI,3% 油相),當(dāng)CMC濃度不足時(shí)(≤0.3%),多糖引起的橋連絮凝效應(yīng)導(dǎo)致乳液體系中的液滴發(fā)生嚴(yán)重的絮凝現(xiàn)象,乳液粒徑明顯增加,體系失穩(wěn)嚴(yán)重。而當(dāng)CMC濃度≥0.4%,PPI-CMC形成的復(fù)合界面層,有效提高了液滴表面的ζ-電位,液滴間靜電排斥和空間位阻效應(yīng)的增加,有效地抑制了液滴間引力作用,從而抑制了液滴的絮凝,PPI乳液的穩(wěn)定性顯著改善,液滴粒徑降低。

本研究表明PPI-CMC靜電復(fù)合物對3%PPI乳液體系的穩(wěn)定作用與CMC的濃度密切相關(guān)。考慮到實(shí)際食品體系中組分和加工工藝的影響,今后的研究需要關(guān)注體系共存組分(如離子、糖、蛋白、油脂的種類和濃度等)以及加工工藝(均質(zhì)、殺菌條件等)等因素對PPI-CMC乳液體系的影響,從而為豌豆蛋白基酸性乳品和飲料的開發(fā)利用提供更為豐富的理論依據(jù)和指導(dǎo)。